Cdk18基因及其表达产物的应用制作方法_王群专利（Cdk,基因,产物）-早鸽网

Cdk18基因及其表达产物的应用制作方法

专利名称

Cdk18基因及其表达产物的应用制作方法
发明者

王群, 邓庆, 韩泽广
公开日

2012年9月26日
申请日期

2011年3月23日
优先权日

2011年3月23日
申请人

上海人类基因组研究中心
文档编号

A61K39/395GK102690878SQ201110071089
关键字

Cdk 基因产物表达应用
权利要求

1.ー种⑶K18基因及其表达产物的应用，其特征在于所述⑶K18基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用2.如权利要求I所述的应用，其特征在于所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、激酶活性检测、原位杂交、或基因芯片诊断肝癌的产品3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增CDK18基因的引物4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括ー对特异扩增⑶K18基因的引物5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括与⑶K18蛋白特异性结合的抗体6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用激酶活性检测的产品包括特异性检测CDK18激酶活性的底物及反应体系7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括与CDK18基因的核酸序列杂交的探针8.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括与⑶K18基因的核酸序列杂交的探针9.ー种⑶K18基因及其表达产物的应用，其特征在于所述⑶K18基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用10.如权利要求9所述的应用，其特征在干所述治疗肝癌的药物及方式包括通过RNA干扰抑制CDK18基因表达的双链核糖核酸、DNA载体、腺病毒或腺相关病毒载体，或能够抑制CDK18蛋白激酶活性的化合物、多肽、单克隆抗体11.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰特异性抑制CDK18基因表达的双链核糖核酸及其不同修饰状态、不同递送方式12.如权利要求10所述的应用，其特征在于所述治疗肝癌的药物包括携带特异性针对⑶K18基因干扰其表达的DNA载体、病毒载体13.用于制备用RT-PCR诊断肝癌产品的一对特异扩增⑶K18基因的引物，其特征在于所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO 1所示的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO 2所示的序列或其互补序列14.用于制备治疗肝癌药物的ー对⑶K18基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 5所示序列，所述siRNA的反义链具有如SEQ ID NO 6所示序列15.用于制备治疗肝癌药物的ー对⑶K18基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 7所示序列，所述siRNA的反义链具有如SEQ ID NO 8所示序列16.用于制备治疗肝癌药物的ー对⑶K18基因的siRNA，其特征在于所述siRNA的正义链具有如SEQ ID NO 9所示序列，所述siRNA的反义链具有如SEQ ID NO 10所示序列
技术领域

