起催化作用的抗因子Ⅷ同种抗体制作方法

斯里尼瓦斯·凯维利, 塞巴斯蒂安·拉克鲁瓦－得斯马塞斯, 米夏尔·卡扎切基尼

2002年7月31日

2000年7月18日

1999年7月21日

国家医疗保健研究所, 拜尔药品有限公司

A61P7/04GK1361865SQ00810633

催化作用 同种 抗体 因子

1.一种测定能够降解哺乳动物中因子VIII的抗因子VIII同种抗体存在的方法，其特征在于该方法包括i)从所述哺乳动物中取得的血样分离出血浆；ii)从所述血浆中分离出抗因子VIII同种抗体；iii)放置所述抗因子VIII同种抗体，使之与因子VIII接触一段时间，该时间足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同种抗体任意降解；以及iV)在所述的一段时间后，测定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同种抗体有效地降解2.如权利要求1的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过与所述因子VIII结合而从所述血浆中分离出来，所述因子VIII优选与一种基质偶合3.如权利要求1或2的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过亲和色谱法分离4.如权利要求3的方法，其特征在于在步骤ii)中，所述亲合色谱法包括使用与琼脂糖凝胶基质共价键合的因子VIII，优选用溴化氰活化5.如权利要求1-4任何一项的方法，其特征在于在步骤iii)中，所述因子VIII用一种标记试剂标记，优选用放射性标记试剂，具体来说例如125I6.如权利要求1-5任何一项的方法，其特征在于在步骤iii)中，在约15℃到约40℃，优选为38℃的温度下，所述因子VIII与抗因子VIII同种抗体接触放置的时间在约0.5到约30小时之间，优选约10小时7.如权利要求1-6任何一项的方法，其特征在于步骤iV)是通过包括分离技术的测定方法来完成的，例如凝胶电泳，具体来说例如SDSPAGE，或凝胶过滤，具体来说例如快速蛋白质液相色谱凝胶过滤，和造影术，具体来说例如放射自显影术8.如权利要求1-7任何一项的方法，其特征在于其进一步包括V)使所述因子VIII分子被所述抗因子VIII同种抗体裂解的一个(多个)部位特征化9.如权利要求8的方法，其特征在于所述的特征化是通过将所述因子VIII与能够降解因子VIII的抗因子VIII同种抗体接触放置，然后分离，并对由此得到因子VIII片段测序来完成的10.如权利要求8或9的方法，其特征在于所述分离是用例如凝胶电泳，具体而言例如SDS PAGE的技术来完成的11.如权利要求8-10任何一项的方法，其特征在于所述测序方法是用例如N末端测序，具体而言如用自动蛋白质微层序的技术来完成的12.如权利要求8-11任何一项的方法，其特征在于所述测序位于以下易裂开的价键处Arg372-Ser373，位于因子VIII分子A1和A2结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端上，Glu1794-Asp1795位于因子VIII分子的A3结构域之内13.一种氨基酸序列Ser Val Ala Lys Lys His Pro14.一种氨基酸序列Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser15.一种氨基酸序列Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu16.一种如权利要求13-15任何一项的氨基酸序列的肽或非肽类似物，其特征在于其能抑制因子VIII分子中任何容易被抗因子VIII同种抗体水解的部位17.一种抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂18.如权利要求17的抑制剂，其特征在于其包括蛋白酶抑制剂，具体来说如4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物)氢氯化物19.如权利要求17或18的抑制剂，其特征在于所述抑制剂抑制如下易裂开的价键的裂解Arg372-Ser373，位于因子VIII分子Al结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子A3结构域的N末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域之内20.如权利要求17-19任何一项的抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽类似物Ser Val Ala Lys Lys His Pro21.如权利要求17-19任何一项的抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽类似物Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser22.如权利要求17-19任何一项的抑制剂，其特征在于其包括如下氨基酸序列的肽或非肽类似物Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu23.一种药物组合物，其特征在于其包括特别是从权利要求1-6任何一项的方法得到的、药用有效量的能够降解因子VIII的一种抗因子VIII同种抗体24.能降解因子VIII的抗因子VIII同种抗体的用途，用于制备一种治疗由于血液中因子VIII的量不正常而导致的疾病的哺乳动物的药物组合物25.如权利要求24的用途，其特征在于所述疾病是由于血液中存在过量的因子VIII造成的26.一种药物组合物，其特征在于其包括如权利要求17-22任何一项的药用有效量的因子VIII降解抑制剂27.因子VIII降解抑制剂的用途，用于制备一种尤其用于治疗受到血液中因子VIII的负生理级别导致的疾病的哺乳动物的药物组合物

