专利名称：新型重组组织因子抑制肽及其制备方法和应用的制作方法实施例1 r-TFIP1的设计、制备和鉴定(1)r-TFIP1基因的克隆、改造及原核表达质粒r-TFIP1-pLY-4的构建按照sTF的氨基酸顺序，依照大肠杆菌偏好密码子设计引物序列。设计PCR引物，并且在引物中引入Ser163，Gly164，Lys165，Lys166突变为Ala的序列。(5’-TCT TCA AGT GCC GCT GCC ACA GCC AAA-3’)并以此引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增点3’端的核苷酸片段。回收后以此片段为3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增得到r-TFIP的基因。所得基因与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将r-TFIP1基因切出，并与大肠杆菌表达载体pLY-4重组，构建原核表达质粒r-TFIP1-pLY-4。质粒r-TFIP1-pLY-4转化大肠杆菌JF1125，抽提质粒并做相应的酶切分析。质粒片段与理论片段一致者为阳性克隆。限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF-1125，质粒pUC19，pLY-4为本室保存。(2)筛选高效表达菌株挑取上述阳性克隆接种于5mlLBA培液中，30℃快速振摇(250 RPM)，培养过夜。次日按1∶50接种于5mlM9CA培液中，30℃继续振摇培养约3小时，使其测定光密度OD600达到1.00左右，留样后将培养温度升高至42℃，继续振摇培养3小时，离心收集细菌。诱导前后的细菌分别用1x上样缓冲液悬浮后，沸水浴煮5分钟，20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后的细菌裂解液在相应分子量处有一浓集的条带，而诱导前的细菌裂解液没有。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。取表达水平高的克隆为工程菌。诱导后的细菌，用超声破菌并离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果表明，表达产物是以非活性的包涵体的形式存在于菌体中。上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。(3)发酵表达工程菌按上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划LBA平板，30℃温箱培养过夜。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于50mlLBA培养液中，30℃振摇培养8小时。此为一级种子液，再将一级种子液按1∶10接种于500mlLBA中，30℃振摇培养8小时，，此为二级种子液。种子菌按1∶10比例接种于4L M9CA培液中，调节发酵参数，温度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并与搅拌连动。继续培养6小时，将培养温度提高到42℃，继续诱导培养3小时，停止发酵，离心收集细菌。发酵工程菌的表达水平大于40％。(4)制备包涵体将发酵工程菌按湿重体积以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)悬浮细菌，高压匀浆泵破菌，压力保持在45-50MP，离心收集沉淀即为包涵体。用洗涤液洗涤包涵体。(5)r-TFIP复性。
洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的复性液，稀释20倍。4℃搅拌复性过夜。并测定r-TFIP活性。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍体积的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，复性后的r-TFIP1离心后上清，直接上柱结束后，用20mmol/LPB(pH8.0)继续洗脱至基线，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)线性梯度洗脱，收集有r-TFIP1活性组分，并进行纯度分析。
所有色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定样品进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemaster?VDS扫描测定纯度。所得产品纯度95％以上。
(8)r-TFIP1抑制TF活性测定将r-TFIP1加入正常人血浆，37℃保温5分钟，加入稀释兔脑粉后，继续保温1分钟，加入Ca2+后凝血时间。结果表明加入r-TFIP2后血浆凝血时间明显延长20％-30％，在r-TFIP1浓度达到12umol/L时，TF活性抑制50％以上。实施例2 r-TFIP2的设计、制备和鉴定(1)r-TFIP2基因的克隆、改造及原核表达质粒r-TFIP2-pLY-4的构建按照sTF的氨基酸顺序，依照大肠杆菌偏好密码子设计引物序列。设计PCR引物，并且在引物中引入Tyr185突变为Ala的序列。(5’-AAA GGA AAT GCATGC TTC AGT GTT CAA-3’)并以此引物为5’-端引物和sTF基因的3’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增点3’端的核苷酸片段。回收后以此片段为3’-端引物和sTF基因的5’-端引物，以sTF基因为模板，用PCR的方法扩增得到r-TFIP2的基因。所得基因与pUC19重组，转化大肠杆菌JM109，提取质粒，以相应限制性内切酶酶解鉴定，获得特征性片断，证实获得阳性克隆。核苷酸序列分析证实基因序列正确。然后将r-TFI2基因切出，并与大肠杆菌表达载体pLY-4重组，构建原核表达质粒r-TFIP-pLY-4。质粒r-TFIP2-pLY-4转化大肠杆菌JF1125，抽提质粒并做相应的酶切分析。质粒片段与理论片段一致者为阳性克隆。限制性内切酶购自BRL公司，大肠杆菌JM109、JF-1125，质粒pUC19，pLY-4为本室保存。
