提高的水结合能力的大豆蛋白产品的制作方法[0001]发明领域 本发明涉及近中性PH的大豆蛋白产品及它们的用途。[0002]发明背景 在转让给本受让人的2010年12月22日提交的共同待决的美国专利申请第12/975，805号(2011年7月7日公布的美国专利公开第2011-0165314号)(其公开内容通过引用并入本文)中，描述了腥味纯净、无大豆腥味的大豆蛋白产品的制备，所述大豆蛋白产品具有接近中性的天然PH并且可替代包括营养棒、焙烤食品和经处理的肉产品在内的各种食品应用中的常规大豆蛋白分离物产品。专利申请第12/975，805号也显示，可通过在产品制备中包括加热处理步骤来改变大豆蛋白产品的功能性质，其中蛋白溶解度降低并且水结合能力增加。[0003]此类大豆蛋白产品来源于在转让给本文的受让人的2009年10月21日提交的美国专利申请第12/603，087号(2010年4月22日公布的美国专利公开第2010-0098818号)和2010年10月13日提交的12/923,897(2011年2月17日公布的美国公开第2011-0038993号)(其公开内容通过引用并入本文)中描述的新大豆蛋白产品。美国专利申请第12/603，087和12/923，897号描述了新大豆蛋白产品的生产，优选地分离物的生产，所述分离物在低PH下产生透明且热稳定的溶液，并因此可用于尤其是软饮料和运动饮料，以及其它含水体系的蛋白强化，而蛋白不沉淀。[0004]其中所产生的大豆蛋白产品具有其它大豆蛋白分离物中未发现的独特的参数组合。产品在低于约4.4的酸性pH下完全可溶，并且其溶液在该pH范围内是热稳定的，允许加热处理，例如热填充应用。稳定剂或其它添加剂不是保持蛋白在溶液或混悬液中所必需的。大豆蛋白溶液没有“大 豆腥味”并且没有异味。产品肌醇六磷酸少，并且在大豆蛋白产品的生产中不需要酶。大豆蛋白产品在约pH 7下也高度可溶。[0005]具有基于干重(d.b.)至少约60重量％(N X 6.25)的大豆蛋白含量的新大豆蛋白产品，优选具有至少约90重量％的蛋白含量的分离物是通过包括以下步骤的方法来生产的: (a)用钙盐水溶液，特别是氯化钙溶液来萃取大豆蛋白源，以引起来自蛋白源的大豆蛋白溶解并形成大?蛋白水溶液，
(b)从残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，
(C)任选稀释大豆蛋白水溶液，
(d)调节大豆蛋白水溶液的pH到约1.5至约4.4，优选约2至约4，以生产酸化的澄清大豆蛋白溶液，
(e)任选加热处理经酸化的溶液以降低抗营养胰蛋白酶抑制剂的活性和微生物量，
(f)任选浓缩澄清大豆蛋白水溶液，同时通过使用选择性膜技术来保持离子强度基本恒定，
(g)任选渗滤经浓缩的大豆蛋白溶液，
(h)任选巴氏灭菌经浓缩的大豆蛋白溶液以降低微生物量，以及 (i)任选干燥经浓缩的大豆蛋白溶液。
[0006]在转让给本受让人的2010年2月11日提交的共同待决的美国专利申请第12/704，078号(2010年8月12日公布的美国专利公开第2010-0203205号)(其公开内容通过引用并入本文)中，描述了大豆蛋白产品(称为"S702")的生产，所述大豆蛋白产品具有与根据美国申请第12/603，087和12/923，897号提供的大豆蛋白产品相当的性质。在申请第12/704，078号中，通过用钙盐水溶液萃取大豆蛋白源材料来生产大豆蛋白产品，以引起来自蛋白源的大豆蛋白溶解并且形成大豆蛋白水溶液，从残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，浓缩大豆蛋白水溶液，同时通过使用选择性膜技术保持离子强度基本恒定，任选渗滤经浓缩的大豆蛋白溶液，并干燥经浓缩的大豆蛋白溶液。
[0007]在转让给本受让人的2010年3月4日提交的共同待决的美国专利申请第12/703，996号(2010年8月12日公布的美国专利公开第2010-0203204号)(其公开内容通过引用并入本文)中，描述了大豆蛋白产品(称为"S7300")的生产，所述大豆蛋白产品具有与根据US 12/603，087和12/923，897提供的大豆蛋白产品相当的性质。在申请第12/703，996号中，大豆蛋白产品通过下述来生产:用氯化钙水溶液萃取大豆蛋白源材料，以弓I起来自蛋白源的大豆蛋白溶解并形成大豆蛋白水溶液，由残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，浓缩大豆蛋白水溶液，同时通过使用选择性膜技术来保持离子强度基本恒定，任选渗滤经浓缩的大豆蛋白溶液，将经浓缩的并且任选经渗滤的大豆蛋白溶液稀释至水中以引起沉淀的形成，从稀释水分离沉淀，并干燥经分离的大豆蛋白沉淀。