本发明涉及一种基因的应用，特别是涉及一种⑶K18基因及其表达产物的应用
背景技术
具体实施例方式

以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆实验室手册(NewYork Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件实施例IRT-PCR实验检测⑶K18基因在肝癌组织中的表达情况逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)实验检查⑶K18基因再肝癌组织中的表达情况RT-PCR 是指将逆转录(Reverse Transcription ；RT)反应和 PCR(Polymerase ChainReaction)反应组合在一起的方法RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及SI核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)选择性RNA逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo (dT)或基因特异性的引物起始RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCRI.组织分离实验用组织来源于原发性肝癌的手术病人手术切除的肝脏一经离体，迅速切取病灶及周围5公分外癌旁组织，放入液氮中(_80°C )保存癌和癌旁的诊断均以病理诊断为最终依据2.总核糖核酸(RNA)的抽提试剂盒抽提总核糖核酸(RNA)采用TRIZOL(Invitrogen),该试剂是基于酸性酹一步抽提法生产的TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层RNA存在于水样层中收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原用于抽提总核糖核酸(RNA)所用的器皿和水均进行核糖核酸酶灭活处理，以保证实验中无核糖核酸酶的环境3.核糖核酸(RNA)抽提步骤RNA提取的一般步骤是破碎组织一分离RNA —沉淀RNA —洗涤RNA —融解RNA —保存RNA破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入P-ME可以抑制RNA酶活性分离RNA —半用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA —般分布于上层，与蛋白层分开沉淀RNA —般用乙醇、3M NaAc (pH-5. 2)或异丙醇洗涤RNA使用70%乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解融解RNA一般使用TE保存RNA应该尽量低温为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于_70°C用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA 加入NaAc 至 0.3M，12，000Xg 离心 5 分钟4. cDNA 的合成(I)冰浴离心管里面加入模板RNA 4iiL(liig/iiL)，随机引物2iiL(20pmol/U L),去离子水5 ii L,混匀,离心3-5秒；·(2)70°C水浴5分钟，冰浴30秒(此处是为了使引物和模板正确配对);(3)加入5 X M-MLV逆转录酶第一链缓冲液4 ii L (200U/ U I), RNase抑制剂I u L(Ribonuclease Inhibitor, 40U/ u I，TaKaRa)，dNTP 2u L(2. 5mM, TaKaRa)(这些应该先配好，然后分再装到每一管)，混匀；(4) 37°C水浴5分钟，加入I U L M-MLV RT反转录酶(200U/ U I)，混匀；(5)37°C水浴I小时(此步是反转录过程)；(6) 700C，10分钟结束反应(此处是灭活酶活性，避免对后续实验产生干扰)，产物置冰上进行下一步PCR实验，余下的_70°C保存5. RT-PCR的弓I物设计及扩增理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列设计理想的引物都有以下共同的特点典型的引物18到24个核苷长引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物设计5’端和中间区为G或C的引物这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性避免引物对3’末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增避免3’末端富含GC设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T避免3’末端的错误配对3’端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性因此，本实施例中设计的引物具体如下CDK18-F5，-GCCGGGTATAAGGAGCAAAG-3’ (SEQ ID NO 1)；CDK18-R5，-CGTGAATTCAGCCAAGGATT-3’ (SEQ ID NO 2)；^ -actin(F) 5，-CATCCTGCGTCTGGACCT-3，(SEQ ID NO 3)；^ -actin(R) 5，-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO 4)以P-actin作为内对照，反应混合物中各成分为0-actin(F)、& -actin(R) >CDK18 (F)、CDK18 (R)、10XPCR buffer、MgcI2、dNTP、Taq DNA 聚合酶(TaKaRa Taq ) cDNA 模板分别为0. 