人cdkl3基因的用途及其相关药物的制作方法【技术领域】，更具体地涉及人⑶KL3基因的用途及其相关药物。[0002]RNA干扰(RNA interference, RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to23 nucleotide intervals.Cell 2000:101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard, Susan LThe therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。[0003]CDKL3是类似于有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族和细胞周期依赖性激酶(CDK)家族的丝氨酸蛋白激酶(Yee KW, Moore SJj Midmer Mj Zanke BW, Tong Fj HedleyD，Minden MD.NKIAMREj a novel conserved CDC2_related kinase with features ofboth mitogen-activated protein kinases and cyc-1in-dependent kinases.BiochemBiophys Res Commun 2003，308:784-792.Hanks SK，Quinn AM, Hunter T.The proteinkinase family:con-served features and deduced phylogeny of the catalyticdomains.Science 1988，241:42-52.)，这两大家族都参与信号转导、细胞周期调控、细胞迁移和细胞存活等生理过程(Miyata Y，Nishida E.Distantly related cousins of MAPkinase!biochemical properties and possible physiological functions.BiochemBiophys Res Commun 1999，266:291-295.)?[0004]CDKL3 (eye I in-dependent kinase-like 3)基因编码一条由 455 个氛基酸组成的多肽，又命名为NKIAMRE，定位于细胞质中，被认为是RNA聚合酶C末端磷酸化激酶复合物的一个组成成分(Yee KW, Moore SJj Midmer Mj Zanke BW, Tong Fj HedleyD，Minden MD.NKIAMRE,a novel conserved CDC2_related kinase with featuresof both mitogen-activated protein kinases and cyc-1in-dependent kinases.Biochem Biophys Res Commun 2003;308:784-792.Midmer M，Haq Rj Squire JA，ZankeBW.1dentification of NK1-AMREj the human homologue to the mitogen-activatedpro-tein kinase-/cyclin-dependent kinase-related protein kinase NKIATRE，andits loss in leukemic blasts with chromosome arm 5q deletion.Cancer Res1999;59:4069-4074.)。正如基因名所示，CDKL3 在序列上和 CDK3 (cyclin-dependentkinase 3)最相似，而⑶K3是编码一个对于哺乳动物细胞Gl期到S期转变非常重要的激酶(Hofmann F，Livingston DM.Differential effects of cdk2 and cdk3 on thecontrol of pBb and E2F function during Gl exit.Genes Dev 1996;10:851-861)。CDKL3编码的蛋白质也含有一个同样存在于MAPK家族和CDK家族中的高度保守的TXY(Threonine-X-Tyrosine)基序(Hanks SKj Quinn AM，Hunter T:The protein kinasefamily:con-served features and deduced phylogeny of the catalytic domains.Science 1988;241:42-52.)。另外，在I亚区的两个氨基酸(丝氨酸和酪氨酸)残基与一个ATP结合域和一个典型的CDK负调节位点及其相似。NKIAMRE蛋白被认为是一个细胞周期蛋白结合结构域，此结构域也同样存在于⑶K中(Midmer Mj Haq R，Squire JAj ZankeBW.1dentification of NK1-AMREj the human homologue to the mitogen-activatedpro-tein kinase-/cyclin-dependent kinase-related protein kinase NKIATRE, andits loss in leukemic blasts with chromosome arm 5q deletion.Cancer Res1999;59:4069-4074.)D以上的研究提示，CDKL3基因似乎扮演着细胞周期转换或细胞调控的角色，它具有几个不同的功能，包括ATP&核苷酸结合、激酶活性和转移酶活性，所有的这些功能都和细胞周期调控和细胞增殖控制密切相关。有研究表明，CDKL3基因和与它同源的CDK3基因一样，通过促进细胞生长速率，缩短停滞期，提高蛋白产量来影响细胞周期(Matsuoka M，Matsuura Y， Semba K，Nishimoto 1:Molecular cloning of a cyclin-likeprotein associated with eyeI in-dependent kinase 3(cdk 3) in viv0.BiochemBiophys Res Commun 2000;273:442-447.)。还有研究显示，和外周血淋巴细胞相比较而言，在两个攻击性的间变性大细胞淋巴瘤中能检测到NKIAMRE蛋白的高表达(ThompsonMAj Stumph J，Henrickson SE, Rosenwald A, Wang Qj Olson S，Brandt SJj Roberts J，ZhangX，Shyr Y，Kinney MC.Differ—ential gene expression in anaplastic lymphomakinase-positive and anaplastic lymphoma kinase-negative anaplastic large celllymphomas.Hum Pathol 2005;36:494-504.)。[0005]为了深入研究⑶KL3在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取结肠癌、乳腺癌和胶质瘤细胞模型，以RNAi为手段 研究CDKL3在结肠癌、乳腺癌和胶质瘤发生和发展中的作用。
[0006]本发明的目的在于公开与人⑶KL3 (cyclin-dependent kinase-like 3)基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰(RNAi)为手段研究CDKL3基因在肿瘤细胞的存活和凋亡命运中的作用。
[0007]本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了 CDKL3基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括:向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制CDKL3基因的转录或翻译，或能够特异性抑制CDKL3蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
[0008]所述肿瘤细胞选自其生长与CDKL3蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的，所述肿瘤细胞选自结肠癌细胞、乳腺癌细胞以及胶质瘤细胞之任一。
[0009]所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低CDKL3基因的转录或翻译，或者足够降低CDKL3蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述CDKL3基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0010]所述分子可选自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0011]所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA CesiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0012]所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有⑶KL3基因的启动子序列或⑶KL3基因的信息序列。
[0013]进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与⑶KL3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人CDKL3基因的表达。
[0014]进一步的，所述小干扰RNA的第一链的序列与⑶KL3基因中的靶序列基本相同。较优的，所述⑶KL3基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-32中之任一序列。
[0015]所述CDKL3基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默CDKL3基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的CDKL3基因中的片段。
