针对人cd22抗体的抗独特型抗体及其应用的制作方法[0002]应用单克隆抗体(MAb)进行靶向治疗并非是一种新奇或复杂的理念。然而，这一理念的实施涉及到多个学科知识技术的整合，包括抗体分子设计，细胞系优化，产业化生产，提纯，配方优化和各种质控检测，以确保所生产的单抗药物能够达到预期的临床效果。到目前为止，已有上百个针对各种适应症的治疗性单抗产品处于各个临床试验阶段。与之相对应，大量基于或衍生于抗体的理念和技术手段都随着单抗产业的发展而日新月异，以期扩大现有产品的应用范围。[0003]其中一个衍生物基于免疫网络学说，由Niels Jerne在1974年首先提出(参看JerneNK:1974.Ann Immunol 125C: 373-389)。Jerne 提出，免疫系统是一个通过抗独特型抗体互相作用来进行调节控制免疫反应的一个网络。这一认识后来被进一步拓展应用到抗独特型抗体的其它用途。抗独特型抗体通常也被叫做Ab2，是针对免疫抗体Abl (即免疫系统针对外来抗原产生的抗体)并对其独特位(抗体分子表面独特的抗原识别簇)具有特异性识别吸附能力的抗体。Ab2可以分成三个不同的类别:l)Ab2a识别原始Abl抗体上抗原结合部位(ABS)以外的独特位；2)Ab2i3识别抗原结合部位的位点并模拟其对应空间结构，从而形成外来抗原的“内影像”;3)Ab2 Y同样识别抗原结合部位的位点，但并不对外来抗原的结构进行模拟。[0004]一般认为，最具吸引力的是Ab2抗体类型中Ab2 0抗体，尤其是当试图用Ab2@抗体作为替代抗原发展针对自身抗原或惰性抗原的有效疫苗时，例如针对肿瘤特异抗原或肿瘤相关抗原的肿瘤疫苗，以及一些针对细菌，病毒和寄生虫等病原体的疫苗。但是，其他类型的Ab2抗体也不可忽视，它们可以用来发展有关的检测方法，协助具有药用价值的治疗性Ab I抗体的生产和临床效价评估。[0005]人⑶22抗原在成熟或恶性B细胞表面表达(Dr0ken et al.1989.LeucocyteTyping IV:White cell differentiation antigens.New York,Oxford UniversityPress.P.63-64)。⑶22是一种防止免疫系统过激反应或自身免疫疾病的调节分子(Hattaet al.1999.1mmunogenetics 49:280-286)。[0006]SM03是由鼠源抗体RFB4衍生的一种抗⑶22嵌合抗体(杨蕾等。2006。重组抗B细胞淋巴瘤嵌合抗体的构建及鉴定。中国新药杂志，15卷3期:186-192)，并已在非何氏淋巴瘤的治疗上进入临床试验阶段(Li et al.2012.Landes BioScience J 4(2):256-266)。由于SM03单抗以成熟B细胞为目标并抑制其功能，这一单抗产品应用已扩展到其它自身免疫疾病适应症的治疗，尤其是类风湿性关节炎(RA)和系统性红斑狼疮(SLE)。[0007]对SM03单抗运用框架重塑技术进行的人源化改造进一步推进了抗⑶22抗体的应用(梁瑞安，等。2006。应用抗体“框架重塑”技术构建人源化抗体fSM03。中国新药杂志，15卷21期:1832-1836)。经人源化改造的SM03单抗被命名为SM06。SM03和SM06针对人CD22抗原上的同一个位点，且具有类似的亲和力。然而，在氨基酸序列和结构上，SM03和SM06只有抗原识别部位相同，这一相同部分由它们各自的互补决定区(CDR)序列构成。[0008]SM03和SM06都能特异性识别吸附人⑶22抗原，而且结合后抗体-抗原复合体会发生明显的内化。这一特性使得对SM03和SM06单抗产品的生物活性检测变得十分困难。其它针对可内化抗原的抗体类产品也有类似的困难，例如恒定链，CD33等等。此外，临床药代动力学研究需要一个方便稳健的方法来测定游离SM03，SM06 (以及RFB4)和它们的各种衍生物(scFv单链抗体，Fab,双体抗体，免疫毒素，药物结合体等等)的含量，用以评估其血清半衰期。由于可溶性游离⑶22并不普遍，且外源性⑶22较不稳定，一种合适的针对SM03及其衍生物的抗独特型抗体就显得极具应用价值。

[0009]本发明所要解决的一个技术问题是提供针对人CD22抗体的抗独特型抗体，该抗独特型抗体特异性针对人CD22抗体(“CD22抗体族”)，可以吸附“CD22抗体族”，其吸附片段对“CD22抗体族”抗体分子可变区具特异性反应，其吸附片断具体对“CD22抗体族”抗体分子抗原结合部位(ABS)具特异性反应。该抗独特型抗体可以阻抑人CD22抗体与其自然配体人⑶22抗原结合。
[0010]本发明中所述人⑶22抗体均为含有如下3个抗体重链互补决定区和3个抗体轻链互补决定区，且能够与人⑶22抗原特异性结合的抗体:重链OTR1的序列是IYDMS、重链CDR2的序列是YISGGGTTYYPDTVKG、重链CDR3的序列是HSGYGSSYGVLFAY，轻链CDR1的序列是RASQDISNYLN、轻链CDR2的序列是YTSILHS、轻链CDR3的序列是QQGNTLPWT。所述人CD22抗体包括鼠源抗体(如RFB4)，嵌合抗体(如SM03)、人抗体、和人源化抗体(如SM06)以及它们的各型衍生物如scFv单链抗体，双抗体，双特异性抗体，抗体结合体及其他各种形式抗体融合蛋白等，统称“CD22抗体族”。
[0011]本发明所提供的针对人CD22抗体的抗独特型抗体，它包括3个抗体重链互补决定区和3个抗体轻链互补决定区(图3中的6个框区域)；所述3个抗体重链互补决定区的氨基酸序列分别如序列表中序列I的第31-35位(⑶R1X第50-66位(⑶R2)和第99-106位(CDR3),所述3个抗体轻链互补决定区的氨基酸序列分别如序列表中序列I的第154-168位(CDR1)、第 184-190 位(CDR2)和第 223-231 位(CDR3X
[0012]其中，该抗独特型抗体的上述6个互补决定区形成与人CD22抗体的独特型部分特异结合的结构。下述实施例1的实验证明，含有上述6个互补决定区的单链抗体可与3种人⑶22抗体(RFB4、SM03和SM06)特异性结合，这3种人⑶22抗体的序列相同部分只有3个抗体重链互补决定区和3个抗体轻链互补决定区。所述人CD22抗体为含有序列表中序列8-10所示的3个抗体重链互补决定区和序列表中序列11-13所示的3个抗体轻链互补决定区的能与人CD22特异性结合的抗体，如RFB4、SM03和SM06。其中，序列8为CDR1的序列，序列9为CTR2的序列，序列10为CTR3的序列，序列10为CTR1的序列，序列11为CTR2的序列，序列12为OTR3的序列。
[0013]进一步，所述针对人⑶22抗体的抗独特型抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中序列I的第1-116位，所述轻链链可变区的氨基酸序列如序列表中序列I的第131-240位。[0014]进一步，所述针对人CD22抗体的抗独特型抗体具体可为:
[0015]a)重链的氨基酸序列是序列表中的序列2，轻链的氨基酸序列是序列表中的序列3 (下述实施例3的包含轻重链恒定区序列的抗独特型鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子IdmG2a/k)；
[0016]b)将序列表中的序列2中除所述3个抗体重链互补决定区外的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加，和/或将序列表中的序列3中除所述3个抗体轻链互补决定区外的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的针对人CD22抗体的抗独特型抗体，优选为将所述序列2中除第1-117位的重链可变区外的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加，和/或将所述序列3中除第1-111位的轻可变区外的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的针对人CD22抗体的抗独特型抗体；
[0017]c)序列表中的序列I所示的单链抗体(下述实施例1和2中图3所示的单链抗体)，或在序列表中序列I的氨基端或羧基端加上组氨酸标签得到的融合蛋白；
[0018]d)将序列表中的序列I除所述3个抗体重链互补决定区和所述3个抗体轻链互补决定区外的氨基酸序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的针对人CD22抗体的抗独特型抗体，优选为将所述序列表中序列I的第117-130位所示的连接肽序列进行氨基酸残基的取代、缺失或添加得到的针对人CD22抗体的抗独特型抗体；
