专利名称：因子的制作方法例如在神经损伤例如脊髓损伤的情况下，理想的是引起神经突发育，例如神经突向外生长和/或神经突再生。已知神经生长因子(NGF)刺激某些事件，例如神经突向外生长。然而，NGF是一种相应高分子量的相对大的分子。此外，NGF对蛋白酶介导的降解敏感。由于这些考虑和其它考虑，NGF难以给药。NGF的制备也相对昂贵。这些是现有技术相关的问题。发明概述我们已经意外地发现，通过应用视黄酸受体β2(RARβ2)和/或其激动剂引起神经突发育(例如神经突向外生长和/或神经突再生)是有可能的。本发明的概述方面本发明基于这样一个意外发现通过应用RARβ2和/或其激动剂引起神经突发育(例如神经突向外生长和/或神经突再生)是有可能的。本发明的多个方面利用这一发现。例如，有可能有通过应用本文所解释的RARβ2和/或其激动剂引起神经突发育(例如神经突向外生长和/或神经突再生)调节的方法。本发明的详述方面一方面，本发明涉及RARβ2和/或其激动剂在引起神经突发育的药物制备方面的应用。在本发明中，RARβ2和/或激动剂可以被称作药学活性剂。神经突是众所周知的由各种神经元细胞类型发育的结构。它们以微观分支或梳样结构或从它们所发源的细胞表面上的形态学突出。神经突向外生长的实例示于附图中以及例如在(Maden 1998-综述文章)中引用的出版物中，并且是本领域众所周知的。RARβ2编码序列(即RARβ2基因)如下文所述使用。通过应用重组DNA技术和/或合成技术，可以制备RARβ2基因。例如，采用如该文件实施例一节中所述采用本文详述的引物等制备的PCR扩增的基因片段，可以制备RARβ2基因，或可以按照本领域已知的任何其它合适的方法制备RARβ2基因。另一方面，本发明涉及RARβ2和/或其激动剂在引起神经突发育的药物制备方面的应用，其中所述激动剂是视黄酸(RA)和/或CD2019。
视黄酸是市售的。CD2019是一种多环杂carbyl分子，它是一种RARβ2激动剂，具有本文所讨论的并且如(Elmazar等，(1996)Teratology第53卷第158-167页)中所示的结构。
另一方面，本发明涉及RARβ2和/或其激动剂在神经性病症治疗药物制备方面的应用。
另一方面，本发明涉及RARβ2和/或其激动剂在神经性病症治疗药物制备方面的应用，其中所述神经性病症包括神经损伤。
另一方面，本发明涉及一种治疗神经性病症的方法，包括给予药理学有效量的RARβ2受体和/或其激动剂。
另一方面，本发明涉及一种治疗神经性病症的方法，包括给予药理学有效量的RARβ2受体和/或其激动剂，其中所述激动剂是RA和/或CD2019。
另一方面，本发明涉及一种治疗神经性病症的方法，包括给予药理学有效量的RARβ2受体和/或其激动剂，其中通过包括RARβ2表达系统的一个实体给予所述RARβ2受体。
另一方面，本发明涉及一种在受治疗者中引起神经突发育的方法，所述方法包括提供能够指导RARβ2受体的至少一部分表达的核酸构建体，将所述构建体导入所述受治疗者的一种或更多种细胞中，并且任选地给予所述受治疗者一种RARβ2激动剂，例如RA和/或CD2019。
再一方面，本发明涉及一种用于确定一种药物是否能够调节RARβ2信号的测定方法，所述方法包括提供神经细胞，使所述细胞与所述药物接触，并且评价所述RARβ2受体的活性，例如通过检测神经突向外生长来评价。
用于本发明测定方法的神经细胞可以是任何合适的神经细胞系，无论其稳定保持在培养物中，还是直接得自动物的原代细胞。最好所述细胞是如下文所述制备的小鼠胚胎背根神经节(DRG)细胞。
再一方面，本发明涉及一种包括以下步骤的方法(i)进行上述对于RARβ2信号调节的测定，(ii)鉴定能够调节所述RARβ2信号的一种或更多种药物，以及(iii)制备一定量的那些一种或更多种鉴定的药物。
再一方面，本发明涉及一种包括以下步骤的方法(i)进行上述对于RARβ2信号调节的测定，(ii)鉴定能够调节所述RARβ2信号的一种或更多种药物，(iii)制备一定量的那些一种或更多种鉴定的药物，以及(iv)制备包含那些一种或更多种所鉴定药物的药用组合物。
再一方面，本发明涉及一种用药物影响RARβ2体内活性的方法，其中所述药物能够调节RARβ2信号，例如在如上所述的体外测定方法中能够调节RARβ2信号。
再一方面，本发明涉及一种药物在治疗神经性病症或神经损伤的药用组合物制备方面的应用，其中所述药物能够调节RARβ2信号，例如在如上所述的体外测定方法中能够调节RARβ2信号。
再一方面，本发明涉及用一种药物治疗受治疗者的方法，其中所述药物能够调节RARβ2信号，例如在如上所述的体外测定方法中能够调节RARβ2信号。
再一方面，本发明涉及一种药用组合物，其包含与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂混合的RARβ2和/或其激动剂；其中所述药用组合物用于引起神经突发育。
为了便于查阅，现在在合适的小节标题下讨论本发明的这些方面和其它方面。然而，在每一小节下的内容不一定限于每个特定小节。优选方面在一个优选方面，能够将RARβ2的表达定向的核酸构建体的给予将伴随着RARβ2激动剂例如RA、或最好是CD2019(或其模拟物)的给予。
最好是所述激动剂在一定程度下对于RARβ2受体是选择性的。所述激动剂最好不显著影响RARα受体。优选所述激动剂将不显著影响RARr受体。更优选所述激动剂将不显著影响RARα受体或RARγ受体。甚至更优选所述激动剂表现出对RARβ2受体的高度选择性。
在一个优选方面，能够将RARβ2表达定向的核酸构建体的给予将采用一种载体、优选用一种病毒载体、更优选用一种反转录病毒载体来完成。在一个高度优选的实施方案中，能够将RARβ2表达定向的核酸构建体的给予采用能够感染非分裂哺乳动物细胞(例如神经细胞)的反转录病毒载体来完成。优势本发明具有优势，因为RARβ2和/或其激动剂可以引起对神经细胞发育的调节。
本发明的另一个优势是避免将NGF给予受治疗者。
本发明的另一优势是能够在成体神经组织中促进神经突向外生长。类维生素A(retinoids)类维生素A是一类由维生素A衍生的分子的家族，包括生物活性代谢物视黄酸(RA)。RA的细胞效应通过两类受体的作用来介导，一类是视黄酸受体(RAR)，它们由全反式-RA(tRA)和9-顺式-RA(9-cis-RA)两者激活，另一类是类维生素AX受体(RXR)，它们仅由9-cis-RA激活(Kastner等，1994；Kleiwer等，1994)。所述受体具有3个主要亚型-α、β和γ，其中由于可变剪接和差别启动子用法而有多种同种型(Leid等)。RAR通过与RXR形成异二聚体而介导基因表达，而RXR可以作为同二聚体或通过与多种孤独受体形成异二聚体而介导基因表达(Mangelsdorf和Evans，1995)。对多种胚胎神经元类型的许多研究已经表明，RA既可以刺激神经突的数目，又可以刺激神经突的长度(综述，Maden，1998)，实际上神经营养蛋白也是如此(Campenot，1977；Lindsay，1988；Tuttle和Mathew，1995)。神经营养蛋白是一个生长因子家族，它们是发育中的外周神经系统中多种初级(primary)感觉神经元的神经元存活所需要的(Snider，1994)。在PC12细胞中由NGF诱导的最早期基因之一是孤独受体NGFI-B(NURR1)(Millbrandt，1989)。这提示该生长因子和类维生素A在发育中的神经元中介导的途径可以相互作用。
这些方面的背景内容已经由Victor A.McKusick等在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim上提出。已经从该资源中提取了以下信息。
三种视黄酸受体-α、β和γ是核受体超家族成员。视黄酸是在脊椎动物中描述的第一种形态发生素。RARA和RARB基因与分别位于第17号染色体和第3号染色体上的2种密切相关的甲状腺激素受体THRA和THRB基因的同源性比与核受体家族的任何其它成员的同源性大。这些研究结果提示，甲状腺激素受体和视黄酸受体通过由一个自身趋异的共同祖先基因在从该家族类固醇受体组的所述共同祖先进化过程中的相当早期的基因重复、可能是染色体重复进化而来。先前用HAP表示的RARB基因通过体细胞杂交和原位杂交作图至3p24。