(2)高效表达菌株的筛选挑取上述阳性克隆接种于5mlLBA培液中，30℃快速振摇(250RPM)，培养过夜。次日按1∶50接种于5mlM9CA培液中，30℃继续振摇培养约3小时，使其测定光密度OD600达到1.00左右，留样后将培养温度升高至42℃，继续振摇培养3小时，离心收集细菌。
诱导前后的细菌分别用1x上样缓冲液悬浮后，沸水浴煮5分钟，20ul上样，作还原性SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaImagenaster VDS扫描定纯度、分子量。可见诱导后的细菌裂解液在相应分子量处有一浓集的条带，而诱导前的细菌裂解液没有。经扫描，目的蛋白约占菌体总蛋白的40％左右。取表达水平高的克隆为工程菌。
诱导后的细菌，用超声破菌并离心，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE鉴定，结果表明，表达产物是以非活性的包涵体的形式存在于菌体中。
上述还原性SDS-PAGE按Laemmli方法进行。
(3)工程菌的发酵表达取上述筛选高表达菌株作为工程菌，然后以5L发酵罐进行高密度发酵。从-70℃深低温冰箱中取出种子菌，室温下解冻，在种子菌培养室100级洁净度条件下划LBA平板，30℃温箱培养过夜。从平板上挑取单菌落，同样在100级洁净度条件下接种于50mlLBA培养液中，30℃振摇培养8小时。此为一级种子液，再将一级种子液按1∶10接种于500mlLBA中，30℃振摇培养8小时，，此为二级种子液。种子菌按1∶10比例接种于4L M9CA培液中，调节发酵参数，温度30℃，pH6.9溶解氧保持在50％以上，并与搅拌连动。继续培养6小时，将培养温度提高到42℃，继续诱导培养3小时，停止发酵，离心收集细菌。发酵工程菌的表达水平大于40％。
(4)制备包涵体将发酵工程菌按湿重体积以1∶20的比例，用0.02M PB(pH8.0)悬浮细菌，高压泵匀浆破菌，压力保持在45-50MP，离心收集沉淀即为包涵体。用洗涤液洗涤包涵体。
(5)r-TFIP复性。
洗涤后的包涵体用8M尿素溶解，用含有谷胱甘肽的复性液，稀释20倍。4℃搅拌复性过夜。并测定r-TFIP2活性。
(6)Q-Sepharose Fast Flow柱层析Q-Sepharose F.F.(Pharmacia公司)柱，以10倍体积的20mmol/L PB(pH8.0，0.5M尿素)平衡，复性后的r-TFIP离心后上清，直接上柱，上柱结束后，用20mmol/L PB(pH8.0)继续洗脱至基线，然后用0-1mol/L NaCl(20mmol/L PB，pH8.0)线性梯度洗脱，收集有r-TFIP2活性组分，并进行纯度分析。
本发明所述所有色谱操作均为常规操作。
(7)纯度鉴定及分子量测定样品进行12％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色后，PharmaciaInagemaster?VDS扫描测定纯度。所得产品纯度95％以上。
(8)r-TFIP2抑制TF活性测定将r-TFIP2加入正常人血浆，37℃保温5分钟，加入稀释兔脑粉后，继续保温1分钟，加入Ca2+后凝血时间。结果表明加入r-TFIP2后血浆凝血时间明显延长20％-30％，在r-TFIP2浓度达到20umol/L时，TF活性抑制50％以上。
实施例3 r-TFIP在血栓性疾病中的应用应用本发明所制备的r-TFIP进行抗血栓实验，证实其在血栓性疾病的防治中有良好的作用，与低分子肝素相比，抗栓效果明显，对凝血功能的影响明显小于低分子肝素。
(1)抑制静脉血栓形成结扎大鼠下腔静脉诱发静脉血栓形成。血栓形成2小时后静脉注射给药。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60-100抗Xa U/kg，治疗组分别给予r-TFIP1.00-2.0mg/kg。给药后4小时后取出血栓，称重。结果显示r-TFIP比低分子肝素更能抑制静脉血栓形成。
(2)抑制动脉血栓形成用气囊导管损伤家兔股动脉内皮细胞，并结扎损伤部分的血管，使局部血流阻滞而诱发动脉血栓形成。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组给予低分子肝素60-120抗Xa U/kg，治疗组分别给予r-TFIP 1.00-2.0mg/kg。实验结果表明，r-TFIP可使动脉血栓形成率下降，并呈剂量相关性。
(3)防治弥漫性血管内凝血(DIC)给家兔注射内毒素诱发DIC形成。与低分子肝素相比，静脉注射r-TFIP可明显纠正DIC所致的凝血功能异常和血栓形成的程度。
(4)冠状动脉成形术(PTCA)后血栓再形成的防治损伤狗的左冠状动脉前降支内皮细胞，诱发阻塞性冠脉血栓形成。应用r-TFIP作为重组链激酶的附加用药，能促进冠脉再通，抑制血栓再形成，减少残余血栓的重量，并呈剂量的依赖性。与低分子肝素相比，发生再通的时间较短，再灌注的持续时间延长，且残留的血栓重量较轻。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。所有这些变更和改进均包括在所附权利要求的保护范围之内。