[0019]e)重链的氨基酸序列是序列表中的序列6 ;轻链的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述实施例5的IdGmFdA,图14显示的是IdGmFdA的重链氨基酸序列)；
[0020]f )重链的氨基酸序列是序列表中的序列7 ;轻链的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述实施例5的IdGmFdG,图15显示的是IdGmFdG的重链氨基酸序列)；
[0021]g)重链的氨基酸序列是序列表中的序列4 ;轻链的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述实施例5的IdGmD，图12显示的是IdGmD的重链氨基酸序列)；
[0022]h)重链的氨基酸序列是序列表中的序列5 ;轻链的氨基酸序列是所述序列表中的序列3 (下述实施例5的IdDmD，图13显示的是IdDmD的重链氨基酸序列)。
[0023]其中，序列表中的序列I由240个氨基酸残基组成，序列表中的序列2由447个氨基酸残基组成，序列表中的序列3由219个氨基酸残基组成，序列表中的序列4由502个氨基酸残基组成，序列表中的序列5由408个氨基酸残基组成，序列表中的序列6由305个氨基酸残基组成，序列表中的序列7由264个氨基酸残基组成。
[0024]其中，针对人CD22抗体的抗独特型抗体可以多种形态表达为附膜蛋白，这些形态包括:跨膜IgD抗体(下述实施例5的IdGmD和IdDmD)，或与糖蛋白A (下述实施例5的IdGmFdA)或GPI蛋白融合(下述实施例5的IdGmFdG)的单链抗体scFv,Fab,Fab’，F(ab’)2。
[0025]编码上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的核酸分子属于本发明的保护范围。
[0026]其中，所述核酸分子可以是DNAjB cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
[0027]所述核酸分子具体可为如下I) -6)中任一所述的基因:
[0028]I)上述a)所述抗体的重链的编码序列是序列表中的序列9，上述a)所述的抗体的轻链链的编码序列是序列表中的序列10 ；
[0029]2)上述c)所述抗体的编码序列是序列表中的序列8 ；[0030] 3)上述e)所述抗体的的重链的编码序列是序列表中的序列13，上述e)所述抗体的轻链链的编码序列是序列表中的序列10 ；
[0031]4)上述f)所述抗体的的重链的编码序列是序列表中的序列14，上述f)所述抗体的轻链链的编码序列是序列表中的序列10 ；
[0032]5)上述g)所述抗体的的重链的编码序列是序列表中的序列11，上述g)所述抗体的轻链链的编码序列是序列表中的序列10 ；
[0033]6)上述h)所述抗体的的重链的编码序列是序列表中的序列12，上述h)所述抗体的轻链链的编码序列是序列表中的序列10。
[0034]其中，序列表中的序列I由240个氨基酸残基组成，由序列表中的序列8的DNA编码，序列8由720个核苷酸组成；序列表中的序列2由447个氨基酸残基组成，由序列表中的序列9的DNA编码，序列9由1344个核苷酸组成；序列表中的序列3由219个氨基酸残基组成，由序列表中的序列10的DNA编码，序列10由660个核苷酸组成；序列表中的序列4由502个氨基酸残基组成，由序列表中的序列11的DNA编码，序列11由1509个核苷酸组成；序列表中的序列5由408个氨基酸残基组成，由序列表中的序列12的DNA编码，序列12由1227个核苷酸组成；序列表中的序列6由305个氨基酸残基组成，由序列表中的序列13的DNA编码，序列13由918个核苷酸组成；序列表中的序列7由264个氨基酸残基组成，由序列表中的序列14的DNA编码，序列14由795个核苷酸组成。
[0035]下述al、a2或a3的生物材料也属于本发明的保护范围:
[0036]al.含有上述任一种核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或重组细胞系；
[0037]a2.表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组表达载体、重组微生物或重组细胞系；
[0038]a3.表达任一种基因的重组表达载体、重组微生物或重组细胞系。
[0039]上述生物材料中，al所述的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的DNA，该DNA不但可包括启动上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体基因转录的启动子，还可包括终止上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。a2和a3所述的重组微生物具体可为酵母，细菌，藻和真菌。a2和a3所述的重组细胞系不包括植物的繁殖材料，具体可为细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系(细胞株)。
[0040]本发明还提供了上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的下述多个用途:[0041 ] bl.检测人⑶22抗体浓度的试剂，其活性成分为上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体；
[0042]b2.检测由人CD22抗体引起的人抗鼠抗体反应的试剂，其活性成分为上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体；
[0043]b3.检测由人CD22抗体引起的人抗嵌合抗体反应的试剂，其活性成分为上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体；
[0044]b4.检测由人CD22抗体引起的人抗人抗体反应的试剂，其活性成分为上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体；
[0045]b5.检测人CD22抗体介导的补体依赖细胞毒反应的试剂，其活性成分为细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系；
[0046]b6.检测人CD22抗体介导的抗体依赖细胞介导细胞毒反应的试剂，其活性成分为细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系；
[0047]bl.检测人⑶22抗体生物活性的试剂，其活性成分为细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系；
[0048]b8.上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体在制备检测人⑶22抗体浓度试剂中的应用；
[0049]b9.上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体在制备检测由人⑶22抗体引起的人抗鼠抗体反应试剂中的应用；
[0050]bl0.上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体在制备检测由人⑶22抗体引起的人抗嵌合抗体反应试剂中的应用；
[0051]bll上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体在制备检测由人⑶22抗体引起的人抗人抗体反应试剂中的应用；
[0052]bl2.细胞膜表面表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系在制备检测人CD22抗体介导的补体依赖细胞毒反应试剂中的应用；
[0053]bl3.细胞膜表面表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系在制备检测人CD22抗体介导的抗体依赖细胞介导细胞毒反应试剂中的应用；
[0054]bl4.细胞膜表面表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系在制备检测人CD22抗体生物活性试剂中的应用；