[0008]在转让给本受让人的2010年I月26日提交的共同待决的美国专利申请第12/693，714号(2010年7月29日公布的美国专利公开第2010-0189853号)(其公开内容通过引用并入本文)中，描述了大豆蛋白产品(称为〃S200Ca〃)的提供，所述提供具有与根据US 12/603，087和12/923，897提供的大豆蛋白产品相当的性质。在申请第12/693，714号中，将钙盐加入到来自蛋白胶束团的沉淀的上清液，以提供具有约2 mS至约30 mS的导电率的溶液，从所得溶液去除沉淀，以留下澄清溶液，任选调节澄清溶液的PH到约1.5至约4.4，浓缩任选经pH调节的澄清溶液到约50至约400 g/L的蛋白含量，以提供澄清的经浓缩的大豆蛋白溶液，任选渗滤澄清的经浓缩的蛋白溶液，并干燥经浓缩的溶液。
[0009]发明概沭
与具有特征性大豆腥味的常规大豆蛋白分离物相比，上述美国专利申请第12/603，087、12/923，897、12/704，078、12/703，996 和 12/693，714 号中生产的大豆蛋白产
品的重要属性之一是产品纯净、无大豆腥味。
[0010]尽管大豆蛋白分离物产品的范围可用于食品用途，具有多种功能性质，以及多种预期应用，但是商业大豆蛋白分离物的一些更常见的应用是在营养棒、焙烤食品和经处理的肉产品中。
[0011]根据本发明，提供了没有常规大豆蛋白分离物的特征性大豆腥味，并且可替代各种食品(包括上述的那些)中的常规分离物的大豆蛋白产品，以提供具有改进的口味的食品，并且所述食品来源于如美国专利申请第12/704，078、12/703，996和12/693，714号中所述制备的大豆蛋白产品。通常，本文所述的程序得到具有提高的水结合能力的大豆蛋白产品O
[0012]根据本发明的一个方面，提供了生产大豆蛋白产品的方法，所述大豆蛋白产品具有基于干重至少约60重量％(N X 6.25)的大豆蛋白含量，所述方法包括:
(a)用钙盐水溶液萃取大豆蛋白源以引起来自所述蛋白源的大豆蛋白溶解以及形成大豆蛋白水溶液，
(b)从残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，
(C)浓缩所述大豆蛋白水溶液，同时通过使用选择性膜技术来保持所述离子强度基本恒定，
(d)任选渗滤经浓缩的大豆蛋白溶液，以及
(e)任选干燥经浓缩的以及任选经渗滤的大豆蛋白溶液，
其中:
(A)将从步骤(b)得到的大豆蛋白水溶液加热处理，以由其沉淀大豆蛋白并且⑴将全部经加热处理的溶液干燥以提供大豆蛋白产品或者(ii)从经加热处理的溶液回收沉淀的大豆蛋白并将回收的沉淀干燥以提供大豆蛋白产品，或者
(B)将来自步骤(d)的经浓缩的以及任选经渗滤的大豆蛋白溶液加热处理以由其沉淀大豆蛋白并且(i)将全部经加热处理的溶液干燥以提供大豆蛋白产品或者(ii)由经加热处理的溶液回收沉淀的大豆蛋白并将回收的沉淀干燥以提供大豆蛋白产品，或者
(C)将经浓缩并且任选经渗滤的大豆蛋白溶液干燥，将来自步骤(e)的经干燥的材料重新混悬于水中，如果需要，将所得溶液调节到约6的pH，并将重新混悬的材料加热处理以由其沉淀大豆蛋白并且(i)将全部经加热处理的材料干燥以提供大豆蛋白产品或者(ii)由经加热的材料回收沉淀的蛋白并将回收的沉淀的蛋白干燥以提供大豆蛋白产品。
[0013]根据本发明的另一方面，提供了生产大豆蛋白产品的方法，所述大豆蛋白产品具有基于干重至少约60重量％(N X 6.25)的大豆蛋白含量，所述方法包括:
(a)用钙盐水溶液萃取大豆蛋白源以引起来自所述蛋白源的大豆蛋白溶解并形成大豆蛋白水溶液，
(b)从残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，
(C)浓缩所述大豆蛋白水溶液，同时通过使用选择性膜技术来保持所述离子强度基本恒定，
(d)任选渗滤经浓缩的大豆蛋白溶液，
(e)将所述经浓缩的大豆蛋白溶液稀释于水中以引起沉淀的形成，
(f)从称为上清液的稀释水分离沉淀，以及