Benbrook等(1988)表明在上皮组织中的主要分布，因此使用命名RAR(ε)。Mattei等(1988)通过原位杂交，将RARB基因分配至3p24。采用缺失作图法，de The等(1990)鉴定出一种位于转录起始上游59-bp的27-bp片段，它赋予疱疹病毒胸苷激酶启动子的视黄酸应答性。他们发现，α受体和β受体均通过同一DNA序列起作用。Mattei等(1991)将所述相应的基因分配至小鼠的14号染色体的A带以及大鼠15号染色体上。
Nadeau等(1992)证实了所述小鼠同系物分配至14号染色体的着丝粒部分。
根据存在于特定人肝细胞癌(HCC)中的乙型肝炎病毒(HBV)整合位点与同一肝脏的非肿瘤组织中相应的非占据位点的比较，Dejean等(1986)发现HBV整合将所述病毒序列邻近带有与癌基因ERBA和人糖皮质激素受体和雌激素受体基因的推定DNA结合结构域都明显相似的肝细胞序列放置。
Dejean等(1986)提出，通常是沉默的或在正常肝细胞中以非常低水平转录的该基因，由于HBV整合而表达不当，因此导致细胞转化。
Dejean等(1986)借助一组啮齿动物-人类体细胞杂种DNA，将该基因定位至3号染色体。de The等(1987)的其它研究表明，HAP基因产物可能是一种新型配体效应调节蛋白，其在肝中的不当表达与肝细胞癌发生有关。Brand等(1988)指出，称为HAP(对于HBV激活的蛋白)的新型蛋白是一种视黄酸受体。他们将该受体称为β型(RARB)，并将其作图至3p25-p21。
Lotan等(1995)发现，RARB mRNA的表达在恶化前口腔损伤中选择性地丧失，并且可以通过用异维A酸治疗而得到恢复。RARBmRNA表达的恢复与临床反应相关。
RARB、RARG、RXRB和RXRG在纹状体中表达。为了研究这些基因对运动的影响，Kreczel等(1998)研制出单剔除(knockout)小鼠和双剔除小鼠，并通过开放场地和转杆试验分析其运动技能。RARB-当与野生型同窝小鼠(littermate)比较时，RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG双无效突变体小鼠，表现出向前运动减少，而相应的单无效突变体没有表现出所述减少。40％RARB-RXRB无效突变体表现出向后运动。RARB、RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG小鼠的转杆试验表现受到损害。相反，即使RARA和RARG也在纹状体中表达，但RARA、RARG、RARA-RXRG和RARG-RXRG无效小鼠在运动中没有表现出损害。骨骼肌、外周神经和脊髓的形态学、发育和功能在所有单无效突变体和双无效突变体中均正常，平衡反射也是如此。这些结果提示Kreczel等(1998)，RARB、RXRB和RXRG特异性地参与运动行为的控制，并且RARB与或者RXRB或者RXRG的异二聚体是功能受体单位，使得RXRB和RXRG在功能上是丰余的。
Kreczel等(1998)研究了D1和D2多巴胺受体(D1R和D2R)在这些突变体小鼠中的表达，这两种受体是纹状体中最丰富的多巴胺受体。与野生型对照相比，RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG双无效突变体表现出全纹状体D1R和D2R转录物分别减少40％和30％，而RARB或RXRG单突变体没有表现出所述减少。
这种减少主要在纹状体的腹中区中，包括伏隔核(nucleusaccumbens)的壳和核心以及尾状核的内侧背(mediodorsal)部分。这种减少不是由D2R表达神经元的损失引起的，注意到凋亡没有增加。纹状体的组织学正常。
Samad等(1997)对D2R启动子中视黄酸效应元件的鉴定导致Kreczel等(1998)提出D2R和D2R表达的减少发生在转录水平上。RARB-RXRB、RARB-RXRG和RXRB-RXRG双无效突变体没有表现出由可卡因诱导的运动的正常增加，模拟D1R无效小鼠的表型。
总而言之，这些结果为Kreczel等(1998)指出，类维生素A参与多巴胺能mesolimbic通路功能的控制，并且提示视黄酸信号的缺陷可以导致神经性病症。激动剂本发明的激动剂可以是任何合适的RARβ2激动剂。所述RARβ2激动剂最好能够在反式激活测定中激活RARβ2。
所述激动剂可以是有机化合物或其它化学物质。所述激动剂可以是一种氨基酸序列或其化学衍生物或它们的组合。所述药物甚至可以是核苷酸序列-它可以是有义序列或反义序列。所述药物甚至可以是一种抗体。
通常，所述激动剂是一种有机化合物。所述有机化合物通常将包含两个或更多个烃基。这里，术语“烃基”是指包含至少C和H的基团，并且可以任选地包含一个或更多个其它合适的取代基。这类取代基的实例可以包括卤代、烷氧基、硝基、烷基、环基等。除所述取代基可能是一种环基外，取代基的组合可以组合一个环基。如果所述烃基包含一个以上的C，则那些碳不必是相互连接的。例如，所述碳中的至少两个可以通过合适的元素或基团连接。因此，所述烃基可以含有杂原子。合适的杂原子对于本领域技术人员将是显而易见的，包括例如硫、氮和氧。对于某些应用，最好是所述药物包含至少一个环基。所述环基可以是多环基，例如非稠合多环基。对于某些应用，所述激动剂包含至少一个与另一烃基连接的所述环基。特异性激动剂按照本发明的特异性激动剂的一个实例是视黄酸(RA)。视黄酸的两种常见形式(或者全反式视黄酸(tRA)或者9-顺式-RA)是RARβ2的激动剂。
CD2019是一种RARβ2激动剂，其结构如本文所讨论的并且如(Elmazar等(1996)Teratology第53卷第158-167页)中所示。在(Beard和Chandraratna第194页；Johnson等，1996)中也讨论了这种激动剂和其它激动剂。CD2019的结构在附图中作为式I显示。
一种替代的RARβ2激动剂在附图中以式II显示。
本发明也包括式I和/或式II的结构式的模拟物或生物等排物。
可按照本发明使用的激动剂最好对于RARβ2具有选择性。确定RARβ2激动作用的测定按照本发明的激动剂的实例可以采用确定RARβ2激动作用的测定来鉴定和/或证实。
因此，本发明也包括(i)确定一种候选药物是否能够作为RARβ2激动剂起作用；(ii)如果所述候选药物能够作为RARβ2激动剂起作用，则将所述药物以引起神经突发育的量传递至受治疗者。测定任何一种或更多种合适的靶-例如氨基酸序列和/或核苷酸序列，均可以用于在多种药物筛选技术的任一种中鉴定能够调节RARβ2的药物。在这样一种试验中使用的靶可以是在溶液中游离的、固定于固相支持体、在细胞表面上带有的、或位于胞内。可以测量靶活性的消除或靶和所述药物之间结合复合体的形成。
本发明的测定可以是一种筛选，藉此可以测试多种药物。一方面，本发明的测定方法是一种高通量筛选法。
用于药物筛选的技术可以基于1984年9月13日公开的Geysen的欧洲专利申请84/03564中描述的方法。概括地讲，在一种固相基片例如塑料钉或某些其它表面上合成大量不同的小肽试验化合物。使所述肽试验化合物与一种合适的靶或其片段反应，并进行洗涤。然后例如通过本领域众所周知的适当改变的方法检测结合的实体。也可以将一种纯化靶直接包被在板上，用于药物筛选技术。或者，可以用非中和抗体捕获所述肽，并将其固定至固相支持体上。
本发明也设想了应用竞争性药物筛选测定，其中能够结合一种靶的中和抗体特异性地与试验化合物竞争与靶的结合。
用于筛选的另一种技术可供用于高通量筛选(HTS)对所述物质具有合适结合亲和性的药物，并且基于WO-A-84/03564中详述的方法。
预计本发明的测定方法将既适合于试验化合物的小规模筛选，又适合于其大规模筛选，也适用于定量测定。