[0055]bl5.检测人CD22抗体对肿瘤细胞的穿透性和/或吸附性试剂，其活性成分为权利要求1-3中任一所述抗体。
[0056]bl6.上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体在制备检测人⑶22抗体对肿瘤细胞的穿透性和/或吸附性试剂中的应用。
[0057]其中，上述bl和b8具体可为将上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体作为诊断试剂来监测免疫治疗中患者血液中人CD22抗体的含量，监测所注射人CD22抗体药物的药代动力学行为。可按照如下方法检测样品血清中“CD22抗体族”(人CD22抗体)抗体
含量:
[0058]I)用上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体包被ELISA酶标板，上述任一种针对人⑶22抗体包括scFv单链抗体，或完整IgG，或鼠源IgG2a/kappa种型，及其它同种型；
[0059]2)在酶标板上加入待测血清样本；
[0060]3)在酶标板上加入诸如过氧化物酶标记的抗人Fe特异性抗体这样的二抗以及；
[0061]4)根据吸附的二抗多少测得待测血清中的抗人⑶22抗体含量。
[0062]上述b7和bl4中，细胞膜表面表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系可以通过抗体介导，发生补体依赖细胞毒反应(CDC)或抗体依赖细胞介导细胞毒反应(ADCC)，用以快速估测人⑶22抗体(如SM03或SM06)的生物活性，从而达到质量控制的目的。利用细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系，通过补体依赖细胞毒反应评估人⑶22抗体生物学活性的检测方法，具体可包含以下步骤:[0063]I)将细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系与抗CD22抗体共同孵育；
[0064]2)在混合物中加入补体蛋白；
[0065]3)孵育适宜时间后量度其补体依赖细胞毒效应(⑶C)的效果。
[0066]利用细胞膜表面表达上述任一种针对人CD22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系，通过抗体依赖细胞介导细胞毒效应评估人CD22抗体生物学活性的检测方法，具体可包含以下步骤:
[0067]I)将细胞膜表面表达上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体的重组细胞系与抗CD22抗体共同孵育；
[0068]2)加入外周血单核细胞(PBMC);
[0069]3)孵育适宜时间后量度其抗体依赖细胞介导细胞毒效应(ADCC)的效果。
[0070]上述b2-b4、b9_bll具体可为将上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体作为HAHA, HACA或HAMA等抗抗体免疫反应研究中的阳性对照。由于这些抗抗体反应可能会影响病人的临床结果(Gruber van Haarlem et al.2000.Cancer Res.60:1921-1926),或与非预期的过敏反应相关，导致显著的药代动力学行为改变及影响注射抗体药物的体内分布，因此对其监测会对抗体免疫治疗的治疗选项产生重要影响。本发明所提供的检测注射了嵌合或人源化抗人CD22单克隆抗体的个体中由人CD22抗体引起的人抗嵌合抗体反应(HACA)或人抗人抗体反应(HAHA)的方法包含如下步骤:
[0071]I)从接受注射的个体收集血清样本；
[0072]2)在ELISA酶标板上包被⑶22抗原，同时加入灵敏浓度的抗⑶22游离抗体，加入不同倍数稀释的血清样本，不加入血清样本的孔作为阴性对照，加入一定浓度抗CD22独特型抗体的孔作为阳性对照；
[0073]3)清洗后加入HRP标记的抗人IgG Fe 二抗，检测灵敏浓度的抗⑶22抗体对⑶22抗原的吸附信号；
[0074]4)检测血清样本中抗CD22抗独特型抗体的存在与否，如抗CD22抗独特型抗体存在则佐证了个体中HACA或HAHA反应的发生。
[0075]上述bl5和bl6中，可将上述任一种针对人⑶22抗体的抗独特型抗体(如下述实施例3的包含轻重链恒定区序列的抗独特型鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子，)应用肿瘤组织切片免疫组织化学分析，研究“⑶22抗体族”药物对肿瘤细胞的穿透性和/或吸附性。
[0076]本发明提供了一种特异性辨识抗人⑶22抗体(包括鼠源抗体(如RFB4)，嵌合抗体(如SM03)、人抗体、和人源化抗体(如SM06)以及它们的各型衍生物如scFv单链抗体，双抗体，双特异性抗体，抗体结合体及其他各种形式抗体融合蛋白等，统称“CD22抗体族”)抗原结合部位(ABS)的抗独特型抗体，即针对人CD22抗体的抗独特型抗体。本发明提供的针对人CD22抗体的抗独特型抗体，可应用于辨识及评估“CD22抗体族”抗体的浓度和生物活性，并用于临床定量分析血清中的“CD22抗体族”抗体含量。本发明还可应用于检测“CD22抗体族”单抗药物临床试验中病人可能出现的人抗鼠抗体反应(HAMA)，人抗嵌合抗体反应(HACA)和人抗人抗体反应(HAHA)。同时，还提供了构建能表达针对人CD22抗体的抗独特型抗体的细胞系的方法；并将此类细胞用于检测“CD22抗体族”单抗产品介导的补体依赖细胞毒反应(CDC)和/或抗体依赖细胞介导细胞毒反应(ADCC)的，实现了单抗产品的生物活性检测和评估。



[0077]图1为表达scFv单链抗体的噬菌体#1_#3对鼠源⑶22抗体(RFB4)，人鼠嵌合⑶22抗体(SM03)，人源化⑶22抗体(SM06)的特异性吸附。
[0078]图2A为噬菌体#1_#3所表达的重链互补决定区(⑶R)序列。
[0079]图2B为噬菌体#1_#3所表达的轻链CDR序列。 [0080]图3为对RFB4，SM03，SM06具有特异性识别吸附的噬菌体#3所展示的scFv序列完整序列。所框区域为补充决定区。scFv单链抗体构成为重链可变区-连接序列-轻链可变区。所用连接氨基酸序列为G4-S-G-S-G-S-S-G4。
[0081]图4为噬菌体#3表达的可容性scFv可以在流式细胞计数实验中抑制SM03抗体对Raji细胞的吸附。从左至右的三个峰分别为空白对照、SM03+scFv (phage#3)和SM03。
[0082]图5为采用噬菌体#3表达的可容性scFv测得的SM03治疗的淋巴瘤患者药代动力学表现(360mg/m2剂量组，静脉注射，每周一次，连续给药4周)。
[0083]图6为表达鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白抗独特型抗体IdmG2a/的可扩增DNA载体。
[0084]图7为IdmG2a/k的提纯抗体在还原和非还原情况下的SDS-PAGE电泳图。图中，I和2为还原电泳结果,3为分子量标准(BenchMark?蛋白分子量标准,美国Invitrogen公司产品，批次:688736)，4和5为非还原电泳结果。
[0085]图8为IdmG2a/k可以被SM03特异性识别，而其它抗体不能吸附(⑶20抗体(hAnt1-CD20)，CD147 抗体(hAnti_CD147)，TNF 抗体(Infliximab))。
[0086]图9为流式细胞技术结果显示抗独特型鼠源IgG抗体IdmG2a/k可以有效的阻抑SM03吸附Raji细胞表面的⑶22抗原。
[0087]图10为鼠源⑶22抗体RFB4，嵌合抗体SM03及运用框架重塑技术的人源化抗体SM06都可以与HRP标记的SM03抗体竞争吸附到抗独特型鼠源IgG抗体IdmG2a/k
[0088]图11为运用SM03单抗产品进行治疗的红斑狼疮患者药代动力学表现。SM03的血药浓度由ELISA方法测得，IdmG2a/k作为固相捕捉抗体。
[0089]图12为将鼠源IgD的跨膜区序列与“鼠源抗独特型IgG抗体”的CH3区域融合得到的跨膜针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdGmD的重链氨基酸序列。
[0090]图13为将IgG2a重链用鼠源IgD序列代替得到跨膜的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdDmD的重链氨基酸序列。