(g)任选干燥经分离的大豆蛋白沉淀，
其中:
(A)将由步骤(f)分离的大豆蛋白沉淀干燥，并将经干燥的蛋白重新混悬于水中，如果需要，将所得混悬液调节到约6的pH，将混悬液加热处理并且(i)将全部经加热处理的混悬液干燥以提供大豆蛋白产品或者(ii)由经加热的混悬液回收不溶性蛋白并将回收的不溶性蛋白干燥以提供大豆蛋白产品，或者
(B)将由步骤(f)分离的大豆蛋白沉淀重新混悬于水中，并将混悬液加热处理并且
(i)将全部经加热处理的溶液干燥以提供大豆蛋白产品或者(ii)由经加热处理的混悬液回收不溶性蛋白并将回收的不溶性蛋白干燥以提供大豆蛋白产品。
[0014]根据本发明的又一方面，提供了一种制备大豆蛋白产品的方法，所述大豆蛋白产品具有基于干重至少约60重量％(N X 6.25)的蛋白含量,所述方法包括:
(a)加入钙盐或其它二价盐至来自大豆蛋白胶束团的沉淀的上清液，以提供约2mS至约30 mS的导电率，
(b)从所得溶液中去除沉淀，以留下澄清溶液，
(c)调节澄清溶液的PH到约1.5至约4.4，
(d)将所述经pH调节的澄清溶液浓缩至约50至约400g/L的蛋白含量，以提供澄清的经浓缩的大豆蛋白溶液，
(e)任选渗滤澄清的经浓缩的蛋白溶液，以及
(f)任选干燥经浓缩的和任选经渗滤的溶液，
其中:
(A)将经浓缩并且任选经渗滤的溶液在步骤(f)中干燥并使经干燥的大豆蛋白产品形成水溶液，将所述水溶液的PH增至约pH6以由其沉淀大豆蛋白，将经pH调节的材料任选加热处理，并且(i)将全部经PH调节的材料干燥以提供大豆蛋白产品或者由经pH调节的材料回收沉淀并将回收的沉淀干燥以提供大豆蛋白产品，或者
(B)将步骤(e)中经浓缩的并且任选经渗滤的溶液的pH增至约6以由其沉淀大豆蛋白，将经PH调节的材料任选加热处理并且(i)将全部经pH调节的材料干燥以提供大豆蛋白材料或者(ii)由经PH调节的材料回收沉淀并将回收的沉淀干燥以提供大豆蛋白产品。
[0015]根据本发明的又一方面，提供了生产大豆蛋白产品的方法，所述大豆蛋白产品具有基于干重至少60重量％ (N X 6.25)的大豆蛋白含量,所述方法包括:
(a)用氯化钠水溶液萃取大豆蛋白源以引起来自所述蛋白源的大豆蛋白溶解以及形成大豆蛋白水溶液，
(b)从残余大豆蛋白源分离大豆蛋白水溶液，
(c)调节大豆蛋白溶液的pH到约4.5以引起大豆蛋白的沉淀，
(d)回收沉淀的大豆蛋白，
(e)任选调节回收的大豆蛋白的pH到约6，以及
(f)干燥回收并且任选经PH调节的大豆蛋白，
其中依照PH调节步骤(c)，将经pH调节的材料加热处理，然后回收沉淀，任选调节回收的沉淀的蛋白的PH并且干燥回收的沉淀的蛋白以提供大豆蛋白产品。
[0016]虽然本发明主要涉及大豆蛋白分离物的生产和使用，但也可以想到可以提供并使用具有和大豆蛋白分离物类似性质的较低纯度的大豆蛋白产品。这种较低纯度产品可具有至少约60重量％(N X 6.25) d.b.的蛋白浓度。
[0017]_
发明的一般描述
根据共同待决的美国申请第12/704，078和12/703，996号的程序，提供大豆蛋白产品的方法的最初步骤涉及使来自大豆蛋白源的大豆蛋白溶解。大豆蛋白源可以为大豆，或者从大豆加工得到的任何大豆产品或副产品,包括但不限于大豆柏(soy meal)、大豆片、大豆粒(soy grits)和大豆粉(soy flour)。大豆蛋白源可以全脂形式、部分脱脂形式或完全脱脂形式使用。在大豆蛋白源含有可观的脂肪量时，一般在方法中需要除油步骤。从大豆蛋白源回收的大豆蛋白可以为天然存在于大豆的蛋白，或者，似蛋白(proteinaceous)材料可以为通过基因操纵改性的蛋白但其具有天然蛋白的特征疏水性和极性特征。
[0018]尽管可使用其它钙盐的溶液,然而最方便地使用食品级氯化钙溶液来实施来自大豆蛋白源材料的蛋白溶解。在大豆蛋白产品意欲用于非食品用途时，可使用非食品级化学品。另外，也可使用其它碱土金属盐，例如镁盐。此外，也可使用与其它盐溶液，例如氯化钠结合的钙盐溶液来实施来自大豆蛋白源的大豆蛋白的萃取。另外，可使用水或其它盐溶液，例如氯化钠溶液，与钙盐，例如氯化钙来实施来自大豆蛋白源的大豆蛋白的萃取，随后将其加入萃取步骤中产生的大豆蛋白水溶液。然后，将加入钙盐时形成的沉淀去除，之后实施随后的处理。