[0016]较佳的，所述⑶KL3基因来源于人。
[0017]本发明第一方面还公开了一种分离的人⑶KL3基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的 用途。进一步的，所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌以及胶质瘤之任一。
[0018]所述将分离的CDKL3基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容:其一，将CDKL3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将CDKL3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
[0019]所述将CDKL3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将CDKL3基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内CDKL3基因的表达水平。
[0020]所述将CDKL3基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将CDKL3基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人CDKL3基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的CDKL3基因小分子干扰RNA (siRNA)即是以人CDKL3基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将CDKL3基因及其蛋白作为作用对象。
[0021]所述将⑶KL3基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将⑶KL3基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0022]所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制CDKL3基因的转录或翻译，或能够特异性抑制⑶KL3蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中⑶KL3基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0023]所述通过分离的CDKL3基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0024]所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0025]所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人CDKL3基因的转录或翻译，或者足够降低人⑶KL3蛋白的表达或活性的剂量。以使人⑶KL3基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0026]采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人CDKL3基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人CDKL3基因表达水平的物质给药于患者。
[0027]本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中⑶KL3基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0028]a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与CDKL3基因杂交的核苷酸序列；或者
[0029]b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与CDKL3基因杂交的核苷酸序列。
[0030]进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与CDKL3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与CDKL3基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与CDKL3基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
[0031]更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与CDKL3基因中的靶序列基本相同。
[0032]进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与⑶KL3基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA (siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源CDKL3基因表达的作用。
[0033]更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与CDKL3基因中的靶序列基本相同。
[0034]所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与CDKL3基因中的靶序列基本相同，所述CDKL3基因的靶序列即为siR NA用于特异性沉默CDKL3基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的CDKL3基因中的片段。
[0035]较佳的，所述⑶KL3基因中的靶序列含有SEQ IDNO: 1-32中之任一序列。
[0036]进一步的，所述⑶KL3基因来源于人。
[0037]所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
[0038]进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如 SEQ ID NO:45 所示，具体为:5’ -GAGGAGAUAUCUCAGAACCAA-3’。
[0039]SEQ ID NO:45所示的siRNA为以SEQ ID NO: 19所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人CDKL3基因的小干扰RNA的一条链，第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源CDKL3基因表达的作用。[0040]进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0041]更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 33所示，具体为:5’ -GAGGAGAUAUCUCAGAACCAAUUCAAGAGAUUG⑶UCUGAGAUAUCUCCUC-3，。
[0042]shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人⑶KL3基因表达的作用。
[0043]编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID N0:l_32中之任一序列及其互补序列。
[0044]本发明第三方面，公开了一种CDKL3基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA
[0045]所述的人CDKL3基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人CDKL3基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述CDKL3基因干扰核酸构建体为CDKL3基因干扰慢病毒载体。
[0046]本发明的⑶KL3基因干扰慢病毒载体是将编码前述⑶KL3基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述载体多为慢病毒载体，所述CDKL3基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默CDKL3基因的表达。
[0047]进一步的，所述CDKL3基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)0
[0048]进一步的，所述慢病毒载体可以选自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP, pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635, pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP, pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0049]本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人CDKL3基因干扰慢病毒载体,命名为 pGCSIL-GFP-CDKL3-siRNA。
[0050]本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为结肠癌、乳腺癌或胶质瘤。