[0091]图14为通过附膜Fab-糖蛋白融合蛋白的形式表达跨膜的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdGmFdA的重链氨基酸序列。
[0092]图15为以Fab-GPI固定融合蛋白的形式表达“鼠源抗独特型IgG”抗体的针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdGmFdG的重链氨基酸序列。
[0093]图16为抗独特型鼠源IgG抗体各种融合蛋白形式的转染细胞系膜上表达情况。
[0094]从上至下的五个图片依次为没有加入SM03的SP2/0细胞体系、加入SM03至终浓度为I μ g/ml的SP2/0细胞体系、加入SM03至终浓度为0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表达IdDmD的重组工程细胞体系、加入SM03至终浓度为0.1 μ g/ml,0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表达IdGmFdA的重组工程细胞体系、加入SM03至终浓度为0.1 μ g/ml、0.1 μ g/ml和I μ g/ml的表达IdGmFdG的重组工程细胞体系。
[0095]图17为SM03抗体介导针对跨膜表达各种抗独特型鼠源IgG抗体融合蛋白转染细胞系的补体依赖细胞毒反应(OTC)的比较(从上至下的三个图片依次为IdGmD、IdGmFdA、IdGmFdG)

[0097]本文中“免疫球蛋白”这一定义是指由一条或多条多肽链构成的，大部分由免疫球蛋白相关基因编码的蛋白质分子。已破解的免疫球蛋白基因编码包括kappa, lamda, alpha，gamma (IgGl, IgG2, IgG3, IgG4), delta, epsilon和mu这些恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。完整的免疫球蛋白“轻链”(由214个氨基酸构成，分子量约25Kd)由氨基端的可变区基因(约110个氨基酸)和羟基端的kappa或Iamda恒定区基因编码构成。类似地，完整的免疫球蛋白“重链”(由446个氨基酸构成，分子量约50Kd)由可变区基因编码(约116个氨基酸)和前文所描述其中一个恒定区基因编码构成，如gamma恒定区基因(约300个氨基酸)编码构成IgG分子。
[0098]除非特别指明，本文中所用的“抗体”这一定义被广泛用来指代完整抗体分子以及其衍生物。这些衍生物至少包含了一段来自免疫球蛋白轻链或重链的可变区片断，并包含诸如F(ab’)2, Fab, Fab’，Fd, Fabc, scFv,双抗体,单一抗体轻链,单一抗体重链,抗体链嵌合融合物，双特异抗体以及其他类似分子这样的抗体分子片断。
[0099]本文中所用的“嵌合抗体”这一定义是指由非人类属种生物的免疫球蛋白轻重链可变区与人类免疫球蛋白分子恒定区重组设计而成的蛋白分子。
[0100]本文中所用的“人源化”这一定义是指仅来自非人类属种生物的免疫球蛋白分子可变区互补决定区(CDR)的部分保留，其余的主要可变区部分及全部恒定区部分均来为人源，经过重组设计而成的蛋白分子。
[0101]本文中所用的“独特型”这一定义是指抗体分子上决定对抗原特异性的特殊片断。独特型片断位于抗体Fab部分，对于它的描述通常基于抗体分子重链轻链的共同参与形成抗原结合部位。
[0102]本文中所用的“同种型”这一定义是指由免疫球蛋白分子的抗原特异性决定，根据重链类别和亚类，以及轻链型别所分的免疫球蛋白分子类型及其亚型。例如，IgG的四个同种型为 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4O
[0103]本文所描述的“⑶22抗体族”由鼠源抗体RFB4衍生而来。它所衍生的嵌合抗体(SM03)和人源化抗体(SM06)与原始鼠源抗体一样，针对人CD22抗原上的B位点具特异性。运用SM03治疗B细胞淋巴瘤和其他自身免疫疾病的临床试验已经起步。在临床实践中，为了满足临床上测定血清中所注射的“CD22抗体族”产品(如SM03单抗)含量的需求，构建并定性了一种抗独特型抗体，作为ELISA试剂来测定患者血清中的“CD22抗体族”产品浓度。此外，所产生的抗独特型抗体还可以用在ELISA方法中衡量HACA或HAHA反应，亦或作为对照抗体及用作诊断试剂估测患者血清中的竞争性抗体。
[0104]单链抗体形式的抗独特型抗体由经SM03免疫的小鼠，并用噬菌体展示的方法产生。具体方法为从注射抗CD22嵌合抗体SM03的小鼠身上提取脾脏细胞，并分离mRNA，然后简并侧翼可变区引物扩增轻重链可变区序列。之后按照标准步骤将所得可变区序列引入scFv单链抗体噬菌体展示库。经过几轮用SM03和RFB4抗体进行的筛选淘汰后，选出针对SM03，RFB4和SM06具特异性的噬菌体，且所选噬菌体展示相应的可变区序列。在展示抗体可变区序列的噬菌体中，选择对鼠源，嵌合和人源化“CD22抗体族”具有最高亲和力的展示噬菌体。
[0105]抗独特型抗体序列最初在大肠杆菌中以scFv单链抗体包含体的形式表达，之后会变性及再折叠；具活性的scFv单链抗体被用作ELISA试剂检测临床试验中的血清SM03含量。简要步骤如下，就是用再折叠的抗独特型scFv单链抗体(scFv)包被ELISA酶标板，再将SM03治疗的患者血清稀释后加入，经过孵育，清洗，患者血清中的SM03抗体就会与所包被的抗独特型scFv单链抗体结合,其特异性结合可以用HPR标记的羊抗人IgG-Fc特异性抗体(美国Jackson ImmunoResearch公司产品)显色。然而，抗独特型scFv单链抗体有不稳定的倾向，并且从细菌包含体中产生的方式会导致蛋白变性和再折叠的多样性，使检测结果一致性不高。此外，抗独特型scFv单链抗体的不稳定性，使得它的储存和随后的验证批次制备变得十分困难。
[0106]而另一方面，众所周知，完整的免疫球蛋白分子能够在合适的储存条件下保持数月乃至数年的稳定性，其抗体活性和质量也不会发生明显变化。为了创建稳定且结果一致的检测方法来估测血清中的CD22抗体，以及HACA和HAHA反应，抗独特型scFv单链抗体的可变区序列被用来构建一种完整地免疫球蛋白分子。由于“CD22抗体族”中的嵌合抗体和人源化抗体都具有人IgGl重链和kappa轻链的恒定区序列，它们因此可以被ELISA通常所用的HRP标记抗人IgG Fe特异性抗体(或类似的结合体)所识别。因此，所设计的抗独特型抗体免疫球蛋白分子不应带有会引起交叉反应的人IgG恒定区序列。鼠源IgG2a/kappa抗体(鼠源抗独特型IgG抗体)恒 定区序列不会与抗人Fe抗体发生交叉反应，所以被选定来构建完整的抗独特型抗体免疫球蛋白分子。需要注意的是，其它同种型或来自其它物种的恒定区序列也可采用。根据所设计的抗独特型抗体免疫球蛋白，产生了产率达30ug/ml的表达细胞系。由于产生表达细胞系所采用的表达载体带有可扩增的DHFR基因，这一产率可以在有需要的情况下按照一般的扩增-克隆方法进一步增加。然而，现阶段产率已经足够满足产生一致批次的鼠源抗独特型IgG抗体，并用于药代动力学研究及HACA或HAHA检测。简要步骤如下，就是用鼠源抗独特型IgG抗体包被ELISA酶标板，再加入用“CD22抗体族”抗体药物治疗的患者血清，经过孵育，不与“鼠源抗独特型IgG抗体”吸附的蛋白会被清洗干净。而血清中的抗⑶22抗体会特异性地与所包被的“鼠源抗独特型IgG抗体”结合，并用HRP标记羊抗人IgG Fe特异性抗体显色。由于“鼠源抗独特型IgG抗体”的鼠源恒定区序列并不会检测用的HRP标记抗体发生交叉反应，这一检测方法并不会发生高本底信号的问题。这一检测方法经验证具有高度可重复性，灵敏度和特异性。同样的方法被拓展应用到估测“CD22抗体族”的辨识度和亲和力。应用“鼠源抗独特型IgG抗体”作为阳性对照，建立血清样本的HACA和HAHA的Biacore分析方法，实现患者血清抗抗体免疫反应也成为可能。另外，“鼠源抗独特型IgG抗体”也可以被应用肿瘤组织切片免疫组织化学分析，研究“CD22抗体族”药物对肿瘤细胞的穿透性和吸附性。能够特异性结合目标抗体的“鼠源抗独特型IgG抗体”的产生，为临床意义上高灵敏度地评估注射目标抗体药物的安全性和药代动力学性质提供了原料试剂。本发明所构建的“鼠源抗独特型IgG抗体”因此而获证为一种具重要实用价值的诊断实验试剂，用于研究接受SM03免疫治疗的患者临床样本。