[0019]随着钙盐溶液浓度增加，来自大豆蛋白源的蛋白的溶解度开始增加，直至达到最大值。盐浓度的任何随后增加均不会增加总的溶解蛋白。引起最大蛋白溶解的钙盐溶液的浓度取决于涉及的盐而改变。通常优选利用低于约1.0 M的浓度值，并且更优选约0.10 M至约0.15 M的数值。
[0020]在批次过程中，蛋白的盐溶解在约TC至约100°C，优选约15°C至约65°C，更优选约15°C至约35°C的温度下实施，优选伴随搅拌，以减少溶解时间，溶解时间通常约I至约60分钟。优选实施溶解以基本上从大豆蛋白源萃取可行的尽可能多的蛋白，以提供总体高产
品产率。
[0021 ] 在连续过程中，从大豆蛋白源萃取大豆蛋白按照和从大豆蛋白源实施大豆蛋白的连续萃取一致的任何方式实施。在一个实施方案中，使大豆蛋白源与钙盐溶液连续混合，根据本文所述参数通过具有一定长度的管或导管并以一定流速运送混合物持续足以实施期望的萃取的停留时间。在此连续过程中，在最多约10分钟时间内快速实施盐溶解步骤，优选实施溶解以基本上从大豆蛋白源萃取可行的尽可能多的蛋白。在连续过程中的溶解在约1°C和约100°C之间，优选约15°C和约65°C之间，更优选约15°C和约35°C之间的温度下实施。
[0022]一般在约5至约11，优选约5至约7的pH下实施萃取。如果需要，通过根据需要使用任何合适的酸(通常为盐酸)，或者碱(通常为氢氧化钠)，可将萃取体系(大豆蛋白源和钙盐溶液)的pH调节到约5至约11范围内的任何期望值，以用于萃取步骤。
[0023]在溶解步骤期间，钙盐溶液中大豆蛋白源的浓度可宽泛地变化。典型浓度值为约5 w/v 至约 15% w/vo
[0024]从萃取步骤得到的蛋白溶液一般具有约5g/L至约50 g/L,优选约10g/L至约50g/L的蛋白浓度。
[0025]用盐水溶液的蛋白萃取步骤有使大豆蛋白源中可能存在的脂肪溶解的另外的作用，这又造成脂肪存在于水相中。
[0026]钙盐水溶液可含有抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。所用抗氧化剂的量可以从溶液的约0.01至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制蛋白溶液中任何酚类的氧化。
[0027]然后，从萃取步骤得到的含水相可以以任何合适的方式从残余大豆蛋白源分离，例如，利用沉降式离心机或任何适合的筛，随后碟式离心和/或过滤，以去除残余的大豆蛋白源材料。可将经分离的残余蛋白源材料干燥用于处理。可选地，可处理经分离的残余大豆蛋白源，以回收一些残余蛋白。可用新鲜钙盐溶液和澄清时得到的蛋白溶液与初始蛋白溶液组合来重新萃取经分离的残余大豆蛋白源，用于如下所述进一步处理。或者，可通过常规等电沉淀过程或任何其它合适的过程处理经分离的残余大豆蛋白源以回收这些残余蛋白。
[0028]在大豆蛋白源含有显著量的脂肪时，如转让给本文的受让人的美国专利第5，844，086和6，005，076号(其公开内容通过引用并入本文)所述，则其中所述的脱脂步骤可对经分离的蛋白水溶液实施。可选地，可通过任何其它合适的方法完成经分离的蛋白水溶液的脱脂。
[0029]大豆蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适的条件下实施，一般在经分离的蛋白水溶液的环境温度下进行。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v,优选约0.05%至约2% w/v的量。可通过任何合适的方法例如通过过滤从大豆溶液去除吸附剂。
[0030]如果纯度足够，可直接干燥所得大豆蛋白水溶液，以生产大豆蛋白产品。为了减小杂质含量，可在干燥前处理大豆蛋白水溶液。
[0031]可浓缩大豆蛋白水溶液，以增加其蛋白浓度，同时保持其离子强度基本恒定。一般实施此浓缩，以提供具有约50g/L至约400g/L，优选约100g/L至约250g/L的蛋白浓度的经浓缩的大豆蛋白溶液。
[0032]浓缩步骤可以与批次操作或连续操作一致的任何合适的方式实施，例如，通过利用任何合适的选择性膜技术，如使用膜(比如空心纤维膜或螺旋缠绕膜)的超滤或渗滤，所述膜按照不同的膜材料和结构具有适合的截留分子量，比如约3，000至约1，000，000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿，并且对于连续操作，该尺寸在蛋白水溶液通过膜时允许期望浓度。