在一个优选方面，本发明涉及选择性地调节RARβ2的药物的鉴定方法。
在一个优选方面，本发明的测定利用在表面展示RARβ2的细胞。这些细胞可以从具有这类细胞的受治疗者中分离。然而，最好是通过转染细胞使得在转染后那些细胞在其表面上展示RARβ2，来制备所述细胞。
可以使用的测定的另一实例描述于WO-A-9849271中，它涉及一种无限增殖化人畸胎癌CNS神经元细胞系，该细胞系据说具有高水平的神经元分化，并且可用于测定与RARβ2结合的化合物。报道基因在本发明的测定方法(以及筛选)中可以使用种类繁多的报道基因，优选的报道基因提供方便的可检测信号(例如通过光谱学)。作为实例，一种报道基因可以编码一种催化改变光吸收特性的反应的酶。
其它方案包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分类术(FACS)。甚至可以使用一种利用与两种非干扰表位反应的单克隆抗体的两位点基于单克隆的免疫测定。这些测定和其它测定在其它地方描述于Hampton R等(1990，Serological Methods，ALaboratory Manual，APS Press，St Paul MN)和Maddox DE等(1983，JExp Med 1581211)。
报道分子的实例包括但不限于(半乳糖苷酶、转化酶、绿荧光蛋白、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、(葡糖醛酸糖苷酶、外切葡聚糖酶和葡糖淀粉酶。或者，可以将放射标记或荧光标记物标记的核苷酸掺入新生的转录物中，然后当将转录物与寡核苷酸探针结合时鉴定所述转录物。
作为其它实例，许多公司例如Pharmacia Biotech(Piscataway，NJ)、Promega(Madison，WI)和US Biochemical Corp(Cleveland，OH)供应市售试剂盒和测定方法的操作步骤。合适的报道分子或标记包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光或生色剂以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子等。指出这类标记应用的专利包括US-A-3817837、US-A-3850752、US-A-3939350、US-A-3996345、US-A-4277437、US-A-4275149和US-A-4366241。宿主细胞可以将用于本发明-例如用作靶或用于表达靶或用作药用活性剂的多核苷酸导入宿主细胞中。
与本发明相关的术语“宿主细胞”包括包含本发明多核苷酸序列的任何细胞。
这里，可以将多核苷酸导入原核生物细胞或真核生物细胞，例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
可以用本领域已知的多种技术，例如转染、转化和电穿孔，将本发明的多核苷酸导入合适的宿主细胞中。当要将本发明的多核苷酸给予动物时，几种技术是本领域已知的，例如用重组病毒载体(例如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒)感染以及直接注射核酸和基因枪转化。
因此，本发明的再一实施方案提供用作为本发明靶或表达本发明靶的多核苷酸转化或转染的宿主细胞。最好是所述多核苷酸载于用于复制或表达将作为所述靶或表达所述靶的多核苷酸的载体中。将筛选与所述载体匹配的所述细胞，所述细胞例如可以是原核生物(例如细菌)细胞、真菌细胞、酵母细胞或植物细胞。
革兰氏阴性菌大肠杆菌广泛用作异源基因表达的宿主。然而，大量的异源蛋白往往在所述细胞中积累。随后从大量大肠杆菌胞内蛋白纯化所需蛋白有时可能是困难的。
与大肠杆菌相反，来自芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌非常适合作为异源宿主，因为它们能够将蛋白分泌到培养基中。适合作为宿主的其它细菌是来自链霉菌属(Streptomyces)和假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌。
根据编码本发明多肽的多核苷酸的性质和/或对于所表达蛋白的进一步加工的需求，最好使用真核生物宿主，例如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞优于真菌细胞，因为它们更易于操作。然而，某些蛋白或者从酵母细胞分泌差，或者在某些情况下其加工不当(例如在酵母中过度糖基化)。在这些情况下，应该选择一种不同的真菌宿主生物。
本发明范围内合适表达宿主的实例是真菌，例如曲霉属(Aspergillus)菌种(例如在EP-A-0184438和EP-A-0284603中描述的那些菌种)和木霉属(Trichoderma)菌种；细菌，例如芽孢杆菌属菌种(例如在EP-A-0134048和EP-A-0253455中描述的那些菌种)、链霉菌属菌种和假单胞菌属菌种；和酵母，例如克鲁维酵母属(Kluyveromyces)菌种(例如在EP-A-0096430和EP-A-0301670中描述的那些菌种)和酵母属(Saccharomyces)菌种。作为实例，典型的表达宿主可以选自黑曲霉(Aspergillus niger)、黑曲霉tubigenis变种(Aspergillus niger var.tubigenis)、黑曲霉awamori变种(Aspergillus niger var.awamori)、刺孢曲霉(Aspergillus aculeatis)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
被广泛修饰的多肽可能需要正确的加工以完成其功能。在那些情况下，需要哺乳动物细胞表达系统(例如HEK-293、CHO、HeLA)，并且所述多肽或者在胞内表达、在细胞膜上表达，或者如果所述多肽前接合适的前导序列，则被分泌到培养基中。
应用合适的宿主细菌例如酵母、真菌、植物和哺乳动物宿主细胞，可以提供翻译后修饰(例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、脂质化以及酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸的磷酸化)，也可能需要应用合适的宿主来赋予本发明重组表达产物最适生物活性。生物与本发明相关的术语“生物”包括可以包含按照本发明的序列和/或从其中获得的产物的任何有机体。有机体的实例可以包括真菌、酵母或植物。
与本发明相关的术语“转基因生物”包括包含按照本发明的靶和/或所获得的产物的任何生物。宿主细胞/宿主生物的转化如早先指出的，宿主生物可以是原核生物或真核生物。合适的原核生物宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。本领域大量记载了关于原核生物宿主转化的内容，例如参见Sambrook等(MolecularCloningA Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc.。
如果使用原核生物宿主，则所述核苷酸序列可能需要在转化之前进行适当修饰，例如通过除去内含子进行修饰。
在另一实施方案中，所述转基因生物可以是酵母。在该方面，酵母也已经广泛用作异源基因表达的载体。菌种酿酒酵母有很长的工业应用史，包括其用于异源基因表达。异源基因在酿酒酵母中的表达已经由Goodey等(1987，Yeast Biotechnology，D R Berry等编著，第401-429页，Allen and Unwin，London)和King等(1989，Molecular and CellBiology of Yeasts，E F Walton和G T Yarronton编著，第107-133页，Blackie，Glasgow)进行了综述。