本发明涉及一种测定能降解哺乳动物中因子VIII的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的存在的方法，以及由所述起催化作用的抗因子VIII同种抗体使所述因子VIII分子中裂解部位特征化的方法本发明还涉及一种被抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂本发明进一步涉及一种药物组合物，其中包含所述的能降解因子VIII并来源于所述测定方法的起催化作用的抗因子VIII同种抗体，还涉及一种药物组合物，其中包含被所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂最后，本发明涉及以下这些物质在治疗上的应用，即所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂，包含所述能降解因子VIII以及起源于所述测定方法的起催化作用的抗因子VIII同种抗体的药物组合物，以及包含所述抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的药物组合物给具有严重血友病A的病人注入同源的因子VIII导致25％的病案出现抗因子VIII同种抗体(Ehrenforth，S.，Kreuz，W.，Scharrer，I.，Linde，R.，Funk，M.，Güng?r，T.，Krackhardt，B.和Komhuber，B.，《Incidence of development of factor VIII and factor IX inhibitors inhaemophiliacs》，Lancet，1992，339594-598)，该同种抗体通过因子VIII与稳定化分子(Saenko，E.L.，Shima，M.，Rajalakshmi，K.J.和Scandella，D.，《Arole for the C2 domain of factor VIII in bindingto von Willebrand factor》，J.Biol.Chem.，1994，26911601-11605；和Saenko，E.L.，Shima，M.，Gilbert，G.E.，和Scandella，D.，《Slowed release of thrombin-cleaved factor VIII from von Willebrandfactor by a monoclonal and a human antibody is a novel mechanismfor factor VIII inhibition》，J.Biol.Chem.，1996，27127424--27431)，或与对其活性来说必要的分子(Arai，M.，Scandella，D.，和Hoyer，L.W.，《Molecular basis of factor VIII inhibition by humanantibodiesAntibodies that bind to the factor VIII light chainprevent the interaction of factor VIII with phospholipid》，J.Clin.Invest.，1989，831978-1984；和Zhong，D.，Saenko，E.L.，Shima，M.，Felch，M.和Scandella，D.，《Some human inhibitor antibodiesinterfere with factor VIII binding to Factor IX》.，Blood，1998，92136-142)，或与活化分子(Lubahn，B.C.，Ware，J.，Stafford，D.W.，和Reiser，H.M.，《IdentificatIon of a FVIII epitope recognized bya human hemophilic inhibitor》，Blood，1989，73497-499；和Neuenschwander，P.F.，and Jesty，J.，《Thrombin-activated andfactor Xa-activated human factor VIIIdifferences in cofactoractivity and decay rate》，Arc.Biochem.Biophys.