[0033]众所周知，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量物种从其中通过，同时防止较高分子量物种从其中通过。低分子量物种不仅包括食品级盐的离子物种，而且包括从源材料萃取的低分子量材料，如碳水化合物、颜料、低分子量蛋白和抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂，这些本身为低分子量蛋白。通常按照不同膜材料和结构选择膜的截留分子量，以保证在溶液中保留显著比例的蛋白，同时允许污染物通过。
[0034]然后，在完成浓缩前后，使用钙盐溶液，例如氯化钙在与萃取溶液相同pH和相同钙盐浓度下的溶液，使经浓缩的大豆蛋白溶液经受渗滤步骤。如果期望降低保留物的盐含量，所用渗滤溶液可以是相同PH但盐浓度比萃取溶液低的钙盐水溶液。然而，必须选择渗滤溶液的盐浓度，以便保留物中的盐水平保持足够高，以保持期望的蛋白溶解性。如上所述，优选渗滤溶液的pH等于经渗滤的蛋白溶液的pH。可用任何合适的酸(例如盐酸或磷酸)或碱(例如氢氧化钠)来调节渗滤溶液的pH。可用约I至约40体积的渗滤溶液，优选约2至约25体积的渗滤溶液实施此渗滤。在渗滤操作中，通过用渗透物通过膜，可从大豆蛋白水溶液去除进一步的量的污染物。可实施渗滤操作直至渗透物中不存在显著进一步的量的污染物或可见颜色或直至已将保留物充分纯化，以便在干燥时提供具有期望的蛋白含量的大豆蛋白产品，优选分离物具有基于干重至少约90重量％的蛋白含量。可用与浓缩步骤相同的膜实施此渗滤。然而，如果期望的话，可按照不同膜材料和结构使用具有不同截留分子量的分离膜实施渗滤步骤，例如具有约3，000至约1，000, 000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿范围的截留分子量的膜。
[0035]浓缩步骤和渗滤步骤可以在本文中按这样的方式实施，即随后通过干燥经浓缩和渗滤的保留物所回收的大豆蛋白产品含有小于约90重量％蛋白(N x6.25) d.b.，例如至少约60重量％蛋白(N x6.25) d.b.。通过部分浓缩和/或部分渗滤大豆蛋白水溶液，可仅部分去除污染物。然后，可干燥此蛋白溶液，以提供具有较低纯度水平的大豆蛋白产品。此大豆蛋白产品仍能够在酸性条件下生产澄清蛋白溶液。
[0036]在渗滤步骤的至少一部分期间，在渗滤介质中可存在抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，且可以从约0.01至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制经浓缩的大豆蛋白溶液中存在的任何酚类的氧化。
[0037]浓缩步骤和渗滤步骤可在任何合适的温度(一般约2°至约65°C，优选约20°至约35°C)实施一段时间，以实现期望的浓缩和渗滤度。在某种程度上，使用的温度和其它条件取决于用于实施膜处理的膜设备、期望的溶液蛋白浓度和对于渗透物去除污染物的效率。
[0038]在大豆中有两种主要的胰蛋白酶抑制剂，即Kunitz抑制剂(其是具有约21，000道尔顿分子量的热不稳定分子)和Bowman-Birk抑制剂(其是具有约8，000道尔顿分子量的较热稳定分子)。最终大豆蛋白产品中胰蛋白酶抑制剂活性的水平可通过操纵各种工艺变量来控制。
[0039]例如，可按有利于与其它污染物一起去除渗透物中的胰蛋白酶抑制剂的方式操作浓缩和/或渗滤步骤。通过使用较大孔径(例如约30，000至约1，000, 000道尔顿)的膜、在升高的温度(例如约30°C至约65°C )操作膜和利用较大体积(如约10至约40体积)的渗滤介质，促进胰蛋白酶抑制剂的去除。
[0040]此外，通过使大豆材料暴露于使抑制剂的二硫化物键破坏或重排的还原剂，可实现胰蛋白酶抑制剂活性的降低。适合的还原剂包括亚硫酸钠、半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸。
[0041]可在整个过程的不同阶段实施此还原剂的加入。还原剂可与大豆蛋白源材料在萃取步骤中加入、可在残余大豆蛋白源材料去除后加入到澄清的大豆蛋白水溶液、可在渗滤之前或之后加入到经浓缩的蛋白溶液或者可与经干燥的大豆蛋白产品干混。还原剂的加入可与上述膜处理步骤组合。