由于几种原因，酿酒酵母非常适合于异源基因表达。首先，它对于人类是非致病性的，并且它不能产生某些内毒素。其次，它在数个世纪的用于不同目的的商业开发后有长期安全应用史。这导致广泛的公众可接受性。第三，对于该生物的广泛商业应用和研究已经得到许多关于酿酒酵母的遗传学和生理学以及大规模发酵特性的知识。
E Hinchcliffe E Kenny(1993，“作为异源基因表达载体的酵母”，Yeasts，第5卷，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编著，第2版，Academic Press Ltd.)给出了关于酿酒酵母中异源基因表达和基因产物分泌的原理的综述。
可利用几种类型的酵母载体，包括整合型载体，该类型载体需要与宿主基因组重组以进行其维持，还包括自主复制型质粒载体。
为了制备转基因酵母属，通过将本发明的核苷酸序列插入设计用于在酵母中表达的构建体中，制备表达构建体。已经研制了几种类型的用于异源表达的构建体。所述构建体含有一个在酵母中有活性的、与本发明核苷酸序列融合的启动子，通常使用一种酵母起源的启动子，例如GAL1启动子。通常使用酵母起源的信号序列，例如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子位于该表达系统的末端。
关于酵母转化，已经开发几种转化方案。例如，通过按照Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)的所述内容，可以制备按照本发明的转基因酵母属。
可以使用各种选择标记筛选经转化的酵母细胞。在用于转化的标记中有许多营养缺陷型标记(例如LEU2、HIS4和TRP1)和显性抗生素抗性标记(例如氨基糖苷抗生素标记，例如G418)。
另一种宿主生物是植物。构建遗传修饰植物的基本原理是在植物基因组中插入遗传信息，以获得所插入遗传物质的稳定保持。有几种用于插入遗传信息的技术，两个主要原理是直接导入遗传信息和利用载体系统导入遗传信息。在Potrykus(Annu Rev Plant Physiol Plant MolBiol42205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 1994年3月/4月17-27)的文章中可以找到关于一般技术的综述。关于植物转化的其它内容可以在EP-A-0449375中找到。
适用于本发明核苷酸序列的其它宿主包括高等真核生物细胞，例如昆虫细胞或脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，包括人细胞，或来自其它多细胞生物的有核细胞。在最近数年间，在培养物(组织培养物)中繁殖脊椎动物细胞已经成为一种常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是上皮或成纤维细胞细胞系，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NIH 3T3细胞、HeLa细胞或293T细胞。
可以将本发明的核苷酸序列稳定地掺入宿主细胞中，或可以用本领域已知的方法进行瞬时表达。例如，通过用具有一种选择标记基因的表达载体转染细胞，然后在对于表达所述标记基因的细胞选择性的条件下培养经转染的细胞，可以制备稳定转染的哺乳动物细胞。为了制备瞬时转染子，用报道基因转染哺乳动物细胞以监测转染效率。
为了产生这类稳定转染或瞬时转染的细胞，所述细胞应该用足量的本发明核苷酸序列转染。本发明核苷酸序列的精确量可以凭经验确定并且对于特定细胞和测定优化。
因此，本发明也提供一种用待作为靶或待表达所述靶的核苷酸序列转化宿主细胞的方法。用所述核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适合表达所编码蛋白的条件下培养。由重组细胞产生的蛋白可以展示在该细胞的表面上。如果需要，正如本领域技术人员将理解的，可以设计具有指导所述编码序列通过特定原核生物或真核生物细胞膜分泌的信号序列的含编码序列的表达载体。其它重组构建可以将所述编码序列与编码有助于纯化可溶性蛋白的多肽结构域的核苷酸序列连接(Kroll DJ等(1993)DNA Cell Biol 12441-53)。受体此中讨论的RARβ2受体包括所述完整基因产物的模拟物、同源物、片段以及部分或全部的所述完整基因产物。此中讨论的RARβ2最好基本上是指完整的基因产物。神经性病症此中所用术语神经性病症可以指任何损伤，无论是机械损伤(例如由于创伤)还是化学诱导的损伤(例如由于神经毒素，或由于或者因设计或者作为副作用而具有免疫抑制剂效应的治疗方案)；任何神经病理学，例如由病毒感染或其它引起的神经病理学；任何变性性疾病或其它神经组织相关的疾病。
神经性病症的实例包括例如帕金森病、早老性痴呆、衰老、运动神经元疾病、精神分裂症以及其它神经和/或神经变性性疾病。其它神经相关病症可以包括青光眼或视神经的其它损害病因、贝尔麻痹或其它形式的局限性麻痹、基于神经的阳萎例如在根治性前列腺切除术后神经创伤引起的阳萎、或其它病。本发明可能有效的其它病症包括糖尿病的神经病理学效应、ADS性神经病、麻风等。
术语神经性病症是指任何神经系统的病症，无论是外周神经系统还是中枢神经系统(CNS)，无论是交感神经系统还是副交感神经系统，或无论是影响一个亚组的不同神经类型还是影响一个超组(superset)的不同神经类型。目的核苷酸(NOI)按照本发明，所述NOI序列可以编码一种肽，该肽可以是药用活性剂，例如一种RA受体(最好是RARβ2)或其激动剂。
这类编码NOI序列通常可以有效地连接于一个例如在一种或更多种特定细胞类型中能够驱动所述肽表达的合适启动子。
除所述NOI或其部分以及本文描述的表达调节元件外，传递系统可以含有另外的遗传元件，以有效地表达所述一个或更多个基因或调节所述基因的表达，所述遗传元件包括启动子/增强子、翻译起始信号、内部核糖体进入位点(IRES)、剪接信号和聚腺苷酸化信号。
所述一个或更多个NOI可以处于表达调节元件的表达控制之下，所述表达调节元件通常是启动子或启动子和增强子。所述增强子和/或启动子可以优先在神经细胞中有活性，使得所述NOI优先在特定的目的细胞中表达，例如在神经细胞中表达。因此，所述NOI对待治疗个体的任何显著生物学效应或有害效应可以被降低或消除。增强子元件或提供受调节表达的其它元件可以以多个拷贝存在。同样或另外，增强子和/或启动子可以优先在一种或更多种特定细胞类型中有活性，所述特定细胞类型诸如神经细胞，例如有丝分裂后终末分化的非复制型细胞，例如神经元。
术语“启动子”以本领域通常的意义使用，例如是Jacob-Monod基因表达理论中的RNA聚合酶结合位点。
术语“增强子”包括结合于转录起始复合体的其它蛋白组分并因此促进与其相连的启动子所指导的转录起始的一段DNA序列。表达载体最好将用于本发明方法中的NOI(例如编码RARβ2或其部分的NOI)插入有效连接于一个能够为宿主细胞提供所述编码序列表达的控制序列的载体中，即所述载体是一种表达载体。定向载体术语“定向载体”是指能够感染/转染/转导细胞或将在宿主和/或靶细胞中表达的能力限于该宿主生物的某些细胞类型的载体，所述细胞通常是具有共同表型或相似表型的细胞。传递用于本发明的传递系统可以是任何合适的传递系统，所述传递系统用于传递所述NOI并且供所述NOI在体内表达，以产生所述相关的肽(例如RARβ2)，这进而提供有效治疗效应。
传递系统可以是病毒传递系统。病毒传递系统包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体。另一方面，传递系统可以是非病毒传递系统，例如质粒、染色体或人工染色体的DNA转染法。这里，转染包括一个采用非病毒载体将基因传递至哺乳动物靶细胞的方法。通常，转染方法包括电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩(compacted)DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂转染试剂、阳离子剂介导的转染、阳离子面式两亲物(cationic facial amphiphile)(CFA)(Nature Biotechnology 1996 14；556)和它们的组合。
