专利名称：对大豆直接进行基因转化的方法大豆(67ァmax L.)属于豆科、蝶形花亚科、大豆属的二倍体植物,是人类植物蛋白和食用油的主要来源，世界上重要的粮食作物和经济作物。病、虫、草害等非生物逆境的频繁发生严重影响了大豆的产量和品质，由于抗源资源匮乏，利用常规的育种方法对大豆品种进行改良的效果不佳。随着分子生物学和分子遗传学的发展，利用转基因技术将优良外源基因转入大豆中改良其品质已成为现代分子育种的重要方法。植物基因工程是在分子水平的分子上定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物分子水平新品种的分子育种技木。70年代末，首次从分子水平上证实了土壤农、杆菌(Agrobacterium tumefaieus)在侵染植物细胞以后,不但能将它的一段DNA插入到被侵染细胞的基因组中，井能遗传给后代。农杆菌介导的转化是将外源DNA克隆至T-DNA区，农杆菌与植物细胞接触，利用农杆菌天然转移机制将外源基因导入受体细胞内。此法具有技术操作简单成熟，耗资少，可靠性高，转化率相对较高，可以转移大片段的外源基因，没有明显的基因重排现象，且外源基因主要以单拷贝插入植物基因组等优点。但此方法受植物物种、外植体类型、诱导物质及PH值、菌液浓度等多种因素的制约，致使其转化周期长、重复性差、研究进程缓慢。随着大豆遗传转化研究的发展，大豆遗传转化的再生体系也愈来愈多祥，目前使用较多的外植体有原生质体、未成熟子叶、上胚轴、下胚轴、胚尖、子叶、子叶节等。这些受体系统大多依赖于周期较长的组织培养再生体系，且再生率较低，耗费大量的人力、物力，不适于产业化及商品化。
本发明的目的是提供ー种对大豆直接进行基因转化的方法。采用农杆菌直接转化大豆萌动种子胚尖分生组织的方式，在侵染过程中采用真空滲透辅助转化的方法，真空渗透辅助的农杆菌介导的大豆萌动种子胚尖遗传转化是ー种在真空处理条件下进行的农杆菌介导的非组织培养遗传转化方法，以大豆胚尖的分生组织作为外源基因导入的受体，真空滲透处理能够在受体材料表面产生很多微损伤，且抽真空形成的负压强致使农杆菌更紧密地吸附于受体的伤ロ及伤口内细胞间隙，从而促进T-DNA向大豆细胞的导入。转化后的已萌发种子直接播种，其转化效率及周期明显优于传统的农杆菌介导转化的组培再生体系O本发明提供的ー种对大豆进行基因转化的方法包括以下步骤 O挑选饱满、无病斑、完整的大豆种子经氯气灭菌处理5-12h，于22-25°C条件下用无菌水浸泡大豆18-24h。2)用细针尖(直径O. 1-0. 2mm)垂直刺入茎尖分生组织处5_10次，深度l_2mm。3)将已处理的大豆种子浸入含こ酰丁香酮(ΙΟΟμπιοΙ/L)的农杆菌侵染液中，并辅助真空度为40-60KPa的真空渗透处理15-20min。4)将侵染后的大豆取出用无菌水清洗2-3遍后用无菌滤纸吸去多余菌液后放入共培养培养基中，25-27°C、2000Lx光照强度下培养2_3天。5)于育苗盘直接进行播种。当植株长出第三片复叶时进行草甘膦(350mg/L)涂抹实验，进行抗性检测，用棉签蘸取草甘膦药液擦拭叶片，未涂叶片作为对照，7天后观察植株的抗性反应。6)获得具草甘膦抗性的植株即2次草甘膦涂抹筛选后出现抗性性状的植株，移栽到大盆继续生长直至结实并进行PCR检测，获得阳性转化植株的种子。本发明中经真空辅助渗透侵染的针扎的茎尖分生组织避免了刀割伤对外植体造成的过度损伤，可促进转化部位不定芽的萌发与生长。可在栽培情况下直接进行常规的转化验证，通过叶片涂抹，可有效对抗性植株进行初歩的筛选、鉴定。抗性植株不需要经过困难的生根过程，于转化后5个月可以直接获得转基因后代(Tl)，一定程度上提高了大豆遗传转化的效率，显著缩短了大豆遗传转化的周期，很大程度上降低了大豆遗传转化成本。利用本发明的方法，可以将外源基因成功地转入大豆组织中，对于大豆基因工程方面的理论研究及遗传育种实践具有重要意义。图I pS0Y12质粒图谱。图2为转化种子播种后长成的植株。图3为草甘膦涂抹7天后的反应性状。图4为草甘膦筛选后具抗性性状的植株PCR检测图。

I、大豆材料黑农37、黑农44、黑农35、北京小粒豆、合丰35、合丰25、绥农28、吉育91。2、菌株、质粒实验中所用的农杆菌为EHAlOl菌株，重组质粒载体为pS0Y12，由浙江大学生命科学学院植物科学研究所寿惠霞教授实验构建并提供(见中国优秀硕士学位论文全文数据库，周正剑，抗草甘膦转基因大豆体系的优化[D].浙江大学，2011 ；CN201110303049. 0)，质粒上构建有目的基因EPSPS和标记基因Bar。将保存的农杆菌菌株从_80°C冰箱拿出，置于冰上，取出5 μ L质粒与农杆菌200 μ L混匀，冰浴5min，放入预冷的电击杯中，1500V，电击转化。将菌液吸入I. 5mLEP管中，加入500 μ LYEP培养基，于27°C振荡暗培养4h，4000r/min, 25 V，离心IOmin收集菌体，弃500 μ L上清，重悬菌体，涂板于27°C培养2天，筛选出已转化的农杆菌菌株。植物筛选剂是草甘膦。质粒图谱如图I所示。3、主要仪器
日本日立高速冷却离心机CR22G/CR21G/CR20G型 日本BIO-RAD Gel Doc凝胶成像系统 北京六一仪器厂DYY-2C型电泳仪 上海 MP-120-1 电子天平上海光谱仪器有限公司紫外可见分光光度计 上海雷磁PHS-3C型精密pH计 哈尔滨HZQ-XlOO振荡培养箱。4、主要生化试剂
卡那霉素、壮观霉素、氯霉素、こ酰丁香酮、6-苄基嘌呤(G-BA)JB1JB6、琼脂粉等购自北京鼎国技术有限责任公司；胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；MS大量元素、微量元素、次氯酸钠、浓盐酸及蔗糖等普通化合物购自天津江天化工公司；草甘膦(农达)购自孟山都(马来西亚)有限公司。5、基本培养基的组成及成分


本发明涉及一种对大豆进行基因转化的方法。采用农杆菌直接转化大豆萌动种子胚尖分生组织的方式，在侵染过程中采用真空渗透辅助转化的方法。该方法包括经过以下步骤大豆种子氯气灭菌、无菌水浸泡、针扎胚尖分生组织处、抽真空辅助农杆菌侵染液、共培养、育苗盘播种，植株长出第三片复叶时进行草甘膦(350mg/L)叶片涂抹；获得抗性植株即两次草甘膦涂抹筛选后均出现抗性性状的植株，移栽到大盆直至结实获得阳性转化植株的种子。本发明方法适用于多种基因型，且基因转化周期短，是一个能够用于大豆转基因育种的可靠体系。