[0051]本发明的⑶KL3基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。CDKL3基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述CDKL3基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0052] 本发明第四方面，公开了一种CDKL3基因干扰慢病毒，由前述CDKL3基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对CDKL3基因的小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。因此，可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。[0053]本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分尚的核酸分子，CDKL3基因干扰核酸构建体，和/或CDKL3基因干扰慢病毒。
[0054]进一步的，所述药物组合物含有I~99wt%所述双链RNA、shRNA、⑶KL3基因干扰核酸构建体或CDKL3基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0055]在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
[0056]本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗结肠癌、乳腺癌或胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用。
[0057]该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤选自结肠癌、乳腺癌或胶质瘤之任一。
[0058]所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制 。
[0059]进一步的，采用该方法的对象为人。
[0060]本发明第六方面，公开了一种分离的CDKL3基因的RNA干扰靶序列，所述RNA干扰靶序列包含⑶KL3基因的片段，全长⑶KL3基因的核苷酸片段除外。
[0061]较优的，所述RNA干扰靶序列与全长⑶KL3基因的核苷酸序列中至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个连续的核苷酸基本相同。
[0062]较优的，所述RNA干扰靶序列为SEQ ID NO: 1-32中任一序列。
[0063]所述分离的CDKL3基因的RNA干扰靶序列可应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。具体的，可将所述靶序列作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人CDKL3基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如筛选获得小分子干扰RNA，将之用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可所述靶标寡核苷酸片段作为作用对象。
[0064]本发明还公开了 CDKL3基因的RNA干扰靶序列在制备治疗结肠癌、乳腺癌或胶质瘤之任一肿瘤治疗药物中的应用。
[0065]本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的⑶KL3基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括:存在于容器中的所述分离的核酸分子，CDKL3基因干扰核酸构建体，和/或所述的CDKL3基因干扰慢病毒。
[0066]综上所述，本发明设计了针对人CDKL3基因的32个RNAi靶点序列，构建相应的CDKL3RNAi 载体，其中编码序列 SEQ ID NO:19 的 RNAi 载体 pGCSIL-GFP-CDKL3_siRNA 能够显著下调⑶KL3基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-⑶KL3-siRNA能够靶向地将针对⑶KL3基因的RNAi序列高效导入人结肠癌RKO细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞，降低⑶KL3基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的CDKL3基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
[0067]本发明提供的siRNA或者能表达该siRNA序列的载体、慢病毒能够特异性抑制人⑶KL3基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中⑶KL3基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。



[0068]图1:pGCSIL_GFP 质粒 DNA 图谱
[0069]图2:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人结肠癌RKO细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞5天后⑶KL3mRNA的表达水平
[0070]图3:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人结肠癌RKO细胞5天后细胞增殖情况[0071 ] 图4:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后细胞增殖情况
[0072]图5:⑶KL3_RNAi慢病毒侵染人胶质瘤U87细胞5天后:细胞增殖情况
[0073]图6:使用⑶KL3抗体在不同肿瘤组织组织样本上的免疫组化检测结果(a、b、c为结肠癌，d、e、f为乳腺癌)

[0074]本发明认为CDKL3作为一个细胞周期调控蛋白可能参与了恶性肿瘤的发生和发展。
[0075]本发明设计了一组针对人⑶KL3基因的小分子干扰RNA (siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人CDKL3mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30 (优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源CDKL3基因的表达。
[0076]发明人合成和测试了多种针对⑶KL3基因的siRNA，筛选出了可有效抑制⑶KL3的表达进而抑制人结肠癌RKO细胞、乳腺癌MCF-7细胞和胶质瘤U87细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
[0077]本发明提供了一系列干扰人⑶KL3基因的小干扰RNA (siRNA)序列，构建了可特异性沉默CDKL3基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人CDKL3基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调CDKL3基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明CDKL3基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默CDKL3基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
[0078]本发明的设计思路为:
[0079]本发明通过如下方法来筛选获得一种人⑶KL3基因RNAi慢病毒:从Genbank中调取人CDKL3基因序列；预测siRNA位点；合成针对CDKL3基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达⑶KL3基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(PackingMix, Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T,产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默⑶KL3基因的慢病毒。
[0080]基于上述方法，本发明提供了 32个干扰⑶KL3基因的有效靶点(具体如SEQ ID NO1-32所示)，构建了特异干扰人⑶KL3基因的慢病毒。
[0081 ] 同时本发明还公开一种人⑶KL3基因RNAi慢病毒(⑶KL3_RNAi )及其制备与应用。
[0082]本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低CDKL3基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，CDKL3基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，CDKL3基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的CDKL3基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
[0083]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京:科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0084]实施例1针对人⑶KL3基因RNAi慢病毒的制备
[0085]1.筛选针对人⑶KL3基因的有效的siRNA靶点
[0086]从Genbank 调取 CDKL3 (NM 001113575.1 或 NM 016508.3)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对CDKL3基因的有效的siRNA靶点。在⑶KL3基因(匪001113575.1)的编码序列(⑶S)区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中32条针对⑶KL3基因的有效siRNA靶点序列。
[0087]表1靶向于人⑶KL3基因的siRNA靶点序列[0088]