[0107]本发明的一个方面是为检测“鼠源抗独特型IgG抗体”对“CD22抗体族”对其抗原吸附的阻抑作用提供方法。另一个方面是为检测“鼠源抗独特型IgG抗体”捕捉并检测所吸附的独特型抗体的能力提供方法。更深一层含义为检测“鼠源抗独特型IgG抗体”对其独特型抗体(抗CD22抗体)的吸附能力提供方法。然而，另一方面也是为检测“CD22抗体族”在血清样本中的含量提供方法。本发明也同样指向一个用本专利所描述抗体进行检测HAMA, HACA及HAHA反应的方法。
[0108]本发明的另一种应用是利用抗独特型抗体构建非内化跨膜表达SM03-特异吸附片断工程细胞系。所建细胞系能用来建立评估SM03单抗及其衍生物如RFB4，SM06等生物功效的检测方法。这一方法的建立意味着用类似方法实现吸附可内化表面抗原的抗体生物学功效的检测具有普遍意义。
[0109]以下实验例证为说明本发明用途所列，但并不代表本发明的局限于此类应用。
[0110]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0111]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0112]实施例1、以单链抗体形式存在的针对人CD22抗体的抗独特型抗体
[0113]本实施例运用噬菌体展示库技术获得抗SM03抗独特型抗体的可变区轻重链序列，进一步制备得到针对人CD22抗体的抗独特型单链抗体——噬菌体#3表达的可溶性ScFv0具体步骤如下:
[0114]1、利用注射SM03免疫接种的小鼠制备噬菌体展示库
[0115]约6周大的雌性Balb/c小鼠被免疫接种，方法为按照标准免疫接种步骤(参看《InAntibodies:A Laboratory Manual》1988 年由美国 Cold Spring Harbor Laboratory 出版)腹膜内注射IOOug SM03单抗，并用200uL完全弗氏佐剂(美国Sigma-Aldrich公司产品)乳化。第二次及第三次免疫接种分别在相隔14天和35天后进行，方法均为腹膜内注射100ugSM03单抗(中国抗体制药有限公司)，配合200uL不完全弗氏佐剂进行乳化(美国Sigma-Aldrich 公司产品)。
[0116]测定小鼠血清中的SM03抗体滴度后,免疫接种39天后的小鼠脾脏细胞被用来分离全RNA及制备cDNA(使用Superscript II试剂盒,美国Invitrogen公司产品)。然后根据相关文献中合成简并引物，利用PCR扩增免疫球蛋白可变区基因序列(Cheng et al.2005.Biochem Biophys Res Commun 338:1654-1660)。随后，按照美国 Amersham 公司的重组曬菌体抗体系统产品指南，构建可变区片断单链抗体(scFv)曬菌体展示库。
[0117]参照相关文献进行可变区片断scFv单链抗体噬菌体展示库和丝状噬菌体的扩增后，用SM03单抗和鼠源CD22单抗RFB4 (Ancell, Cat: 171-820)进行筛选淘汰(McWhirteret al.2006.PNAS 103:1041-1046)。简要步骤如下，将相同含量(100ug/ml)的SM03或鼠源RFB4抗体用碳酸氢盐缓冲液(15mM Na2CO3, 35mM NaHCO3)进行包被，用生物筛选的方法筛选浓度为IO12的噬菌体。经过2小时轻微震荡条件的室温孵育，所吸附的scFv噬菌体用IOOuL的0.1M甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.2经10分钟的孵育洗脱，再用IOuL的IM Tris-HCl,pH8.0的中和缓冲液中和。这一筛选过程重复四次，并纪录每次筛选前后的噬菌体滴度。
[0118]在筛选过程存活的噬菌体经拯救，其吸附特异性用噬菌体-ELISA的方法进行评估，用抗CD22抗体RFB4，SMO3及SMO6 (中国抗体制药有限公司)，以及其它对照抗体作为抗原进行进一步筛选。方法简单描述如下，在96孔ELISA酶标板中，分别包被RFB4，SM03,SM06，嵌合抗TNF抗体以及BSA(使用50uL pH9.6的碳酸氢盐包被缓冲液，包被量为Iug ;经4°C孵育过夜后，用200uL pH8.0的硼酸缓冲液进行冲洗；再同样用硼酸缓冲液在37°C封闭1小时)，对SM03有最高吸附亲和力的三个噬菌体克隆(IOOuL的上清液)被加入孔中37°C孵育1小时。经过5次pH8.0的硼酸缓冲液的冲洗，HRP标记的抗M13小鼠抗体(Amersham公司产品)经1:3000稀释后加入。经过37°C孵育I小时后，使用IOOuL的O-对苯二胺(OPD)反应液(IOmgOPD溶于IOmL含8uL30%双氧水溶液的柠檬酸磷酸盐缓冲液，pH5.0)进行显色。筛选结果如图1所示，所选的三个scFv展示噬菌体(噬菌体#1_#3)都可以吸附RFB4，SM03和SM06 (鼠源，嵌合及人源化的CD22抗体)但不能吸附其他抗体(抗TNF抗体(英夫利昔单抗))或对照蛋白(BSA)。由于RFB4，SM03和SM06的序列相同部分只有目标抗体上的CDR部分，或抗原结合部位，这一结果说明所选的三个scFv展示噬菌体都对SM03的独特型部分具有特异性。
[0119]2、可特异性吸附SM03抗原结合部分的scFv展示噬菌体可变区序列的测定
[0120]所选展示噬菌体的scFv编码DNA序列用桑格测序法进行测序。对应抗体可变区的DNA序列非常类似，唯有在框架片断或CDR3片断的零星位置有部分差异。图2展示了所选噬菌体所展示的轻重链序列中的CDR片断序列，噬菌体#1_#3所展示的scFv的重链的3个⑶R完全相同，噬菌体#1_#3所展示的scFv的轻链的⑶Rl和⑶R2完全相同，唯有噬菌体#2所表达的轻链⑶R3区域有一个氨基酸(图2中下划线标记)。
[0121]3、展示的scFv序列的噬菌体#3能够阻抑SM03抗体吸附Raji细胞
[0122]由于噬菌体#3显示出了相对较高的吸附亲和力，其单链序列被回复成DNA编码并运用分子克隆技术构建了 scFv细菌表达载体。噬菌体#3所展示的scFv序列完整序列如图3。噬菌体#3所展示的scFv序列编码DNA (序列表中序列8)被连入pET3a载体(Novagen Cat:69418)载体并转染入BL21 (DE3) pLys感应细胞进行表达。scFv的氨基端连有一个His-tag基因已便于表达后的提纯。经过IPTG诱导表达，含有scFv的包含体经收集，变性(使用含6M盐酸胍，20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH7.4的缓冲液)，折叠和用HItrapChelating HP分离柱按产品说明进行提纯。简要步骤如下，含His-tag的scFv经变性后，在Ni2+存在情况下吸附到HItrap Chelating HP分离柱。使用按照梯度逐步降低浓度的盐酸胍缓冲液(含20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH7.4)进行冲洗直到没有残留的盐酸胍存留。再以几个柱床体积的5-40mM的咪唑缓冲液(含20mM磷酸钠，0.5M氯化钠，pH7.4)进行冲洗。洗脱样本合并，其中的蛋白可以用SDS-PAGE电泳的方法进行检测。氨基酸序列测定结果表明，纯化后所得蛋白为序列表中序列I的第I位氨基酸残基的氨基端连上His-tag而得到的融合蛋白，该融合蛋白即为针对人CD22抗体的抗独特型单链抗体，以下称为噬菌体#3表达的可溶性scFv。
[0123]噬菌体#3表达的可溶性scFv可用来阻抑SM03抗体吸附Raji细胞表面表达的CD22抗原。实验简要步骤如下:将PBS清洗过的Raji细胞与SM03抗体共同孵育，同时加入不同浓度的噬菌体#3所表达的可溶性scFv，将仅加入SM03抗体的Raj i细胞作为对照，不加入任何试剂的Raji细胞作为空白对照(blank);经半小时室温孵育及PBS清洗后，所有样本中加入1:50稀释的荧光标记的羊抗人IgG Fe特异性抗体作为二抗，室温孵育半小时后经清洗，运用Beckman突光分析系统分析其突光信号。结果如图4,表明加入100ug/ml的的组别，其流式细胞计数的结果显示明显的荧光信号下降，显示噬菌体#3表达的可容性scFv可以有效得抑制SM03抗体吸附到Raji细胞表面的⑶22抗原。
[0124]实验例2、利用实施例1中噬菌体#3表达的可溶性scFv进行SM03临床试验中的药代动力学研究