[0042]如果期望在经浓缩的蛋白溶液中保留活性胰蛋白酶抑制剂，则这可通过利用具有较小孔径的浓缩和渗滤膜、在较低温度操作膜、利用较小体积的渗滤介质和不利用还原剂而实现。
[0043]如果需要，可使经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液经受进一步脱脂操作，如美国专利第5，844，086和6，005，076号所述。可选地，可通过任何其它合适方法实现经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液的脱脂。
[0044]经浓缩和任选渗滤的蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适条件下实施，一般在经浓缩的蛋白水溶液的环境温度下。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v,优选约0.05%至约2% w/v的量。可通过任何合适方法(例如通过过滤)从大豆蛋白溶液去除吸附剂。
[0045]可使从任选脱脂和任选吸附剂处理步骤得到的经浓缩和任选渗滤的大豆蛋白溶液经受巴氏灭菌步骤，以降低微生物量。此巴氏灭菌可在任何期望的巴氏灭菌条件下实施。一般将经浓缩和任选渗滤的大豆蛋白溶液加热到约55°至约70°C，优选约60°至约65°C的温度约30秒钟至约60分钟，优选约10至约15分钟。然后，可使经巴氏灭菌，浓缩的大豆蛋白溶液冷却优选至约15°至约35°C温度，用于干燥或进一步处理。
[0046]根据上述共同待决的美国专利申请第12/704，078号，可通过任何合适的技术，例如喷雾干燥或冷冻干燥来干燥经浓缩并且任选经渗滤的澄清的大豆蛋白水溶液，以得到大豆蛋白产品。可选地，可将经浓缩并且任选经渗滤的大豆蛋白溶液的PH调节到约2.0至约4.0。pH调节可按任何合适的方式实施，例如加入盐酸或磷酸。然后使所得酸化大豆蛋白溶液干燥。作为另一种替代，可使经pH调节的大豆蛋白溶液经受加热处理，以使热不稳定抗营养因子(如以上提到的胰蛋白酶抑制剂)失活。此加热步骤也提供降低微生物量的另外益处。一般将蛋白溶液加热到约70°至约160°C约10秒钟至约60分钟，优选约80°至约120°C的温度约10秒钟至约5分钟，更优选约85°至约95°C约30秒钟至约5分钟。然后，可使经加热处理的酸化大豆蛋白溶液冷却到约2°C至约65°C，优选约20°至约35°C的温度。然后将所得酸化的、经加热处理的大豆蛋白溶液干燥。
[0047]根据共同待决的美国专利申请第12/703，996号，将从浓缩步骤和任选渗滤步骤、任选脱脂步骤、任选吸附剂处理步骤以及任选巴氏灭菌步骤得到的经浓缩的蛋白溶液稀释，以通过将经浓缩的蛋白溶液与具有所需体积的水混合以达到所需稀释度来使沉淀形成。当由称为上清液的残余水相分离沉淀的蛋白时，稀释度一般为约5倍至约25倍，优选约10倍至约20倍。与经浓缩的蛋白溶液混合的水优选具有约1°至约65°C，优选约15°至约35 °C的温度。
[0048]在批次操作中，将经浓缩的蛋白溶液批次加入到如上讨论具有期望体积的水的静态主体。经浓缩的蛋白溶液的稀释和随后离子强度的减小引起蛋白沉淀的形成。在批次程序中，使蛋白沉淀在水体中沉降。可通过例如离心帮助沉降。由此引起的沉降减小水分含量以及沉淀的蛋白的包藏盐含量。
[0049]可选地，可通过使经浓缩的蛋白溶液连续通过T形管的一个入口，同时将稀释水进料T形管的另一个入口，允许管中混合而连续实施稀释操作。稀释水以足以实现期望的经浓缩的蛋白溶液的稀释度的速率进料到T形管。
[0050]经浓缩的蛋白溶液和稀释水在管中的混合引起蛋白沉淀的形成，并且混合物从T形管的出口连续进料到沉降容器，在充满时，允许上清液从该沉降容器溢出。混合物优选以使液体主体内的湍流最小的方式进料到沉降容器中的液体主体内。
[0051]在连续过程中，使蛋白沉淀在沉降容器中沉降，并使此过程继续，直到所需量的沉淀已积聚在沉降容器的底部，然后从沉降容器去除积聚的沉淀。通过沉淀代替沉积，可通过离心连续分离沉淀。
[0052]与批次过程相比，通过利用连续过程回收大豆蛋白沉淀，对于相同水平的蛋白萃取，初始蛋白萃取步骤的时间可显著减少。另外，在连续操作中，存在比批次过程更少的污染机会，引起更高的产品质量，并且可以在更紧凑的设备中实施此过程。