2,0. 2,0. 4,0. 4,1. 0,1. 0,0. 2,0. I和5 y LcDNA模板，最后补充ddH20使反应体系为10 u L0PCR的反应条件如下94 °C，5分钟预变性；94 °C，30秒变性；55 °C，30秒退火；72 °C，30秒延伸；35个循环，电泳检测PCR扩增产物实施例2原位杂交用CDK18基因探针，与肿瘤切片进行原位杂交，阳性杂交信号越强，患肝癌的可能性越高实验步骤为将肝脏肿瘤组织取材后OCT包埋、液氮速冻，恒冷冰冻切片，该冰冻切片进一步用于原位杂交实施步骤如下(I)冰冻切片与杂交前预处理I).将样品从_80°C取出，用OCT包埋，在_23°C (切片机腔体温度)平衡至少30min将包埋好的样品固定在样品头上，切10 厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(lmg/ml)的玻片上(玻片预先经180°C干烤6小时)，保存于-70°C冰柜备用2).冰冻切片经室温干燥IOmin后，在4%的多聚甲醛-PBS (pH7. 4)固定lOmin3).活跃的 DEPC-PBS (未高压的 0. I % DEPC-I X PBS 溶液)洗 2 次，每次 5min4).在0.2M的盐酸作用中作用IOmin后，重复步骤4)5).在切片上滴加蛋白酶1((0.11^/1111)，371孵育151^11，重复步骤4)6).经0. IM TEA (三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0. 25% AA/O. IM TEA (乙酸酐/三乙醇胺，pH8. 0)中乙酰化IOmin (在大多数实验中，步骤4，5，6省略)7). 5XSSC 中平衡 15min(2)杂交I).在脱水后的玻片上滴加预杂交液(约100 U L/玻片)，置于放有湿盒液(50%甲酰胺 v/v;0. 3M NaCl ；lmM EDTA ; IOmM Tris_Cl，pH8. 0)的湿盒中，55 58°C下的烘箱中预杂交2h2).甩掉预杂交液，地高辛标记的反义或正义cRNA探针(浓度l_2ng/ii L)经70°C变性10分钟，置冰上lmin，玻片上滴加预杂交液(约60 ii L/玻片)，覆盖parafilm膜，放湿盒中在48 58°C下杂交18-30h(3)杂交后处理I).取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉杂交液，用52°C预热的5XSSC洗30mino2).在无 DNA 的 RNA 酶 A(20 y g/ml)溶液中 37°C下孵育 30min3).分别依次用 52°C^；^iM^2XSSC，lXSS(^P0. I X SSC 洗 2 次，每次 30min(4)杂交信号检测I).在缓冲液 A(0. IM Tris-HCl pH7. 5,0. 15M NaCl)中平衡 5min2).在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(I 500 I 2000稀释于含0. 5%阻断液的缓冲液A中)，室温反应2h3).用缓冲液A洗2次，每次15min4).在缓冲液 B (0. IM Tris-HCl ；0. IM NaCl ；0. 05M MgCl2, pH9. 5)中平衡 5min5).硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴_4_氯_3_吲哚氧磷酸盐(BCIP)溶于缓冲液B中，每ml缓冲液B含有4.5 ii L NBT和3.5 ii L BCIP0在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜6).充分显色后，用 EDTA(lmM EDTA, pH8. 0)洗 15min 终止反应7).在95%乙醇中洗Ih以除去非特异的背景8).用蒸馏水洗15min除去可能存在的结晶体9).脱水、透明，用中性树胶封片10).充分干燥后在显微镜下观察、照相实施例3全激酶组范围内RNAi筛选肝癌细胞生长必需激酶基因RNAi作为一种简单快速、特异、高效、经济、效果可预测的技术，具有明显的优点，它比反义核酸技术优越，比基因敲除简单，具有很好的应用前景具体可用于以下几个方面基因功能分析；研究信号传导通路的新途径；新药物的研究和开发；基因治疗RNAi只抑制致病基因，而不影响正常等位基因的功能，具有较高的选择性和特异性，能减少非特异作用引起的副作用肿瘤发生是多基因相互作用的基因网络调控的结果，传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性，设计针对这一区段序列的dsRNA分子，只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时沉默的效应，也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时沉默针对人类基因组上所有激酶及激酶相关基因的siRNAs库通过商业化途径获得(Stealth RNAi Human Kinase Collection, Invitrogen,Catalog no.12938-200)每套 Stealth RNAi Collection 由若干 96 孔板组成,2nmoles 的 Stealth RNAi 溶解在IOOu I 的 IXRNA 退火 / 稀释溶液中(IOmM Tris-HCl, pH 8. 0 ；20mM NaCl ；lmM EDTA, pH