[0125]由于实施例1中噬菌体#3表达的可容性scFv对SM03的特异性，因此可以用来发展相应的检测方法来测定接受抗CD22抗体治疗的患者血清中的抗体浓度，特别是协助临床实践所需的药代动力学研究。用实施例1中噬菌体#3表达的可容性scFv包板96孔ELISA酶标板。经过BSA封闭，清洗，接受SM03治疗的患者各个采血点血清经过稀释后加入孔内。经过37°C孵育2小时和充分清洗,HRP标记羊抗人Fe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)经1:4000稀释后加入孔内。酶标板再经过I小时的37°C孵育后，清洗5次，用TMB显色液显色，显色信号按照标准ELISA检测方法用450nm波长读数，并以此计算所捕获的SM03浓度。
[0126]图5展示了 SM03的典型药-时曲线，所用方法如上所述。患者血清样本来自接受抗⑶22抗体SM03治疗的恶性淋巴瘤患者，380mg/m2剂量组别，每周I次，连续给药4周。血清样本从给药前后的不同时间点采集。
[0127]实施例3、以鼠源IgG2a/kappa免疫球蛋白分子形式存在的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdmG2a/k
[0128]实施例1中噬菌体#3表达的可容性scFv制备需要细菌培养，诱导表达和包含体收集，蛋白变性折叠以及His-tag提纯等一系列复杂的步骤。此外，scFv较不稳定且不易储存。为了产生既保留实施例1中噬菌体#3表达的可容性scFv吸附特异性，又能被标准步骤提纯及稳定易储存的分子，实施例1中噬菌体#3表达的可溶性scFv重链可变区(VH)编码DNA和轻链可变区(VK)编码序列用PCR扩增并运用分子克隆技术整合进可扩增的表达载体pldmkappa-VK及pldmlgG-VH,它还包含了鼠源kappa轻链及IgG2a重链的恒定区部分序列(如图6所示)。
[0129]该可扩增表达载体的构建方法是将编码实例I中溶性scFv重链可变区(VH)编码DNA和轻链可变区(VK)编码序列连接到各自相应的鼠源kappa轻链及IgG2a重链可扩增表达载体的恒定区。其鼠源kappa轻链表达载体PIdmkappa-VK是一个约IOKb的表达载体。它源自于载体 pSVgpt(Mulligan&Berg 1981.PNAS 78:2072-2076),它包含了一个上游的 IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VK段的BamHI/Bglll和XbaI的克隆位点，和连着内含子(intron)的小鼠kappa轻链恒定区的基因序列。在轻链恒定区基因序列的下游，放置了一个用SV40启动子表达的hygromycin选择标记。轻链表达载体的构建方法如下^fpSVgpt的gpt选择标记替换为hygromycin选择标记,得到重组载体pSVhyg。在pSVhyg的EcoRI和BamHI的识别位点间插入319bp的Ig增强子并在BamHI位点前插入一个XbaI限制性内切酶识别位点，得到重组载体pSVhyg-1g。在pSVhyg-1g的BamHI和SacI识别位点间插入199bp的kappa增强子，得到重组载体pSVhyg_Ig_kappa。在pSVhyg_Ig_kappa的限制性内切酶SacI和BamHI识别位点间插入1.2Kb的连着内含子(intron)的鼠源kappa轻链恒定区片段，在BamHI和XbaI限制性内切酶位点之间连入噬菌体#3所展示的VK序列，得到鼠源kappa轻链表达载体P Idmkappa-VK。其中，319bp的Ig增强子核苷酸序列是自GeneBankAccession Number:K01901的5’末端的第I至第319脱氧核苷酸。199bp的kappa增强子核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:K01325的5’末端的第I至199脱氧核苷酸。1.2Kb的内含子鼠源轻链恒定区片段的核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:J00241的5’末端的第I至1209位脱氧核苷酸。
[0130]鼠源IgG2a重链表达载体pldmlgG-VH的构建方法大致相似，同样为源自载体pSVgpt(Mulligan&Berg 1981.PNAS 78:2072-2076)的 IOKb 大小表达载体，它包含了一个上游的IgG增强子(Enhancer)，一个用来插入VH段的Xho I和HindIII克隆位点，和连着内含子(intixm)的小鼠IgG2a重链恒定区的基因序列。在重链恒定区基因序列的下游，放置了一个用SV40启动子表达的gpt选择标记。这一载体的构建方法如下:在pSVgpt的EcoRI和XhoI的识别位点间插入319bp的Ig增强子,得到重组载体pSVgpt-1g。在pSVgpt-1g的限制性内切酶HindIII和BamHI识别位点间插入2Kb的连着内含子(intron)的鼠源IgG2a重链恒定区片段，在XhoI和HindIII限制性内切酶位点之间连入噬菌体#3所展示的VH序列，得到鼠源IgG2a重链表达载体pldmlgG-VH。其中，319bp的Ig增强子和核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:K01901的5’末端的第I至第319脱氧核昔酸。2Kb的连着内含子鼠源重链恒定区片段的核苷酸序列是自GeneBank Accession Number:J00228的5’末端的第I至2009位脱氧核苷酸。
[0131]这一表达载体可以被用来转染多种哺乳动物宿主细胞系，包括但并不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0或NSO，幼仓鼠肾(BHK)细胞系，人类胚胎肾细胞系293(HEK293)，非洲绿猴肾COS细胞系等等。本实施例中，选用了 SP2/0工程细胞系作为宿主，使用电击穿孔转染的方法按标准步骤进行了转染。经过氨甲喋呤选择，存活的克隆被用以检验其抗体表达。选择阳性克隆进行扩增，经过数轮的扩增，表达抗体的重组工程细胞系被放大培养，其所产生的“鼠源抗独特型IgG抗体”(以下称为IdmG2a/k)也被收集并提纯。同时，表达抗体的重组工程细胞系的RNA也被提取，经过RT-PCR方法和桑格测序法，得到IdmG2a/k的轻重链的cDNA编码序列。经比对验证，IdmG2a/k,其轻重链可变区序列与实施例1中噬菌体#3表达的可容性scFv的VH，VL片断序列相同，同时带有鼠源IgG2a重链及kappa轻链的恒定区。针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdmG2a/k的重链编码DNA序列是序列表中的序列9，编码序列表中序列2的氨基酸序列；IdmG2a/k的轻链编码DNA序列是序列表中的序列10，编码序列表中序列3的氨基酸序列。
[0132]表达IdmG2a/k的重组工程细胞系经过放大培养，其表达产生的抗体经过提取细胞培养上清，用蛋白A分离柱按标准步骤纯化。纯化的抗体可在PBS缓冲液中于4°C保存。图7显示了 IdmG2a/k的提纯抗体在还原和非还原情况下的SDS-PAGE电泳图样。
[0133]重组工程细胞系表达的IdmG2a/k经纯化可以用来按标准步骤包被ELISA酶标板。
[0134]在ELISA酶连板上每孔加入50uL 10ug/ml的IdmG2a/k，4°C过夜孵育进行包被。对包被完的酶标板，每孔加入不同浓度的60uLSM03抗体以及其它的非相关对照抗体，如抗⑶20抗体RituximaM美罗华，瑞士罗氏制药公司产品)，抗⑶147抗体或者抗TNF抗体Infliximab(类克，瑞士 Cilag AG公司)。经过1.5小时室温孵育，用PBS清洗3次后，加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗人Fe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)。再经过45分钟室温孵育后，其吸附可以用(PD显色并用450nm波长读数。结果显示，重组工程细胞系表达的“鼠源抗独特型IgG抗体”IdmG2a/k只能特异性吸附SM03，而非其它对照抗体(如图8所示)。
[0135] 为了评估重组工程细胞系表达的IdmG2a/k与自然状态下的⑶22抗原竞争吸附SM03抗体的能力，使用Raji (人类伯基特淋巴瘤)细胞系作为表面自然表达CD22抗原来源进行了流式细胞计数实验。简要步骤如下，0.5 X IO6个Raji细胞与lug/ml的SM03抗体及不同浓度的鼠源抗独特型IgG抗体IdmG2a/k共同孵育，孵育条件为200uL的PBS-FA缓冲液(含1%胎牛血清FBS，0.01%叠氮化钠的PBS溶液)4°C孵育30分钟。用PBS清洗3次后，加入50倍稀释的突光标记抗人Fe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)并继续4°C孵育30分钟。再用PBS清洗3次后，用含0.5%福尔马林的PBS-FA缓冲液固定。经固定的细胞用PBS悬起,使用美国Becton Dickenson公司的FACScan分析系统进行流式细胞计数分析。结果显示，抗独特型抗体IdmG2a/k可以有效地按剂量抑制SM03吸附到其自然配体(图 9)。
