专利名称：利用cDNA-SRAP技术分析棕色棉子叶衰老基因差异表达的方法在棉花生产中，叶片早衰是导致棉花减产的重要因素之一。棉田叶片早衰可导致产量损失10%左右，严重的可达20%以上。棉花叶片的早衰不仅影响棉花的产量，而且还可导致棉花纤维长度变短、纤维强度的降低、纤维整齐度下降，从而降低棉纤维的成纱质量。天然彩棉，因其纤维具有天然的棕、绿等颜色，在纺织加工过程中不需人工染色，避免了化工染料对环境的污染以及对人体的毒害作用，而备受人们青睐。根据我们多年的田间观察，彩棉叶片的早衰现象比白棉更为严重。因此，研究棕色棉叶片衰老，具有重要的理论和实践意义。在棉花子叶生活周期中，子叶衰老是遗传控制的一个程序化过程，从功能性光和器官到主动衰退和营养再循环组织的转变代表子叶衰老的开始。这种开始是涉及显著差异基因表达的发育转变。认为差异基因表达在子叶衰老中发挥重要的作用。在开始衰老的子叶中，许多绿叶中表达的基因(包括参与光合作用的基因)下调，而与衰老相关的基因 (SAGs)上调。相关序列扩增多态性(sequencerelated amplified polymorphism, SRAP)是 Li等建立的SRAP标记技术。该标记技术具有多态性丰富，重复性好，稳定性强，操作简单， 在基因组中分布均匀，并且能够检测到某些低水平表达的基因，较易对扩增得到的目的片段进行克隆测序，实验成本低等优点。所以该标记技术被广泛应用于生物体基因表达特性的研究、比较基因组学、图谱构建、品种鉴定研究、遗传多样性分析等方面。Li等发现SRAP 技术还可以用于cDNA的分析，也就是SRAP标记可以用DNA作为模板，也可以用cDNA，但 cDNA-SRAP技术目前只有在水稻、甘蓝、甜瓜等植物上得到应用，应用范围还相对较少。现在己经确认乙烯是一种有力的衰老促进素，但其对棕色棉子叶衰老的影响鲜有报道。
本发明的目的是提供一种利用cDNA-SRAP技术分析乙烯利处理对棕色棉子叶衰老的影响及相关基因的差别表达分析。本发明是通过以下的技术方案实现的，本发明包括如下步骤A、材料的处理首先用质量分数98%的浓硫酸对棕色棉籽脱绒消毒，然后在27±2°C光照培养箱恒温培养，以发芽20-25天的棕色棉为材料，以浓度为450-550ppm的乙烯利喷洒叶片，处理 18-24小时后取子叶，液氮处理，_70°C冰箱保存备用；B、提取步骤A中子叶的总RNA ；C、将所获得的总RNA通过MMLV反转录酶反转录获得第一链DNA ；D、cDNA-SRAP PCR 反应；E、反应产物的电泳检测，特异性条带的回收；F、回收条带的纯化、测序；G、序列的功能分析。本发明所述步骤B中总RNA的提取，采用改良的CTAB法。本发明所述步骤D中cDNA-SRAP PCR反应体系为10XPCR上样缓冲液 (buffer 含 Mg2+)用量 2.5 μ L，前引物 IOmmol · L—1 用量 I. 5 μ L，后引物 IOmmol · L-1 用量 I. 5μ L, IOmmol · Γ1 的 dNTPs 用量 2. O μ L，第一链 cDNA 模板用量 25ng，Taq DNA 聚合酶 5U · μ L^1O. 2 μ L，加水至Ij 25 μ L。；PCR 条件为 94°C 5 分钟；94°C I 分钟，35°C I 分钟，72°C I 分钟，5个循环；94°C I分钟，50°C I分钟，72°C I分钟，35个循环；72°C 7分钟，4°C结束。其所用的引物组合为表一表ISRAP正、反向引物正、反向引物序列(5’ - 3’ )本发明公开了一种利用cDNA-SRAP技术分析棕色棉子叶衰老基因差异表达的方法，其步骤为，首先将待分析的材料用浓度为450-550ppm的乙烯喷洒处理18-24小时后提取子叶中的总RNA；再通过cDNA-SRAP PCR反应，对反应产物获得的特异性条带的进行回收、纯化以及序列的功能分析。本发明利用cDNA-SRAP技术在分子水平上分析相关基因的差异表达，以期探明棕色棉子叶衰老的分子机制，加深对棕色棉叶片衰老的认识，为人为的调控彩色棉叶片衰老进程提供理论依据。