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专利名称：Cdk18基因及其表达产物的应用的制作方法蛋白激酶是由人类基因组中最大的一类基因所编码，其作用是通过将磷酸基团转移至底物蛋白上，来调控各种蛋白的活性、信号转导通路及细胞生物学过程，人类基因群编码超过57个激酶家族之中的518种蛋白激酶。大约有55%已知的原癌基因编码蛋白激酶，其余多数的原癌基因则编码可激活蛋白质激酶或被激酶磷酸化的特异蛋白。所有蛋白激酶参与细胞信号通路，参与心血管疾病、糖尿病、感染性疾病、关节炎和其它免疫紊乱、神经系统如老年性痴呆症，阿默海茨症AD等发病机制，现已发与超过400种人类疾病与蛋白激酶相关。美国FDA的制药和生物技术公司中有四分之一的药物研究开发方案集中在研发新的蛋白激酶抑制剂，这些药物应用于治疗包括肿瘤、炎症、心力衰竭、糖尿病和神经系统疾病，超过60种的蛋白激酶抑制剂正在临床试验之中,其中许多已开发上市,如诺华(Novartis)的 Gleevec ,阿利斯康(AstraZeneca)的 Iressa ,施贵宝的 Tarceva (Genentech andOSI Pharmaceuticals),拜尔的 Nexavar (Bayer),辉瑞的 Sutent (Pfzer), Sprycel (Bristol-Myers Squibb),和葛兰素史克的 Tykerb (GlaxoSmithKline),制药公司清楚地认识到蛋白激酶抑制剂的重要性，已成为药物研发的热点。肝癌严重威胁着我国人民的生命健康。肝癌的诊断，尤其早期诊断是临床诊疗和预后的关键。肝癌的治疗在过去20年来已取得很大的进展，外科手术切除及肝脏移植属于“根治性”治疗，仍是肝癌治疗的首要选择。随着肝癌早期诊断水平的提高及肿瘤治疗生物学概念的改变，肿瘤局部非手术治疗在肝癌治疗中的地位日益提高。经导管动脉内化疗栓塞(TACE)已成为不能切除肝癌治疗的首选方法，是中晚期肝癌治疗的重要手段。该方法可使90%以上的肝癌患者受益，但总体疗效有待提高。此外，经皮肝穿刺瘤内无水乙醇治疗(PEI)也是较常用的局部化疗方法，对癌直径< 3cm的肝癌及门静脉癌栓的治疗有一定价值。但目前肝癌的化疗药物基本沿用其他肿瘤的治疗药物，针对性差，疗效不佳，因此，迫切需要寻找新的作用靶点，研究和开发肝癌特异的新药物，提高化疗的特异性和有效性。近几年来随着对肝癌基础研究的深入，生物治疗在肝癌的综合治疗中取得了较大进展，成了继手术、放疗、化疗后肿瘤治疗的第四大疗法，如免疫治疗、基因治疗，包括抗血管生成、自杀基因治疗、肿瘤疫苗治疗、siRNA技术等。但许多生物治疗的临床疗效仍不十分满意，且绝大多数还处在实验研究阶段，相关的关键理论和实验技术仍需进一步研究和发展。CDK18是细胞周期素依赖性激酶家族成员，细胞周期素依赖性激酶(CDKs)是真核细胞中关键的细胞周期调控者，他们的活性被与之结合的细胞周期素控制。因此，有进一步研究的价值。
本发明要解决的技术问题之一是提供一种⑶K18基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。本发明要解决的技术问题之二是提供一种⑶K18基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。本发明要解决的技术问题之三是提供一对特异扩增CDK18基因的引物，该引物可用于制备用RT-PCR诊断肝癌的产品。本发明要解决的技术问题之四是提供⑶K18基因的s iRNA，该s iRNA可用于制备治疗肝癌的药物。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现在本发明的一方面，提供了一种⑶K18基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。所述诊断肝癌的产品包括用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、激酶活性检测、原位杂交、或基因芯片诊断肝癌的产品。所述用RT-PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增⑶K18基因的引物。所述用实时定量PCR诊断肝癌的产品至少包括一对特异扩增⑶K18基因的引物。所述用免疫检测诊断肝癌的产品包括与⑶K18蛋白特异性结合的抗体，包括多克隆抗体和单克隆抗体。所述用激酶活性检测的产品包括特异性检测CDK18激酶活性的底物及反应体系。所述用原位杂交诊断肝癌的产品包括与CDK18基因的核酸序列杂交的探针。所述用基因芯片诊断肝癌的产品包括■ 与⑶K18基因的核酸序列杂交的探针。在本发明的一方面，提供了用于制备用RT-PCR诊断肝癌产品的一对特异扩增CDK18基因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO 1所不的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO :2所示的序列或其互补序列。另外，本发明还提供了一种CDK18基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。