，1992，296426-434)的相互作用的空间位阻来抑制因子VIII的促凝血活性申请人发现的起催化作用的抗因子VIII同种抗体是就他所知在治疗带有因子VIII的病人时出现被诱导的催化抗体的第一次报告迄今为止仍认为在因子VIII存在下形成抗体是令人非常惊讶的，甚至是荒谬或难以置信的，因为实际上这将通过催化水解使因子VIII分子失去活性(《蛋白质水解(proteolysis)》)但是至今已报道的在疾病过程中或在生理条件下发现的催化抗体都是自身抗体因此，被诱发的抗体称作同种抗体(ALLO-antibodies)，其起源与任何自身免疫疾病中的自身抗体(AUTO-antibodies)的起源明显不同对于一个病人的抗因子VIII抗体的反应来说，算术平均值Km和表观Vmax分别是9.46±5.62μM和85±60fmol.min-1因子VIII水解动力参数表明在活体内因子VIII钝化作用中催化免疫应答的功能性作用由此抗因子VIII同种抗体作为位点特异蛋白酶的特性给具有抗因子VIII同种抗体的病人提供了新的疾病治疗方法因此依据本发明第一方面，本发明提供了一种测定能够降解哺乳动物中因子VIII的、起催化作用的抗因子VIII同种抗体是否存在的方法，其特征在于该方法包括i)从所述哺乳动物中取得的血样分离出血浆；ii)从所述血浆中分离出抗因子VIII同种抗体；iii)放置所述抗因子VIII同种抗体，使之与因子VIII接触一段时间，该时间足以使所述因子VIII被所述抗因子VIII同种抗体任意降解；以及iv)在所述的一段时间后，测定所述因子VIII是否被所述的抗因子VIII同种抗体有效地降解依据本发明方法步骤ii)的实施方式，所述抗因子VIII同种抗体通过与所述因子VIII组合而从所述血浆中分离出来，所述因子VIII优选与一种基质偶合有利的是，在步骤ii)中，所述抗因子VIII同种抗体通过亲合色谱法分离出来优选地在步骤ii)中，所述亲合色谱法包括使用琼脂糖凝胶(Sepharose)基质，优选用溴化氰活化依据本发明方法步骤iii)的实施方式，所述因子VIII用一种标记试剂所标记，优选用放射性标记试剂，具体来说如125I有利的是在步骤iii)中，在约15℃到约40℃，优选为38℃的温度下，所述因子VIII与所述抗因子VIII同种抗体接触放置的时间在约0.5到约30小时之间，优选约10小时依据本发明方法步骤iV)的实施方式，测定所述因子VIII是否被所述抗因子VIII同种抗体有效地降解的方法是通过包括分离技术的测定方法来完成的，例如凝胶电泳，具体来说例如SDS PAGE，或凝胶过滤，具体来说例如快速蛋白质液相色谱凝胶过滤，以及造影术，具体来说例如放射自显影术依据本发明方法进一步的实施方式，所述方法的特征在于其进一步包括V)使被所述抗因子VIII同种抗体裂解的所述因子VIII分子中一个(多个)部位特征化依据本发明方法的步骤V)的实施方式，所述的特征化是通过将所述因子VIII与能够降解因子VIII的所述抗因子VIII同种抗体接触放置，分离，然后对由此得到因子VIII片段测序来完成的有利的是所述分离是用例如凝胶电泳，具体而言如SDS PAGE，或凝胶过滤的技术来实施的所述测序方法有利地是用例如N-终端测序，具体而言如用自动蛋白质微层序的技术来实施的通过使用这种测序，将以下易裂开的价键定位Arg372-Ser373，定位于因子VIII分子A1和A2结构域(domain)之间，Tyr1680-Asp1681，定位于因子VIII分子A3结构域的N-终端上，Glu1794-Asp1795，定位在因子VIII分子的A3结构域内依据本发明的第二方面，本发明提供了一种氨基酸序列Ser Val Ala Lys Lys His Pro；一种氨基酸序列Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；和一种氨基酸序列Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu本发明还扩展到因子VIII的这种或任何其它序列的变异体(variant)或类似物(analogue)，这些序列能够抑制因子VIII分子中任意容易被抗因子VIII同种抗体水解的位点在本发明的上下文中，这种变异体可以是以上所述的如一种氨基酸序列的肽或非肽类似物，该氨基酸序列抑制因子VIII分子中任何容易被抗因子VIII同种抗体水解的位点这种变异体可以是例如在N-端，C-端或两端短几个氨基酸或者长几个氨基酸的该序列的变异体(通过化学合成或通过酶解天然分子可能得到这种变异体)，只要该变异体抑制因子VIII分子中任何易被抗因子VIII同种抗体水解的位点因此，依据本发明的第三方面，本发明提供了一种被抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂有利的是，这种抑制剂的特征在于其包括蛋白酶抑制剂这种在本发明范围内的能用作抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂的蛋白酶抑制剂的例子是，但不限于，氟代磷酸酯型抑制剂，例如DFP，或磺酰氟化物型抑制剂，例如PMSF或AEBSF(4-(2-氨基乙基)苯基磺酰氟化物)氢氯化物(Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，德国的著名商标，商标名称是Pefabloc?)