载体的其它实例包括离体传递系统，它们包括但不限于DNA转染法，例如电穿孔、DNA基因枪、脂质介导的转染、压缩DNA介导的转染)。
在一个优选方面，所述传递系统是一种载体。
在一个更优选方面，所述传递系统是一种病毒传递系统，有时称为病毒载体。载体正如本领域众所周知的，载体是一种允许或促进一种实体从一个环境转移至另一个环境的工具。作为实例，重组DNA技术中使用的某些载体允许实体例如DNA区段(例如异源DNA区段，例如异源cDNA区段)转移到靶细胞中。任选的是，所述载体一旦在靶细胞中，则可以用来在所述细胞中维持所述异源DNA，或可以用作DNA复制单位。重组DNA技术中所用载体的实例包括质粒、染色体、人工染色体或病毒。
术语“载体”包括表达载体和/或转化载体。
术语“表达载体”是指能够在体内或体外/离体表达的构建体。
术语“转化载体”是指能够从一个种类转移至另一个种类的构建体。病毒载体在本发明中，可以采用病毒传递系统(病毒载体)将所述NOI导入合适的宿主细胞中。多种病毒技术是本领域已知的，例如用重组病毒载体例如反转录病毒、单纯疱疹病毒和腺病毒感染。
合适的重组病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、反转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体、痘病毒载体或细小病毒载体(参见Kestler等1999 Human GeneTher 10(10)1619-32)。在病毒载体的情况下，基因传递通常通过病毒感染靶细胞来介导。反转录病毒载体反转录病毒的实例包括但不限于鼠类白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、弗吉纳米肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠类白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠类骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠类肉瘤病毒(Mo-MSV)、艾贝尔逊鼠类白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和禽红细胞性白血病病毒(AEV)。
按照本发明使用的优选载体是重组病毒载体，特别是重组反转录病毒载体(RRV)，例如慢病毒载体。
术语“重组病毒载体”(RRV)是指具有足够的反转录病毒遗传信息以在包装组分存在下允许将RNA基因组包装到能够感染靶细胞的病毒粒子中的载体。靶细胞的感染包括反转录和整合到靶细胞基因组中。RRV携带将由所述载体传递到靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能独立地复制，以在最终的靶细胞中产生感染性反转录病毒粒子。通常所述RRV缺乏一个功能性gag-pol和/或env基因和/或复制必需的其它基因。
可以在Coffin等(“Retroviruses”1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press，编著JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus，第758-763页)中找到详细的反转录病毒表。非病毒性传递所述药用活性剂(例如RARβ2)可以用非病毒技术给予。
作为实例，所述药用活性剂可以用肽传递法来传递。肽传递利用得自能够穿过质膜和/或核膜转运的蛋白质的结构域或序列。
通过微注射或采用能够与细胞膜融合的囊泡例如脂质体传递，可以将目的多肽例如RARβ2直接导入细胞。病毒融合肽也可以用来促进膜融合和传递至所述细胞的胞质。
最好是，所述RARβ2或其片段可以作为与能够跨越质膜和/或核膜的蛋白的蛋白融合体或缀合物，而被传递至细胞中。最好是，所述RARβ2或其片段可以与得自负责转运活性的这种蛋白的结构域或序列融合或缀合。优选的转运结构域和序列包括得自HIV-1反式激活蛋白(Tat)、果蝇属(Drosophila)触角足同源域蛋白和单纯疱疹病毒-1VP22蛋白的结构域和序列。
外源加入的HIV-1反式激活蛋白(Tat)可以通过质膜转运，并达到细胞核以反式激活病毒基因组。已经在HIV-Tat的氨基酸37-72(Fawell等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，664-668)、37-62(Anderson等，1993，Biochem.Biophys.Res.Commun.194，876-884)和49-58(具有基本序列RKKRRQRRR)中鉴定出转运活性。Vives等(1997)，J Biol Chem 272，16010-7鉴定出由氨基酸48-60(CGRKKRRQRRRPPQC)组成的序列，该序列看来对于转运、核定位和细胞基因的反式激活是重要的。果蝇属触角足同源域蛋白的第三个螺旋也已经表现出具有相似的特性(综述，Prochiantz，A.，1999，Ann NY Acad Sci，886，172-9)。在触角足中负责转运的结构域已经定位至16个氨基酸长的肽，该肽富含碱性氨基酸，具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(Derossi等，1994，J Biol Chem，269，10444-50)。该肽已经用来在培养物中将生物活性物质导向胞质和细胞核(Theodore等，1995，J.Neurosci 15，7158-7167)。单纯疱疹病毒的VP22间层蛋白能够在细胞间转运，其中在一个细胞亚群中表达的VP22蛋白传播至该群体的其它细胞(Elliot和O’Hare，1997，Cell 88，223-33)。由GFP(Elliott和O’Hare，1999，Gene Ther 6，149-51)、胸苷激酶蛋白(Dilber等，1999，Gene Ther 6，12-21)或p53(Phelan等，1998，NatBiotechnol 16，440-3)与VP22组成的融合蛋白已经以这种方式被靶向细胞。上述结构域或序列的任何一种都可以用来将RARβ2或其片段导向细胞。上述结构域或序列的任何一种或鉴定为具有转运活性的其它结构域或序列，可以用来将RARβ2或其片段导向细胞。药用组合物本发明也提供一种药用组合物，包括给予治疗有效量的本发明因子(例如RARβ2和/或如本文讨论的其激动剂)和一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。
所述药用组合物可以包含两种组分，其中第一种组分包含RARβ2，而第二种组分包含其激动剂。所述第一种组分和第二种组分可以顺序、同时或一起传递，甚至可以通过不同的给药途径传递。
所述药用组合物可以在人类医学和兽医学上用于人类或用于动物，通常将包含一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的任何一种或更多种。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药学领域众所周知的，描述于例如Remington’s Pharmaceutical Science，MackPublishing Co.(A.R.Gennaro编著，1985)。可以根据计划的给药途径和标准药学实践，选择药用载体、赋形剂或稀释剂。
所述药用组合物可以包含作为载体、赋形剂或稀释剂的任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂，或除所述载体、赋形剂或稀释剂外，还包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂。