所述治疗肝癌的药物及方式包括通过RNA干扰抑制⑶K18基因表达的双链核糖核酸、DNA载体、腺病毒或腺相关病毒载体，或能够抑制CDK18蛋白激酶活性的化合物、多妝、单克隆抗体。其中，所述治疗肝癌的药物包括通过RNA干扰特异性抑制⑶K18基因表达的双链核糖核酸及其不同修饰状态、不同递送方式。所述治疗肝癌的药物包括携带特异性针对⑶K18基因干扰其表达的DNA载体、病毒载体。在本发明的另一方面，提供用于制备治疗肝癌药物的⑶K18基因的三对siRNAs，分别为 CDK18-sil、CDK18-si2 和 CDK18-si3。其中，CDK18_sil 的正义链具有如 SEQ ID NO:5所示序列，⑶K18-sil的反义链具有如SEQ ID NO :6所示序列。⑶K18_si2的正义链具有如SEQ IDNO 7所示序列，CDK18-si2的反义链具有如SEQ ID NO 8所示序列。CDK18_si3的正义链具有如SEQ ID NO :9所示序列，CDK18-si3的反义链具有如SEQ ID N0:10所示序列。本发明治疗肝癌的药物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者用栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。本发明的药物也可被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物，可通过常规方法进行制备。针齐U、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。为了实现本发明中CDK18基因作为制备肝癌治疗药物的靶点，本发明通过如下技术方案实现I、化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对CDK18基因序列，利用脂质体包裹递送至肝癌细胞内，干扰⑶K18基因的表达，CCK-8法测量肝癌细胞Huh-7，Hep3B,MHCC-97H，MHCC-97L生长活性。本发明中实验结果证明特异性针对⑶K18基因的小核糖核酸分子能够抑制肝癌细胞体外的生长，说明CDK18基因可用作制备肝癌治疗药物的靶基因。2、利用各种载体,包括DAN载体、腺病毒、腺相关病毒载体来干扰CDK18基因的表达，达到体内干扰CDK18基因的效果，从而实现抑制肝癌细胞体内增殖的目的。3、获得能够特异性抑制⑶K18基因激酶活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制⑶K18激酶活性的目的，从而实现抑制肝癌细胞体内增殖的目的。4、获得能够特异性抑制⑶K18基因激酶活性的化合物，达到抑制⑶K18激酶活性的目的，从而实现抑制肝癌细胞增殖的目的。本发明中用于特异性干扰CDK18基因的小核糖核酸序列设计原则如下(I)从转录本(mRNA)的AUG起始密码开始，寻找“AA” 二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在45% -55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区(untranslatedregions, UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNA核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。(2)将潜在的序列和相应的基因组数据库(人，或者小鼠，大鼠等等)进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如，使用BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)(3)选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列体外评估干扰⑶K18基因表达。本发明首次公开了 CDK18激酶基因的应用，用于制备肝癌诊断的产品和肝癌治疗的药物。本发明⑶K18基因序列特异性siRNA干扰可以显著抑制肝癌细胞的生长，因此CDK18基因及其表达产物可作为诊断肝癌的标志物和用于肝癌治疗的药物靶点，使肝癌诊断更加准确、快速，并提供了新的肝癌治疗的基因靶点。总之，本发明CDK18基因为防治肝癌提供了新的治疗靶点和有效新药。下面结合附图与
对本发明作进一步详细的说明图I是RNAi筛选技术体系示意图2是激酶siRNAs库对四株肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC_97H、MHCC_97L生长活性影响分布图；图3是四株肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L中5 %可信区间(Confidence interval, Cl)和 10%分析区间(Analysis interval, Al)的确定，分别得到抑制、促进细胞生长的siRNAs及对应的激酶基因图；图4是四株肝癌细胞H印3B、Huh-7、MHCC-97H、MHCC-97L全激酶组范围内RNAi对细胞活性影响的统计图，图中的1、2、3、4代表相应的细胞株数目；图5是RNAi筛选体系鉴定干扰⑶K18基因能够抑制肝癌细胞H印3B、Huh_7、MHCC-97H的生长的柱状图。