更具体而言，这种抑制剂的特征在于所述抑制剂抑制易断裂价键的裂解Arg372-Ser373，位于因子VIII分子的A1结构域之间，Tyr1680-Asp1681，位于因子VIII分子的A3结构域的N-末端，和Glu1794-Asp1795，位于因子VIII分子的A3结构域内更优选的是，该抑制剂的特征在于其包括一种氨基酸序列的肽或非肽类似物Ser Val Ala Lys Lys His Pro；一种氨基酸序列的肽或非肽类似物Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser；或一种氨基酸序列的肽或非肽类似物Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu如上所述的因子VIII降解抑制剂，以及其加成盐，尤其是其药用可接受的加成盐，具有非常有价值的药理学性质(pharmaceutical profile)，因为这些物质对抗因子VIII同种抗体具有中和活性这些性能证明了它们在治疗上的应用，且本发明通过药剂的方式进一步涉及因子VIII降解抑制剂，及其加成盐，尤其是它们的在药理学上可接受的加成盐因此，尤其是在血友病性质的疾病，更具体地说涉及由于因子VIII缺乏造成的凝血缺陷的疾病的治疗中将具体指明这些物质可以提及到的这些物质的应用的例子是具有如轻微或严重血友病A的高响应病人的治疗，例如，一方面(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)，和/或另一方面，遭受例如自身免疫疾病的病人(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)因此，根据本发明的第四主要方面，本发明通过一种药物组合物解决一种长期需要，其特征在于该药物组合物包含如上所述的，特别是可以从以上所述的方法得到的，药用有效量的、能够降解因子VIII的至少一种抗因子VIII同种抗体，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其加成盐此外，依据本发明的第五主要方面，本发明提供一种药物组成物，其特征在于其包含如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其加成盐这些组合物可通过如口腔、直肠、肠胃外、透皮肤的、眼的、鼻的、耳的途径用药这些组合物可以是固态或液态的，可以存在于人类药品通常使用的药用形式中，例如，简单或涂布的片剂、胶囊、颗粒、栓剂、注射制剂、透皮体系、滴眼药、气雾剂、喷雾剂和滴耳剂这些药剂用传统方法制备其活性主要成分，包括由如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂或者一种药用可接受的其加成盐组成，可以将其与药用组合物中通常使用的赋形剂掺杂在一起，例如滑石，阿拉伯胶，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，聚维酮，纤维素衍生物，可可脂，半合成的甘油酯，水性或非水性媒介物，从动物或植物得到的脂肪，乙二醇，各种湿润剂，分散剂或乳化剂，硅酮胶，某些聚合物或共聚物，防腐剂，香料和颜料优选的药剂形式是注射剂形式本发明还包括了一种具有中和活性的药物组合物，该组合物可用作尤其是如产生抗因子VIII同种抗体的血友病A疾病的有利疗法；尤其是带有抗因子VIII同种抗体的自身免疫疾病(当在这些病人中发现催化抗体的情况下)，所述组合物的特征在于其包含如上所述的，药用有效量的至少一种因子VIII降解抑制剂，或者至少一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其药用可接受的加成盐本发明还包括一种治疗哺乳动物的治病方法，该哺乳动物遭受由其血液中因子VIII水平导致的病状，该治病方法的特征在于将药用有效量的至少一种如上所述的因子VIII降解抑制剂，或者一种其药用可接受的加成盐给所述的哺乳动物用药这种方法特别提供了一种治疗血友病特性，尤其是在血液中缺乏因子VIII造成的疾病的有利疗法本发明还包括一种具有抗血栓活性的药物组合物，其尤其可作为治疗如血栓症疾病的有利疗法，所述组合物的特征在于其包括特别是可以从以上所述的方法得到的，药用有效量的能够降解因子VIII的至少一种抗因子VIII同种抗体，或者一种加入到药用可接受的赋形剂、媒介物或载体中的其药用可接受的加成盐本发明还包括一种哺乳动物的治疗方法，