[0053]通过例如从沉降的团倾析残余含水相，或者通过离心，从残余含水相或上清液分离沉降的沉淀。可洗涤沉淀以去除残余上清液，例如用约I至约10，优选约2至约3体积的水，且然后如上所述再次回收沉淀。任选洗涤的沉淀可以湿的形式使用，或者可通过任何合适技术(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥成干燥形式。干燥沉淀具有超过约60重量％蛋白，优选至少约90重量％蛋白(N X 6.25)，并且更优选至少约100重量％(N x 6.25)的高蛋白含量。该干燥沉淀的肌醇六磷酸含量低，一般小于约1.5重量％。
[0054]如上所述，可直接干燥稀释步骤中形成的沉降的蛋白沉淀以得到蛋白产品。可选地，可将湿蛋白沉淀重新混悬于水(例如约2至约3体积)中，并通过使用任何合适的酸(例如盐酸或磷酸)将样品的PH调节至约1.5至约4.4，优选约2.0至约4.0来再溶解。然后，澄清蛋白溶液可可通过任何合适技术(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥成干燥形式。干燥蛋白产品具有超过约60重量％蛋白，优选至少约90重量％蛋白，更优选至少约100重量％蛋白(N X 6.25)的蛋白含量。
[0055]作为另一种替代，可使澄清、酸化、再溶解的大豆蛋白溶液经受加热处理，以使任何剩余的热不稳定的抗营养因子失活。此加热步骤也提供降低微生物量的其它益处。一般将蛋白溶液加热到约70°至约160°C温度约10秒钟至约60分钟，优选约80°至约120°C的温度约10秒钟至约5分钟，更优选约85°至约95°C约30秒钟至约5分钟。然后，为了如下所述进一步处理，可使经加热处理的酸化大豆蛋白溶液冷却到约2°至约65°C，优选约20°至约35 °C的温度。
[0056]将经酸化并且任选经加热处理的澄清溶液浓缩，以增加其蛋白浓度。此浓缩用任何合适的选择性膜技术实施，如使用膜的超滤或渗滤，所述膜具有适合的截留分子量，允许低分子量物种(包括盐、碳水化合物、颜料、胰蛋白酶抑制剂和从蛋白源材料萃取的其它低分子量材料)通过该膜，同时在溶液中保留显著比例的大豆蛋白。可按照不同膜材料和结构使用具有约3，000至1，000，000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿的截留分子量的超滤膜。以此方式浓缩蛋白溶液也降低所需液体的体积，所述液体要被干燥以回收蛋白。在干燥前，蛋白溶液一般浓缩到约50g/L至约300 g/L，优选约100至约200 g/L的蛋白浓度。此浓缩操作可如上所述按批次方式或按连续操作实施。
[0057]在使用水完成浓缩之前或之后,可使大豆蛋白溶液经受渗滤步骤。水可为其天然pH，或等于被渗滤的蛋白溶液的pH或为之间的任何pH。可用约I至约40体积的渗滤溶液，优选约2至约25体积的渗滤溶液实施此渗滤。在渗滤操作中，通过用渗透物通过膜，可从澄清大豆蛋白水溶液去除进一步的量的污染物。可实施渗滤操作直至渗透物中不存在显著进一步的量的污染物或可见颜色或直至已将保留物充分纯化，以便在干燥时提供具有期望的蛋白含量的大豆蛋白产品，优选分离物具有至少约90重量％(N X 6.25) d.b.的蛋白含量。可用与浓缩步骤相同的膜实施此渗滤。然而，如果期望的话，可按照不同膜材料和结构使用具有不同截留分子量的分离膜实施渗滤步骤，例如具有约3，000至约1，000, 000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿范围内的截留分子量的膜。
[0058]浓缩步骤和渗滤步骤可以在本文中按这样的方式实施:随后通过干燥经浓缩和渗滤的保留物所回收的大豆蛋白产品含有小于约90重量％蛋白(N x6.25) d.b.，例如至少约60重量％蛋白(N x6.25) d.b.。通过部分浓缩和/或部分渗滤大豆蛋白水溶液，可仅部分去除污染物。然后，可干燥此蛋白溶液，以提供具有较低纯度水平的大豆蛋白产品。此大豆蛋白产品仍能够在酸性条件下生产澄清蛋白溶液。
[0059]在渗滤步骤的至少一部分期间，在渗滤介质中可存在抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，且可以从约0.01重量％至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制经浓缩的大豆蛋白溶液中存在的任何酚类的氧化。