可以在所述药用组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料和甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。也可以使用抗氧化剂和悬浮剂。
根据不同的传递系统，有不同的组成和配方需求。作为实例，本发明的药用组合物可以配制成用微量泵传递，或通过粘膜途径传递，例如作为吸入或可食入溶液用的鼻喷雾剂或气雾剂，或通过胃肠外给予，其中所述组合物配制为注射形式，通过例如静脉内、肌内或皮下途径传递。或者，可以设计配方，以通过这两种途径传递。
当所述因子通过胃肠粘膜进行粘膜传递时，它应该能够在通过胃肠道转运期间保持稳定；例如，它应该抗蛋白水解降解、在酸性pH下稳定并且抗胆汁的去垢剂效应。
如果合适，可以通过吸入、以栓剂或子宫托形式、通常以洗剂、溶液、乳膏、软膏或粉剂形式、利用皮肤贴剂、以含例如淀粉或乳糖的赋形剂的片剂形式、或在单独的或与赋形剂混合的胶囊或卵状小体(ovule)中、或以含调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮剂的形式，口服给予所述药用组合物，或可以将所述药用组合物胃肠外注射，例如静脉内、肌内或皮下注射。对于胃肠外给药，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，以使溶液与血液等渗。对于口腔含化给药或舌下给药，所述组合物可以以常规方式配制的片剂或锭剂给予。药物组合本发明的因子可以与一种或更多种其它药学活性物质一起给予。例如，本发明包括用按照本发明的因子和一种或更多种类固醇、止痛药、抗病毒剂或其它药学活性物质同时或顺序治疗。
人们会理解，这些方案包括所述物质的顺序、同时或一起给予。
实施例本发明现在将仅作为实例来描述，其中参考以下附图图1(是实施例1中所称的图1)显示照片。
图2，(是实施例1中所称的图2)显示柱状图表和照片。
图3，(是实施例2中所称的图1)显示照片。
图4，(是实施例2中所称的图2)显示照片。
图5，(是实施例2中所称的图3)显示照片。
图6，(是实施例2中所称的图4)显示照片。
图7，(是实施例2中所称的图5)显示照片。
图8，(是实施例2中所称的图6)显示柱状图表。
图9，(是实施例3中所称的图1)显示照片。
图10，(是实施例3中所称的图2)显示照片。
图11，(是实施例3中所称的图3)显示照片。
图12，(是实施例3中所称的图4)显示照片。
图13，(是实施例3中所称的图5)显示照片。
图14，(是实施例3中所称的图6)显示照片。
图15，(是实施例3中所称的图7)显示柱状图表。
图16，(是实施例3中所称的图8)显示照片。
图17显示化学结构式。
所述附图在以下实施例小节中更全面地描述。实施例1神经突向外生长的刺激神经生长因子通过视黄酸合成刺激神经突向外生长起作用。
神经生长因子(NGF)刺激来自培养的成体背根神经节(DRG)的神经突向外生长1。维生素A衍生物视黄酸(RA)也诱导来自各种胚胎来源包括DRG的神经突向外生长2，3。NGF和RA效应的这种相似性是因为它们都是导致神经突向外生长的同一遗传级联的组分吗？RA正调节低亲和性和高亲和性NGF受体3，4，并且诱导NGF自身的转录5，提示RA在该级联中可以位于NGF上游。然而，这里我们指出，相反，即NGF位于RA上游。我们证明，当在NGF和一种抑制参与RA合成的酶的化合物存在下培养成体小鼠DRG时，不发生神经突向外生长。相反，当将RA与NGF的封闭性抗体一起加入时，神经突向外生长正常发生。我们进一步证明，NGF诱导视黄酸合成酶RALDH-2和视黄酸受体-β两者的转录以及所合成RA的可检测释放。我们提出，RA是成体DRG神经突再生所需的，并且NGF在RA上游起作用以诱导其合成。
RA的细胞效应是通过与作为激活转录因子的配体的核受体结合而介导的。存在两类受体-视黄酸受体(RAR)和类维生素AX受体(RXR)，每类有三个亚型α、β和γ6，7。另外，每个亚型由于可变剪接和差别启动子用法而有多种同种型。RAR受体通过与RXR形成异二聚体而介导基因表达，而RXR可以或者作为同二聚体介导基因表达，或者通过与孤独受体例如LXR形成异二聚体而介导基因表达8。核受体NGFIB与RXRs形成异二聚体8，而通过给予NGF，NGFIB在PC12细胞中被快速诱导9，这些发现提示NGF和RA途径之间有另一种机制联系。
虽然显然RA在从胚胎DRG刺激神经突向外生长方面有作用2，3，但尚不了解在成体DRG中是否发生同样的作用。为了测试这一点，我们在NGF(100ng/ml)或RA(100nM)存在下，在去脂血清中培养小鼠成体DRG达5天。在两种情况下，都发生神经突向外生长(图1b)。在单独的去脂血清中培养的成体DRG中神经突向外生长很少或没有发生(图1a)。神经突数目的差异是显著的(图2a；1，2和3)。重要的是注意到从RA或NGF处理的成体DRG延伸的神经突数目虽然显著高于从未经处理的DRG延伸的神经突数目，但小于用胚胎组织获得的数目。当将RA与NGF一起加入时，没有两种处理的加和作用(图1c)，在RA、NGF或RA加NGF各组之间没有观察到显著差异(图2a；2、3和4)。虽然可能NGF和RA的浓度都是各自的饱和浓度，但缺乏协同作用也暗示NGF和RA通过同一途径起作用，以引起神经突向外生长。人们可能想象或者RA诱导NGF产生5，或者NGF通过刺激RA合成酶诱导RA产生。
为了测试这些假说中的哪一个是最为可能的，我们在NGF和10μM二硫化四乙基秋兰姆存在下培养成体DRG，二硫化四乙基秋兰姆是一种化合物，它通过抑制醛脱氢酶而阻断视黄醛转化为RA10。如果RA的作用是刺激NGF产生，则二硫化四乙基秋兰姆应该对NGF刺激的神经突向外生长没有影响，而如果NGF诱导RA合成，则二硫化四乙基秋兰姆应该抑制向外生长。如图1d所示，加入10μM二硫化四乙基秋兰姆与NGF，完全消除了NGF诱导的神经突向外生长(显著差异；图2a，2和5)，而加入DMSO(二硫化四乙基秋兰姆的载体)和NGF不影响神经突向外生长(图2a，2和6)。为了证实二硫化四乙基秋兰姆不影响外植体中的细胞存活，我们进行了两种类型的拯救。在两种情况下，外植体均在补充二硫化四乙基秋兰姆的培养基中培养8天。在第一种拯救下，从实验开始时，将100nM RA加入外植体中；在第二种拯救下，在第4天加入RA。在两种情况下，与在仅补充二硫化四乙基秋兰姆的培养基中培养的培养物相比，均发生显著增加的神经突向外生长(图1e、f和2b)。这些实验也证实二硫化四乙基秋兰姆对于RA合成途径的特异性，因为RA可以拯救所述细胞应答。
二硫化四乙基秋兰姆抑制NGF的诱导效应，而不抑制RA的诱导效应，这提示NGF在导致神经突向外生长的级联中可以位于RA之前。为了测试这一点，我们使用了抗NGF的封闭性抗体。在NGF和该封闭性抗体存在下，完全没有神经突向外生长发生(图1g；与在仅NGF存在下培养的DRG相比，图1b)。另一方面，在NGF封闭性抗体和100nM RA存在下培养的DRG(图1h)显示出与仅用NGF所获结果相同的神经突向外生长(图1b和2c)。
如果NGF位于RA上游，则它应该在加入DRG培养物之后诱导RA合成。为了测试这种预测，我们使用了F9受体细胞系，该细胞系由于用1.8kb与lacZ基因连接的含视黄酸效应元件(RARE)的小鼠RARβ2基因启动子转染，而对RA的存在特异性应答(Sonneveld，E.，van den Brink，C.E.，van der Leede，B.J.，Maden，M.和van der Saag，P.T.(1999)用mRARb2-lacZ稳定转染的胚胎癌性细胞系用于测定活性类维生素A水平的灵敏系统。Exp.Cell.Res.第250卷第284-297页)。在存在RA的情况下，在β-半乳糖苷酶组织化学染色后可以检测到活化细胞。我们首先消除了这样一种可能性由于在NGF(100ng/ml)存在下培养F9细胞，NGF自身激活F9细胞，因此没有高于背景的F9细胞的标记。然后，我们在去脂血清中于三种不同条件下将成体DRG培养5天在缺乏NGF的情况下、在存在NGF的情况下或在存在NGF和NGF封闭性抗体的情况下。然后对培养的DRG进行超声处理，并置于F9报道细胞上。与未经处理的DRG相比，经NGF处理的DRG匀浆产生清晰的RA信号(图2d)。当除NGF外用封闭性抗体培养所述DRG时，阻止了这种激活(图2d)。