[0136]实施例4、利用实施例3的IdmG2a/k监测临床实践中的“⑶22抗体族”含量
[0137]1、实施例3的IdmG2a/k能特异性结合“⑶22抗体族”共有的抗原结合部位序列，能特异性地吸附鼠源，嵌合以及人源化的抗CD22抗体。
[0138]竞争性吸附检测方法进一步表明，抗独特型抗体的吸附位点位于抗原结合部位(ABS)序列，是鼠源抗体RFB4，嵌合抗体SM03及人源化抗体SM06唯一公有的序列。竞争性吸附检测的方法简要如下，在ELISA酶连板上每孔加入50uL 10ug/ml的实施例3的IdmG2a/k，4°C过夜孵育进行包被。次日用PBS清洗3次后，用200uL的3%BSA溶液室温封闭2小时，再用PBS清洗5次。SM03抗体用HRP标记为SM03-HRP标记抗体(由天津天健生物科技有限公司标记)。1:4000稀释后的SM03-HRP标记抗体，与不同浓度的竞争抗体，包括RFB4，SM03，SM06及其它一些非相关对照抗体(SM09、N005、N009)混合。混合后的抗体加入包被了实施例3的IdmG2a/k的ELISA酶连板。SM03-HRP标记抗体对所包被的抗独特型抗体吸附水平之后可以用TMB显色液显色。
[0139]结果显示，RFB4, SM03及SM06可以等效与SM03-HRP标记抗体竞争吸附到实施例3的IdmG2a/k，而其它的非相关抗体则没有竞争吸附能力(如图10所示)，表明实施例3的IdmG2a/k是特异性吸附到RFB4，SM03和SM06的共有序列，而非其它位点，这一共有序列即它们的抗原识别部位(ABS)。其中，对照抗体SM09、N005、N009 (中国抗体制药有限公司)，针对非⑶22抗原，也不与抗⑶22抗体发生交叉反应。
[0140]2、利用实施例3的IdmG2a/k开发评估SM03临床实验中药代动力学的标准检测方法
[0141]随着“鼠源抗独特型IgG抗体”对“CD22抗体族”抗原结合部位吸附特异性的确认，开发了一种可已估测临床实验中患者血清中RFB4，SM03及SM06抗体含量的ELISA检测方法。以下例证描述了估测SM03血清含量的检测方法开发过程，这一方法也可推广应用到“⑶22抗体族”的其它成员。简要步骤如下所述，在96孔ELISA酶连板上每孔加入0.4ug/ml的实施例3的IdmG2a/k，包被条件为每孔50uLPBS，pH7.4，4°C孵育过夜；次日用1%BSA溶液室温封闭2小时。接受SM03治疗的患者血清样本经稀释一定倍数后，与不同浓度的外源SM03标准品复孔加入，稀释液选用含0.1%的空白人血清PBS以去除血清对本底的影响。每孔加入50uL的样品后室温孵育2小时，经清洗后在加入1:4000稀释的HRP标记羊抗人Fe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品),室温孵育I小时后清洗并加入TMB显色。显色信号用450nm波长的可见光读板记录。接受抗体治疗患者外周血中残留的SM03抗体浓度随时间变化的情况可以通过与外源SM03标准品的比对而获得。
[0142]图11展示了一名接受SM03治疗的患者的典型药代动力学行为，所用检测方法为前文所述的所开发的ELISA检测方法。
[0143]实施例5、估测抗内化抗原抗体生物学功效的新型检测方法
[0144]一、构建跨膜表达抗独特型抗体吸附片断的工程细胞系
[0145]在储存生产治疗性抗体的过程中，以质量控制的方式评估抗体的生物活性，以SM03为例，有两个重要考量:吸附性质(详细解读为吸附亲和力和特异性)及抗体介导生物学反应(如ADCC或⑶C)的能力。后者通常用生物学功效检测的方式来估测。由于“⑶22抗体族”抗体均可吸附CD22抗原，而吸附后会很快发生内化现象，SM03抗体及其它抗CD22抗体，不能在体外实验中顺利介导CDC反应。“CD22抗体族”抗体在吸附到CD22表达阳性的细胞表面后，不会在细胞表面停留足够的时间让其Fe部分与补体(假设为Clq补体)充分作用，以致不能正确引发导致细胞凋亡的连锁反应。这很可能是像SM03这样的抗CD22抗体观察不到可量度的CDC反应的原因。对于其他针对会发生快速内化现象表面抗原的抗体，如⑶33，Lewis (Y)抗原，恒定链(⑶74)来说，这一解释也是可信服的。用以确认抗体吸附性质(特异性和亲和力)的检测方法证明了由抗体轻重链可变区构成的吸附片断折叠，排序，配对都正确无误，但却不能提供抗体Fe部分可能发生的蛋白变异或缺失情况。而这些缺失或变异可能会阻碍抗体体内作用时发挥其正确的生物学功效。因此，开发以细胞检测为基础的通用检测方法，来估测以会发生快速内化现象的抗原为目标的抗体生物学功能是可取的。
[0146]本发明中抗独特型抗体的吸附片断因此被重新设计，使其能够在细胞表面表达为非内化附膜蛋白。这一创新通过以下几种方式完成:
[0147]1、将抗独特型抗体以跨膜IgD的方式表达
[0148]a.将鼠源IgD的跨膜区序列与“鼠源抗独特型IgG抗体”的CH3区域融合得到跨膜的针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdGmD
[0149]用于与抗独特型IgG抗体融合的鼠源IgD跨膜区(TM)的氨基酸序列如图12中带下划线的序列所示。
[0150]为了构建能够表达融合的IgG2a_TM(IgD)蛋白基因，化学合成了一段编码“鼠源抗独特型IgG抗体”部分羧基端序列的DNA序列。这一段DNA序列简并了两个限制性内切酶切点BsrGl和EagI，以协助将其克隆到相应的原始鼠源IgG2a恒定区序列中。。这段序列编码了 41个氨基酸长度的原始鼠源IgG2a与IgD (TM)融合片断。该序列被克隆到原IgG2a序列中(图6)，代替了 IgG2a CH3域羧基端的一段序列使其不仅包含原序列还增加了鼠源IgD的TM序列。所表达的蛋白应为IgG2a免疫球蛋白的重链融合鼠源IgD的透膜片断(完整构成为VH-CHl-hinge-CH2-CH3-TM)(重链如图12所示)，将该跨膜的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体命名为IdGmD。
[0151]选用SP2/0工程细胞系作为宿主，使用电击穿孔转染的方法按标准步骤进行了转染。经过氨甲喋呤选择，存活的克隆被用以检验其抗体表达。选择阳性的克隆进行扩增，经过数轮的扩增，表达抗体的重组工程细胞系被放大培养，其所产生的跨膜抗体IdGmD也被收集并提纯。同时，表达抗体的重组工程细胞系的RNA也被提取，经过RT-PCR方法和桑格测序法，得到IdGmD的轻重链的cDNA编码序列。针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdGmD的重链编码DNA序列是序列表中的序列11，编码序列表中序列4的氨基酸序列(图12的氨基酸序列);IdGmD的轻链编码DNA序列是序列表中的序列10，编码序列表中序列3的氨基酸序列。
[0152]b.将IgG2a重链用鼠源IgD序列代替得到跨膜的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体 IdDmD
[0153]将原始“鼠源抗独特型IgG抗体”的恒定区序列完全用附膜形态的鼠源IgD序列代替。带透膜片断TM序列的鼠源IgD完整氨基酸序列如图13所示。
[0154]编码附膜形态的鼠源IgD cDNA序列按照标准寡核苷酸合成的方法化学合成。引入了限制性内切点(XhoI和EagI)以方便克隆到原鼠源IgG2a表达载体相应的部位。该序列被克隆到原IgG2a表达载体中相应的部位(图6)，用附膜IgD蛋白序列代替了鼠源IgG2a的恒定区序列，得到IdDmD的重组表达载体PIdDmD。所表达的蛋白包括IgD免疫球蛋白的重链带IgD的透膜片断(形态构成为VH-CHl-hinge-CH3-TM)。值得注意的是，鼠源IgD没有CH2区域，从而其结构与IgG或人源IgD产别很大，如同图13所示(跨膜区用下划线标记)。