其特征在于将治疗有效量的至少一种如上所述的抗因子VIII同种抗体，或者一种其药用可接受的加成盐给所述的哺乳动物用药这种方法特别提供了一种治疗血栓特性，尤其是在血液中存在过量因子VIII造成的所述病理的有利疗法在人类和动物的疗法中，如上所述的抗因子VIII同种抗体或因子VIII降解抑制剂可以任何形式，特别是胶囊或片剂的口服形式，或肠胃外使用的注射液形式，就其本身给药，或与病理生理可接受的赋形剂一起给药可以想到其它的给药形式，如栓剂，软膏，膏状物，凝胶体或气溶胶制剂在本发明的内容中，使用以下术语《起催化作用的抗因子VIII同种抗体》的意义应当理解为这样的抗体该抗体通过因子VIII治疗制剂的输血过程被导向因子VIII，在血友病A病人中引发并赋予因子VIII催化活性；《因子VIII》的意义应当理解为在凝血过程中在因子X酶切中的因子IX的一种辅酶；《因子VIII的降解》的意义应当理解为从因子VIII产生的片段，其出现不是由于自发水解，或由生理性裂解酶，即凝血酶、活化因子IX、活化因子X和活化蛋白质C造成的水解《抗因子VIII同种抗体催化的因子VIII降解抑制剂》的意义应当理解为属于或不属于因子VIII序列的任何肽，或能特异地中和抗因子VIII催化抗体的水解活性的蛋白酶抑制剂优选实施方式的描述人类重组因子VIII被125I放射性标记从琼脂糖凝胶基质(Sepharosematrix)上带有抑制剂的三位血友病人的血浆中将抗因子VIII同种抗体亲和纯化，且琼脂糖凝胶基质已被免疫纯化的人类因子VIII偶联亲和纯化的病人Bor，Che和Wal的抗因子VIII抗体抑制因子VIII促凝血活性的数值分另达到IgG 57.0，64.0和4 3.0 BU/mg在三人中有两个病人出现以下情况被标记的因子VIII与抗因子VIII同种抗体共孵育导致分子蛋白水解证实了IgG同型的抗因子VIII同种抗体的抗体结合部位上的水解特异性在蛋白酶抑制剂-抑肽酶(0.15μM)，E-64(28μM)，EDTA(1.3μM)，亮肽素(10μM)和胃酶抑素(10μM)存在下，病人Bor和Wal的[125I]-因子VIII与亲和纯化的抗因子VIII IgG的共孵育不会导致蛋白水解活性的抑制申请人已经使因子VIII分子中催化IgG的主要裂解部位特征化，如下所示Arg372-Ser373，位于因子VIII的A1和A2结构域；Tyr1680-Asp1681，位于A3结构域的N-端；Glu1794-Asp1795，位于A3结构域内已证实了因子VIII水解对抗因子VIII同种抗体的时间和剂量的依赖性具体而言，在抗因子VIII IgG和因子VIII共孵育的摩尔比比预计存在于病人血浆中的摩尔比低80到9500倍的条件下观察到水解，表明水解是因子VIII被病人体内的同种抗体钝化的机理申请人进一步研究了抗体介导的因子VIII的水解动力学，在固定浓度的[125I]-因子VIII的存在下，使增加浓度的未标记的因子VIII与病人Wal的抗因子VIII IgG一起孵育将速度倒数作为基质浓度倒数的函数所画的曲线是线性的(r＝0.99)，表明该反应符合简单的Michaelis-Menten动力学，正如已在多克隆催化自身抗体中观察到的该表观催化效率，Vmax和抗因子VIII同种抗体的水解速率是以病人Wal的情况计算出来的在体内计算出的水解动力参数表明蛋白水解是病人体内同种抗体造成因子VIII钝化的机理将因子VIII与von Willebrand因子(vWF)相连对于因子VIII来说增加了凝血酶的催化速率，在此其保护因子VIII不被活化的蛋白质C(APC)水解当用类似于普通血浆中存在的重量/重量比，即30μg/ml vWF对300 ng/ml因子VIII混合纯化了的vWF和因子VIII时，将vWF加入到因子VIII中，将导致抗因子VIII IgG对因子VIII水解的部分抑制，即36.9％抗因子VIII同种抗体作为催化抗体的证实扩展了催化免疫应答的范围，除了先前报道的在哮喘病人中作用于血管的肠内肽(VIP)的水解抗体，还有SLE病人中的DNA水解抗体，以及自身免疫甲状腺炎病人中的对甲状腺球蛋白有特异性的催化抗体这也是申请人就其所知人体内对蛋白质抗原的外部给药应答，诱导催化抗体的第一次报道因子VIII被抗因子VIII IgG水解的显示催化特性的动力学参数，以及在血浆中的这些抗体的估计量表明在体内使因子VIII钝化的催化免疫应答的功能作用对功能特性互相不同的抗因子VIII同种抗体多克隆混合物中，催化抗体能抑制因子VIII的促凝血活性，且抑制速度比非催化的抗因子VIII抗体的速度快因此证实作为分解蛋白的抗因子VIII抗体的目标的肽抗原决定部位对于我们理解因子VIII抑制剂响应的病理生理学来说是至关重要的此外，因子VIII抑制剂作为位点特异蛋白酶的特性将给具有抗因子VIII同种抗体的病人提供新的治疗方法