我们下一步考虑到，视黄酸合成酶可能由NGF诱导。视黄醇通过两步氧化过程转化为一种醛-视黄醛，然后视黄醛被氧化为视黄酸(关于综述，参见文献11)。已经表明，2型视黄醛脱氢酶(RALDH-2)在发育中的神经系统(包括DRG)中表达12。运用在RT-PCR，我们发现NGF也在培养的成体DRG中强诱导RALDH-2(图2e)。最后，我们还发现在NGF刺激的培养物中正调节RARβ受体(图2e)，这是一种表明涉及神经突向外生长的现象13。
我们的结果表明，RA可以刺激来自成体神经组织-DRG的神经突向外生长。NGF同样刺激来自该组织的神经突向外生长，我们已经证明，NGF通过一种酶-RALDH-2诱导RA合成而刺激神经突向外生长。在存在或者NGF封闭性抗体或RA合成抑制剂的情况下，则NGF不能起作用。因此，在NGF诱导神经突向外生长的过程中最为可能的事件顺序是NGFRALDH-2RARARβ神经突向外生长。我们尚未确定NGF是否直接负责诱导RALDH-2，或者该过程是否需要某些中间蛋白。然而，由于NGFIB是NGF诱导的最早的基因之一9，并且其产物可以与RXRs形成异二聚体8，因此NGFIB/RXR异二聚体可能负责激活RALDH-2基因。神经营养蛋白传统上一直被认为是诱导神经再生14和治疗神经变性性疾病15的潜在的药物，但其应用的一个主要问题是缺乏传递至损伤位点的有效方式。因为再生性反应需要RA，并且RA位于NGF下游，那么因为RA是可以口服给予的低分子量亲脂性化合物，所以可以解决传递至所述损伤的问题。因此，RA在神经学方面可能具有临床用途。实施例1的附1.在去脂血清加以下物质存在下培养5天(a-d，g，h)或8天(e，f)的小鼠成体DRG的神经突向外生长(a)不加入；(b)NGF，100ng/ml；(c)NGF和100nM tRA；(d)NGF和10M二硫化四乙基秋兰姆；(e)在第0天加入的二硫化四乙基秋兰姆和tRA；(f)二硫化四乙基秋兰姆；(g)NGF和封闭性抗体；(h)NGF封闭性抗体和tRA。
图2(a-c)在cellogen中培养的成体DRG所产生的神经突。(a)5天时NGF、RA和二硫化四乙基秋兰姆的影响(1，不加入；2，NGF，100ng/ml；3，RA，100nM；4，NGF，100ng/ml和RA，100nM；5，100ng/mlNGF和10M二硫化四乙基秋兰姆；6，NGF，100ng/ml和DMSO)。误差范围(error bar)，s.e.；n＝6，所有组别。NGF处理组(2)和其它组别之间的差异*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-检验。(b)用10M二硫化四乙基秋兰姆处理的DRG的RA拯救(从左至右无RA；100nM RA，第0天；100nM RA，第4天)。误差范围，s.e.；n＝6，所有组别。与不存在RA的培养物的差异*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-检验。(c)NGF封闭性抗体对5天DRG培养物的影响。左，NGF，100ng/ml；中，NGF加封闭性抗体；右，封闭性抗体加100nM RA；n＝4。与NGF加封闭性抗体的差异*p＜0.01；**p＜0.0001；Student t-检验。(d)对用或不用NGF培养的DRG应答的β-gal阳性F9细胞百分比的增加。左，不加入；中，NGF，100ng/ml；右，NGF与封闭性抗体。由NGF处理的DRG产生的β-gal阳性细胞百分比的差异；*p＜0.025，Student t-检验；对于每组，n＝9。(e)用或不用NGF(100ng/ml)培养5天的成体DRG中RALDH-2酶和RARβ表达的RT-PCR分析。用GAPDH来指示两种样品中cDNA的存在。已经描述了应用F9报道细胞研究鸡胚中RA分布[16]。实施例2成体神经组织中神经突发育的诱导此中出乎意料地表明，视黄酸受体β2在小鼠成体脊髓中诱导神经突向外生长。
已经表明神经突向外生长需要视黄酸。最近我们已经证明，在外周神经再生中的其作用机制是通过激活视黄酸受体β2。成体中枢神经系统不能再生。因此，我们已经研究了在成体脊髓中不能再生是否与视黄酸受体β2的表达有关。
结果我们在此报道，在可以再生的小鼠胚胎脊髓中RARβ2被正调节到最大程度刺激神经突向外生长的浓度。相反，在小鼠成体脊髓中，检测不到RARβ2，RA也不诱导RARβ2，在体外没有神经突延伸。当成体脊髓用RARβ2转染时，可以诱导神经突再生。当脊髓用RARβ的另一同种型RARβ4转染时，没有神经突向外生长。这表明在神经突再生中受体特异性的重要性。
结论这些数据提示，成体CNS的再生潜力的损失部分由于RARβ2的表达损失引起的，并且是神经元自身固有的。我们建议，用RARβ2进行基因治疗可能导致受损脊髓的功能恢复。
背景成体中枢神经系统(CNS)中轴突再生的诱导是神经生物学的主要目标。CNS轴突在正常环境下不能再生已经归因于一种原因或多种原因的组合神经营养因子的丰度低；缺乏促进生长的分子；存在抑制生长的分子。因此，在CNS中再刺激轴突生长的尝试集中在这三种可能性上。当使用外周神经移植物提供许可环境时，在成年大鼠中脊髓和髓神经元将轴突延伸多至30mm1。与成纤维细胞生长因子应用联合的相似策略导致后肢功能的部分恢复2。用抗体中和髓鞘质中存在的神经突生长抑制剂，使得轴突比在对照幼鼠中延伸得更长3，并且导致在脊髓损伤后特异性反射和运动功能的恢复4。神经营养蛋白-3和这些抗体的组合成功地诱导皮质脊髓束(CST)轴突的远程再生5。嗅成髓鞘细胞(olfactory ensheathing cells)的悬浮液也有效地为大鼠的受损CST恢复运动功能6。如果神经营养蛋白仅仅用来保持轴突切开的神经元存活7，则在诱导再生的这些方法中，正是轴突周围的环境是注意的焦点，而不是神经元自身固有的能力。然而，至少CNS再生损失的一部分是神经元自身固有的(4个参考文献)。这提示不在非再生性成体CNS中表达、而在可以再生神经突的发育中的CNS中表达的基因的鉴定，可以产生通过基因疗法治疗脊髓损伤的新策略。
我们在此证明，一种这样的基因是RARβ2，它由维生素A的生物活性代谢物视黄酸(RA)激活。RA存在于发育中的胚胎和成年动物的各种组织中，尤其是在神经系统中8-13。当缺乏RA时，CNS的发育中的神经元没有使神经突延伸到外周中14，15。相反，当应用于培养的神经元时，RA诱导更多数目和更长的神经突16以及能够决定其生长方向17。RA在基因转录水平上起作用，因为它们是两类核转录因子视黄酸受体(RAR)和类维生素A X受体(RXR)的配体18，19。每类类维生素A受体有3个成员a、b和g，并且每个成员有数种同种型，这种多样性可能导致RA对细胞的多效性效应。