新型重组组织因子抑制肽1的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜体部分即为突变部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATro Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT GCC GCA GCT GCC ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAC TAC TGT TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg
新型重组组织因子抑制肽2的核甘酸序列和氨基酸序列，序列中斜体部分即为突变部分。TCA GGC ACT ACA AAT ACT GTG GCA GCA TAT AAT TTA ACTSer Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu ThrTGG AAA TCA ACT AAT TTC AAG ACA ATT TTG GAG TGG GAATrp Lys Ser Thr Asn phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp GluCCC AAA CCC GTC AAT CAA GTC TAC ACT GTT CAA ATA AGCPro Lys Pro Val Asn Gln Val Thr Thr Val Gln Ile SerACT AAG TCA GGA GAT TGG AAA AGC AAA TGC TTT TAC ACAThr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys Cys Phe Tyr ThrACA GAC ACA GAG TGT GAC CTC ACC GAC GAG ATT GTG AAGThr Lys Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val LysGAT GTG AAG CAG ACG TAC TTG GCA CGG GTC TTC TCC TACAsp Val Lys Gln Thr Thr Leu Ala Arg Val Phe Ser TyrCCG GCA GGG AAT GTG GAG AGC ACC GGT TCT GCT GGGPro Ala Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala GlyGAG CCT CTG TAT GAG AAC TCC CCA GAG TTC ACA CCT TACGlu Pro Leu Tyr Glu Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro TyrCTG GAG ACA AAC CTC GGA CAG CCA ACA ATT CAG AGT TTTLeu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser PheGAA CAG GTG GGA ACA AAA GTG AAT GTG ACC GTA GAAGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val GluGAT GAA CGG ACT TTA GTC AGA AGG AAC AAC ACT TTC CTAAsp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe LeuAGC CTC CGG GAT GTT TTT GGC AAG GAC TTA ATT TAT ACASer Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu lle Tyr ThrCTT TAT TAT TGG AAA TCT TCA AGT TCA GGA AAG AAA ACALeu Tyr Tyr Trp Lys Ser Ser Ser Ser Gly Lys Lys ThrGCC AAA ACA AAC ACT AAT GAG TTT TTG ATT GAT GTG GATAla Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu Ile Asp Val AspAAA GGA GAA AAT GCA TGC TTC AGT GTT CAA GCA GTG ATTLys Gly Glu Asn Ala Cys Phe Ser Val Gln Ala Val IleCCC TCC CGA ACA GTT AAC CGG AAG AGT ACA GAC AGCPro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp SerCCG GTA GAG TGT ATG GGC CAG GAG AAA GGG GAA TTTPro Val Glu Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu PheAGAArg


本发明属生物技术领域，具体涉及一种新型具有抗凝和抗栓活性的重组组织因子抑制肽及其制备方法。本发明根据对全长组织因子的结构及其生化特性的分析，设计了新型重组组织因子抑制肽结构。将突变后组织因子抑制肽基因与原核表达载体pLY－4重组，转化蛋白酶缺陷型大肠杆菌，筛选高表达工程菌。工程菌发酵，高压破菌，包涵体溶解、复性和纯化而获得重组组织因子抑制肽。所得产品具有抗凝和抗栓活性，对于预防血栓性疾病的发生有明显的作用。