8.0)，终浓度为20 u M.CCK-8测定细胞活性CCK-8试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为该试剂中含WST-8 [其化学名称为2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H_四唑单钠盐]，它在电子载体I-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲染料(Formazan dye)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。分光光度计读数，产生原始细胞活性数据，实验流程如图I所示。原始数据经过标准化，数据校正、Z值评估等步骤，得到siRNA库对肝癌细胞生长影响的数据(图2-4)，用于进一步分析。实施例4RNAi干扰效应将构建好的质粒pSUPER质粒转染肝癌细胞后48小时后抽提细胞株RNA，定量PCR鉴定RNA干扰的效果，确认质粒能够发挥RNAi效应后，与pcDNA3. I (质粒质量比5 : I)共转染，将细胞重新接种于IOcm大盘中培养，同时培养液中加入新霉素G418进行筛选培养4 6周，去除培养液，IXPBS漂洗两遍后结晶紫染色后拍照计数。实施例5免疫检测I、抗原蛋白获得(I)利用基因工程表达可从Genebank数据库中获得人⑶K18基因的cDNA序列，通过PCR扩增获得编码框，插入原核生物或真核生物表达载体中，表达⑶K18蛋白，并按基因工程表达产物的纯化体系纯化蛋白。2、抗体制备可采用以下几种方法制备抗体(I)细胞融合法用上述制备的⑶K18蛋白免疫动物(包括兔子、山羊等)，获得脾脏细胞，再与骨髓瘤细胞融合，并按常规单克隆抗体制备技术制备单克隆抗体。(2)利用噬菌体表面展示库，克隆免疫动物的脾脏IgG可变区并表达成基因工程单克隆抗体。 (3)利用纯化的蛋白免疫动物，制备多抗血清。3、检测(I)用制备的抗体(多抗或单抗)，用组织化学方法进行肝癌的病理检测，阳性信号为肝癌。(2)取患者血清，用ELISA方法检测，阳性反应为肝癌可疑病人。(3)将⑶K18抗体作为蛋白质芯片的探针之一，用于多种肿瘤诊断。实施例6⑶K18基因的小干扰核糖核酸(siRNA)体外化学合成小干扰核糖核酸(siRNA)具有快速、简单和特异性强等特点，在抗肿瘤治疗等方面有广泛的应用前景。针对CDK18基因mRNA设计合成三对siRNAs对应靶序列，该3对siRNA序列分别如下CDK18-sil 正义链GCAAGAGGCUCUCUCUGCCCAUGGA(SEQ ID NO 5)；CDK18-sil 反义链UCCAUGGGCAGAGAGAGCCUCUUGC(SEQ ID NO 6)；CDK18-si2 正义链CCCAGGAAUUCCUACAGAAGCUACA(SEQ ID NO 7)；CDK18-si2 反义链UGUAGCUUCUGUAGGAAUUCCUGGG(SEQ ID NO 8)；CDK18-si3 正义链ACCUGGACAGUGACCUGAAGCAGUA(SEQ ID NO 9)；CDK18-si3 反义链UACUGCUUCAGGUCACUGUCCAGGU (SEQ ID NO :10)另外设置无关序列作为阴性对照siRNA，正义链，5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID NO :11)，反义链，5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID NO :12)在96 孔板中每孔接种 3 X IO3 个 Huh-7，Hep3B, MHCC-97H 和 MHCC-97L 细胞(无血清培养液)(均源自中国科学院细胞库)，待细胞密度达到40 %左右时，利用脂质体(Lipofectamine2000)转染试剂分别将上述3种siRNA按终浓度50nmol/L转染进Huh_7，Hep3B, MHCC-97H和MHCC-97L细胞中，4h后换成含10%胎牛血清的DMEM。以24h为I个检测单位培养7d，每天检测I次该细胞密度。每孔待测细胞液中加IOii L CCK-8，37°C孵育Ih0利用酶标仪在450nm波长下检测其吸光度以代表细胞存活能力，绘制生长曲线。实验结果，如图5所示，表明特异性干扰CDK18表达的小干扰核糖核酸(siRNA)能够抑制肝癌细胞系MHCC-97H的生长，肝癌细胞的存活率明显低于对照组的细胞，说明人⑶K18基因的表达下调能在一定程度上抑制肝癌细胞生长。

本发明公开了一种CDK18基因及其表达产物的应用，用于制备肝癌诊断及治疗的产品。本发明的CDK18基因及其表达产物，可作为诊断肝癌的特异性标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速；本发明的CDK18基因及其表达产物可作为制备治疗肝癌药物的靶基因，提供新的肝癌治疗途径。

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