我们已经一直在研究RA对神经元作用的分子机制，已经得出的结论是这些视黄酸受体之一-RARβ2是神经元中RA信号的关键转导物，因为它在RA刺激神经突向外生长的情况下被正调节20。因此我们假设在成体脊髓中这种核受体缺乏或低阈值水平可能导致该组织不能再生轴突突出物。结果和讨论RA在体外对小鼠胚胎脊髓的效应我们开始通过证实小鼠胚胎脊髓同胚胎CNS其它区域一样通过延伸神经突的对RA应答12，17，21-23，并且这种行为涉及RARβ2的正调节。从置于cellogen基质中并在10％去脂血清中培养的小鼠胚胎解剖出E13.5脊髓。以3种不同浓度(10-8M、10-7M、10-6M)加入全反式RA，5天后该外植体用神经丝抗体染色，并检查神经突的存在。随着RA浓度的增加，从培养的脊髓发出的神经突的数目也增加，在10-6M下效应最大(图1C、E、G)。因为RA及其前体视黄醇的内源含量高9，13，所以可推测甚至在缺乏RA的情况下，所述胚胎脊髓也延伸神经突(图1A)。实际上，当用二硫化四乙基秋兰姆抑制RA的内源合成时，则没有神经突延伸24。为了证明神经突的诱导涉及RARβ2的正调节，在同样范围的RA处理中在5天后，对培养物进行RT-PCR。这揭示RARβ2在所用的所有RA浓度下，正常地在胚胎脊髓中表达(图2A，1-5道)，并且在1×10-6M RA处理后被强烈正调节(图2A，5道)，而这一浓度产生最大神经突向外生长。在体外RA对小鼠成体脊髓的效应缺乏我们下一步不用胚胎脊髓，而用10月龄成体脊髓进行同样的一系列实验。与胚胎脊髓相反，RA在所测试的任何浓度下都对神经突向外生长没有影响，并且同未处理的对照一样，这些RA处理的成体脊髓根本不能延伸任何神经突(图1B、D、F、H)。通过RT-PCR检查RARβ2的参与，揭示出对照成体脊髓有很少的这种受体或没有可检测的内源水平的这种受体(图2B，1道)，并且与胚胎脊髓不同，对任何浓度的RA处理反应时其水平都没有变化(图2，2-5道)。成体脊髓中神经突的诱导因此我们假设这是缺乏RARβ2表达，这可能导致成体脊髓的完全惰性的行为。我们先前观察到，通过延伸神经突而对RA应答的成体DRG也正调节RARβ224，这一观察证明所述同样的行为由胚胎神经元和合适的成体神经元诱发，并且增强了PNS和CNS神经元之间调节行为的差异。为了测试我们的假说，我们用1型缺陷型单纯疱疹病毒(HSV-1)载体转染成年(10月龄)小鼠脊髓段。
进行了3种不同的转染，其中两种用作对照。第一种转染，仅用含lacZ的载体(pHSVlacZ)；第二种转染，用含RARβ2的载体(pHSVRARβ2)；第三种转染，用含另一同种型RARb基因RARβ4的载体(pHSVRARβ4)。后者用作非常准确的转染对照，因为在我们先前的实验中我们在RA处理神经元后没有检测到RARβ4同种型20，因此它不参与神经突向外生长。我们首先确保所述转染是成功的，并且相关的受体同种型在培养的脊髓中表达。用合适的构建体对脊髓段转染过夜，并且或者在3天后或者在4天后进行分析。根据对成体脊髓的b-半乳糖苷酶染色判断，pHSVlacZ处理的脊髓表明发生了显著量的转染(图3B)。RT-PCR证明，用所述RARβ2载体转染导致RARβ2表达(图4，3道)，但RARβ4不表达(图4，4道)，而用所述RARβ4载体转染导致RARβ4表达(图4，8道)，而RARβ2不表达(图4，7道)。在非转染的脊髓中，既没有检测到RARβ2，也没有检测到RARβ4(图4，2道和6道)。
这些转染对神经突向外生长的效应是明确的。用pHSVlacZ转染，不能改变培养的成体脊髓的行为，培养的成体脊髓在神经突向外生长方面完全保持不反应(图5A，12/12转染)。同样，用pHSVRARβ4转染在培养的脊髓中没有产生反应，培养的脊髓保持无作用(图5C，12/12转染)。然而，用pHSVRARβ2同种型转染，清楚地产生一种不同的行为，在培养物中出现许多神经突(图5B，8/12转染)。在pHSVRARβ2脊髓中产生的神经突数目不等，在3和23之间。在pHSVlacZ转染中，每个外植体的lacZ阳性细胞数目有相当大的变异。这提示神经突数目的变异性可能是由于转染的细胞数目变异而引起的。
这些结果为我们的假说提供了强有力的支持，我们的假说是RARβ2同种型在应答RA而诱导神经突向外生长方面起重要作用，并且RARβ2同种型可能是在损伤成体CNS中不能被正调节的关键组分。我们的假说基于几个涉及或者再生型或者非再生型神经元组织及其对RA应答的实验。因此，小鼠胚胎脊髓、小鼠胚胎DRG和小鼠成体DRG都通过正调节RARβ2且延伸神经突而对RA应答。相反，小鼠成体脊髓不能正调节RARβ2并且不能延伸神经突。此外，NGF刺激神经突向外生长，并且通过正调节RARβ2而起作用24，而来自小鼠胚胎DRG的神经突向外生长可以受RARβ激动剂刺激20。
这些结果表明，当操作神经元本身的基因组时，再生可以被重新唤醒。这与最近的神经突向外生长的体内诱导相反，所述神经突向外生长的体内诱导集中在CNS环境中存在于的抑制性因子1-5。在发育期间，脊髓再生能力的损失与髓鞘质相关神经突生长抑制分子的出现相关，并且这些抑制分子中的某些分子被认为是由少突胶质细胞产生的25。我们在我们的培养物中以及在环境已经被操作的培养物中观察到的两种神经突再生是两种不同的神经突再生机制，或者它们是相关的过程。已经表明CNS神经元本身参与髓鞘形成26，这一事实为后一观点提供了支持。因此这使得我们推测在发育期间神经元中RARβ2的存在，可能调节参与髓鞘形式的基因，并且通过RARβ2基因的转染，这一过程在成体CNS中重演。
在RARβ2转染的脊髓中观察到的神经突中没有一个延伸超过适当的距离。这提示神经突的延伸可能需要一组不同基因的表达。成体PNS中轴突再生，其中从分枝到延伸生长的转变取决于转录依赖性开关27，这一证据提供了这可能是事实的证据。另一方面，在我们的培养基中神经突不能延伸可能是由于这样一个事实引起的有可能由于所述转染的瞬时性质而致使在规定时间内RARβ2表达丧失，并且这没有为延伸的发生提供足够的时间。
然而，我们提出这些初步数据支持RARβ2在成体CNS中神经突再生中起作用，并且用这种转录物的基因疗法联合其它疗法可能在某一天导致受伤脊髓的功能恢复。方法培养物。从或者E13.5小鼠或者10月龄小鼠解剖出脊髓，并将其切成约5mm的横切段。将这些横切段培养在cellogen基质(ICN flow)中，所述基质通过将1体积的7.5％碳酸氢钠、1体积10x MEM(Gibco)和8份cellogen (ICN flow)混合而制备。通过滴加5M NaOH，将pH调至7.5。每2天饲喂外植体。培养基由含有谷氨酰胺(Gibco)、6％葡萄糖、GMS-A(Gibco)、10％去脂血清和全反式RA(储备液，1×10-5M，Sigma)的DMEM-F12组成。第5天，将它们固定在4％低聚甲醛中，并用神经丝抗体NF200(Sigma)染色。
RT-PCR分析。提取RNA(trizol，Gibco)，并利用Pharmacia试剂盒，如生产商的说明中所述，制备cDNA。所用的引物来自GAPDH、RARβ2和RARβ4，(细节根据要求)。对于胚胎脊髓，进行25个循环的PCR，而对于成体脊髓，进行40个循环的PCR。如下进行扩增于95℃变性30秒，于55℃退火30秒，并且于72℃延伸1分钟。然后将所得产物的1/5进行凝胶电泳。
转染。制备病毒储备液，并如参考文献28中所述方法进行B半乳糖苷酶染色。所用的效价是pHSV RARβ2，5×10-4ip/ul，pHSVRARβ4，4×10-4ip/ul，pHSVlacz 5×10-4ip/ul。实施例2的附图图1视黄酸对培养的E13.5(A，C，E，G)和10月龄成体脊髓(B，D，F，H)上神经突向外生长的影响的比较。脊髓段在在10％去脂血清和RA存在下cellogen中培养5天。培养基每2天进行更换。A，B，无RA；C，D，1×10-8MRA；E，F，1×10-7MRA；G，H，1×10-6MRA。
图2RARβ2在E13.5和10月龄成体脊髓中的表达。脊髓段在不同浓度的RA存在下培养5天，此后进行RARβ2的RT-PCR分析。A.E13.5(2-5道)和B.10月龄成体脊髓(2-5道)。泳道1.bluescript/HPAII大小标记物，2.无RA，3.1×10-8MRA，4.1×10-7MRA，5.1×10-6MRA。GAPDH的存在用来指示样品中等量的cDNA。
图3用pHSVlacZ转染成体脊髓。培养的10月龄成体脊髓用5×10-4ipu/ul pHSVlacZ转染过夜，并在3天后分析B半乳糖苷酶染色。A.非转染的成体脊髓。B.用pHSVlacZ转染的成体脊髓。
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