[0155]因为只是例证实验，只有(b)部分描述的抗独特型IgD-TM的表达载体DNA质粒经过内切酶线化。用小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0作为转染宿主细胞。据相关文献说明，SP2/0细胞只能产生内源性IgP而不能产生Iga。由于IgD免疫球蛋白分子的膜上表达需要Iga与IgP的共同作用，Iga的表达载体也与IgD-TM融合蛋白的表达载体PldDmD —同按照标准电击穿孔转染方法转染到SP2/0宿主细胞。转染了质粒的细胞用含氨甲喋呤的选择性培养基按照DHFR系统标准方法进行选择。经选择存活的细胞用细胞ELISA检测的方法测试其膜表面所表达的抗独特型特异性。实验简要步骤如下，50uL 10ug/ml的SM03抗体加入到IO6转染细胞(先用PB S冲洗3次)。将混合了抗体的细胞4°C孵育I小时后用PBS冲洗3次。然后加入50uL的经1:1000稀释的HRP标记羊抗人IgG Fe抗体，4°C孵育I小时。再用PBS冲洗I次后，加入50uL显色，膜表面的抗SM03 IgD阳性的细胞会有显色反应。经过10分钟室温孵育后,加入50uL 0.18M的稀酸终止反应。将抗体_细胞混合物离心,收集上清液用波长450nm读取吸光率。
[0156]选择阳性的克隆进行扩增，经过数轮的扩增，表达抗体的重组工程细胞系被放大培养，其所产生的跨膜抗体IdDmD也被收集并提纯。同时，表达抗体的重组工程细胞系的RNA也被提取，经过RT-PCR方法和桑格测序法，得到IdDmD的轻重链的cDNA编码序列。针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdDmD的重链编码DNA序列是序列表中的序列12，编码序列表中序列5的氨基酸序列；IdDmD的轻链编码DNA序列是序列表中的序列10，编码序列表中序列3的氨基酸序列。
[0157]结果显示，在膜表面表达抗SM03IgD需要同时将Iga转染到小鼠骨髓瘤细胞。流式细胞计数实验(该实验方法同下述步骤2的流式细胞分析)的结果确证了 IgD的膜表面表达(图16)。
[0158]2、通过附膜Fab-糖蛋白融合蛋白的形式表达跨膜的针对人CD22抗体的抗独特型抗体 IdGmFdA
[0159]来自红细胞膜表面的糖蛋白A跨膜区域与“鼠源抗独特型IgG抗体”鼠源IgG2a铰链区羧基端相融合。这一抗体片断融合预期会在转染细胞表面以通过糖蛋白A跨膜区固定在细胞表面的Fab方式表达。
[0160]用来融合抗SM03抗体片断的糖蛋白A片断(包括跨膜区序列)如图14的带下划线的氨基酸序列所示。
[0161]将基因序列直接融合在鼠源Ig2a抗体铰链区编码最后一个氨基酸的基因序列后面，所表达的蛋白应该为“鼠源抗独特型IgG抗体”重链Fd区域融合于糖蛋白A的跨膜区与包内区(片断构成形式为=VH-CHl-铰链区-糖蛋白A跨膜区+包内区，图14)。
[0162]在细胞膜表面表达“鼠源抗独特型IgG抗体” Fd片断-糖蛋白A融合蛋白的表达载体经构建完成。简要说明如下，鼠源IgG2a抗体CHl-铰链区片断融合于糖蛋白A羧基端片断(包括跨膜区序列)的编码DNA序列按照标准寡核苷酸合成方法经化学合成所得。所合成的序列包含了符合读框的XhoI和EagI内切点。合成序列利用标准的分子生物学克隆技术插入抗SM03IgG2a抗体表达载体(图6)基因序列中的相应位点，代替了原IgG2a抗体序列中的CH2-CH3区域编码序列，得到IdGmFdA的重组表达载体pIdGmFdA。
[0163]“鼠源抗独特型IgG抗体Tab片断-糖蛋白A融合蛋白的表达载体pldGmFdA质粒DNA经线化转染到小鼠SP2/0宿主细胞。经转染质粒的细胞用氨甲喋呤按照标准方法利用DHFR基因选择系统进行阳性克隆选择。选择阳性的克隆进行扩增，经过数轮的扩增，表达抗体的重组工程细胞系被放大培养，其所产生的跨膜抗体IdGmFdA也被收集并提纯。同时，表达抗体的重组工程细胞系的RNA也被提取，经过RT-PCR方法和桑格测序法，得到IdGmFdA的轻重链的cDNA编码序列。针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdGmFdA的重链编码DNA序列是序列表中的序列13，编码序列表中序列6的氨基酸序列；IdGmFdA的轻链编码DNA序列是序列表中的序列10，编码序列表中序列3的氨基酸序列。
[0164]选出的存活阳性克隆用来测定其抗独特型Fab-糖蛋白A融合蛋白的细胞表面表达情况，所用方法依然为之前所述的细胞ELISA检测方法。经ELISA检测成功在细胞表面表达融合蛋白的细胞进一步进行流式细胞分析:SM03抗体作为一抗，FITC荧光标记的羊抗人IgG Fe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)作为检测抗体(二抗)。简要说明如下，5X IO5个转染细胞与0.01,0.1或1μ g的SMO3在IOOuL的PBS-FA缓冲液(含1%胎牛血清FCS，0.05%叠氮化钠的PBS溶液)中共同孵育。孵育条件为4°C，时间30分钟，之后用PBS清洗3次以移除非吸附抗体。SM03对转染细胞的吸附量用荧光FITC标记羊抗人IgGFe抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)的检测评估。用含20倍稀释突光标记抗体的lOOuLPBS-FA缓冲液经4°C孵育30分钟后，用PBS冲洗细胞3次，其荧光信号用FACScan系统进行分析。结果显示，抗独特型Fab-糖蛋白A融合蛋白IdGmFdA能够有效地在转染骨髓瘤细胞系的细胞表面表达(如图16所示)。
[0165]3、以Fab-GPI固定融合蛋白的形式表达“鼠源抗独特型IgG”抗体的针对人⑶22抗体的抗独特型抗体IdGmFdG
[0166]GPI片断由附在DAF疏水区域上的LDL受体衍生而来，这一片断直接融合在“鼠源抗独特型IgG抗体” IgG2a铰链区之后。融合蛋白预期以通过GPI固定，附在细胞表面的Fab片断方式表达。
[0167]由附在DAF疏水区上的LDL受体衍生的GPI片断氨基酸序列如图15中带下划线的氨基酸序列所示。[0168]将其编码DNA序列直接融合在编码鼠源IgG2a抗体铰链区最后一个氨基酸基因序列之后；所表达蛋白应为“鼠源抗独特型IgG抗体”重链Fd部分与GP1-DAF片断融合(融合片断构成为VH-CH1-GP1-DAF，如图15所示)。
[0169]表达上述融合蛋白的表达载体已构建完成。简要说明如下，编码鼠源IgG2aCHl-铰链区与GP1-DAF融合片断的DNA序列按照标准寡核苷酸合成的方法经化学合成所得。序列中包含符合读框的XhoI和EagI内切点(下划线所示)。合成序列利用标准的分子生物学克隆技术插入“鼠源抗独特型IgG抗体”表达载体(图6)基因序列中的相应位点，代替了原IgG2a抗体序列中的CH2-CH3区域编码序列，得到IdGmFdG的重组表达载体pIdGmFdG。 [0170]PldGmFdG质粒DNA经线化转染到小鼠SP2/0宿主细胞。经转染质粒的细胞用氨甲喋呤按照标准方法利用DHFR基因选择系统进行阳性克隆选择。选择阳性的克隆进行扩增，经过数轮的扩增，表达抗体的重组工程细胞系被放大培养，其所产生的跨膜抗体IdGmFdG也被收集并提纯。同时，表达抗体的重组工程细胞系的RNA也被提取，经过RT-PCR方法和桑格测序法，得到IdGmFdG的轻重链的cDNA编码序列。针对人CD22抗体的抗独特型抗体IdGmFdG的重链编码DNA序列是序列表中的序列14，编码序列表中序列7的氨基酸序列；IdGmFdG的轻链编码DNA序列是序列表中的序列10，编码序列表中序列3的氨基酸序列。
[0171]选出的存活阳性克隆用来测定其抗独特型Fab-糖蛋白A融合蛋白的细胞表面表达情况，所用方法依然为之前所述的细胞ELISA检测方法。经ELISA检测成功在细胞表面表达融合蛋白的细胞进一步进行流式细胞分析:SM03抗体作为一抗，FITC荧光标记的羊抗人FcIgG抗体(Jackson Immunoresearch公司产品)作为检测抗体(二抗)，具体方法同上述步骤2的流式细胞分析)。结果显示，“鼠源抗独特型IgG抗体”Fab片断-GPI融合蛋白IdGmFdG能够有效地在转染骨髓瘤细胞系的细胞表面表达(如图16所示)。
[0172]二、建立用以评估“⑶22抗体族”生物学功效的细胞检测方法
[0173]将上述步骤一的在细胞表面表达相应的融合蛋白(IdDmD、IdGmFdA和IdGmFdG)的不同表现类型转染细胞，经校正细胞浓度为2 X IO6个/毫升。在96孔板上每孔加入50uL细胞。加拿大Cedarlane公司的豚鼠血清(Guinea Pig Serum, GPS)冻干粉用I毫升的培养基配制成100%的GPS溶液。在加有转染细胞的孔中加入含10%GPS的50uL不同浓度的SM03抗体。经过2小时，370C，5% 二氧化碳条件下的孵育