[0060]任选的浓缩步骤和任选的渗滤步骤可在任何合适的温度(一般约2°至约65°C，优选约20°至约35°C)实施一段时间，以实现期望的浓缩和渗滤度。在某种程度上，使用的温度和其它条件取决于实施膜处理使用的膜设备、期望的溶液蛋白浓度和对于渗透物去除污染物的效率。
[0061]如上所述，最终大豆蛋白产品中胰蛋白酶抑制剂活性的水平可通过操纵各种工艺变量来控制。
[0062]如前提到，可使用酸化的大豆蛋白水溶液的加热处理使热不稳定胰蛋白酶抑制剂失活。也可加热处理经部分浓缩或完全浓缩的酸化的大豆蛋白溶液，以使热不稳定的胰蛋白酶抑制剂失活。
[0063]另外，可按有利于与其它污染物一起去除渗透物中的胰蛋白酶抑制剂的方式操作浓缩和/或渗滤步骤。通过使用较大孔径(例如30，000至1，000, 000道尔顿)的膜、在升高的温度(例如30°至65°C )操作膜和利用较大体积(如10至40体积)的渗滤介质,可促进胰蛋白酶抑制剂的去除。
[0064]与在较高pH (3至4.4)处理溶液相比，在较低pH (1.5至3)酸化和膜处理蛋白溶液可降低胰蛋白酶抑制剂活性。当在PH范围的低端浓缩和渗滤蛋白溶液时，可期望在干燥前提高保留物的PH。通过加入任何合适的食品级碱，如氢氧化钠，可使经浓缩和渗滤的蛋白溶液的PH提高到期望的值，例如pH3。
[0065]此外，通过使大豆材料暴露于使抑制剂的二硫化物键破坏或重排的还原剂，可实现胰蛋白酶抑制剂活性的还原。适合的还原剂包括亚硫酸钠、半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸。
[0066]可在全部过程的不同阶段实施此还原剂的加入。可将还原剂加入到从稀释步骤得到的湿蛋白沉淀，加入到通过酸化和再溶解沉淀形成的蛋白溶液，在渗滤前或后加入到经浓缩的溶液或与经干燥的大豆蛋白产品干燥混合。还原剂的加入可与上述加热处理步骤和膜处理步骤组合。
[0067]如果期望在经浓缩的蛋白溶液中保留活性胰蛋白酶抑制剂，则这可通过消除或降低加热处理步骤的强度、不利用还原剂、在PH范围的高端(3至4.4)操作浓缩和渗滤步骤、利用具有较小孔径的浓缩和渗滤膜、在较低温度操作膜和利用较小体积的渗滤介质而实现。
[0068]经酸化、任选浓缩和任选渗滤的澄清蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适条件下实施，一般在蛋白溶液的环境温度下。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v，优选约0.05%至约2% w/v的量。可通过任何合适方法(例如通过过滤)从大豆蛋白溶液去除吸附剂。
[0069]然后，可通过任何合适的技术，例如喷雾干燥或冷冻干燥将酸化的、任选经浓缩并且任选经渗滤的澄清大豆蛋白水溶液干燥。干燥大豆蛋白产品具有至少约60重量％(N X6.25) d.b.，优选超过约90重量％ (N x 6.25) d.b.，更优选至少约100重量％ (N x 6.25)d.b.的蛋白含量。该大豆蛋白产品的肌醇六磷酸含量低，一般小于约1.5重量％。
[0070]根据本发明的另一方面，可将稀释于水中时沉淀的蛋白与上清液一起处理。在这种情况下，稀释度一般为约I至25倍，优选约3至约12倍。与经浓缩的蛋白溶液混合的水具有约I °至约60°C，优选约15°至约35°C的温度。
[0071]使用任何合适的酸(例如盐酸或磷酸)将含有沉积的蛋白沉淀的稀释水的pH调节到约1.5至约4.4，优选约2.0至约4.0。pH的下降引起通过稀释沉积的蛋白再溶解，得到澄清、酸化的蛋白溶液。蛋白溶液可以湿的形式使用，或者可通过任何合适技术(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥成干燥形式。
[0072]作为另一种替代，可利用如上所述与通过酸化再溶解分离的沉淀的相同步骤来处理通过酸化蛋白沉淀和上清液的混合物形成的蛋白溶液。
[0073]然后可通过任何合适的技术，例如喷雾干燥或冷冻干燥，将任选经浓缩的、任选经渗滤的、任选经加热处理的、任选经吸附剂处理的澄清的大豆蛋白水溶液干燥。干燥大豆蛋白产品具有超过约60重量％蛋白，优选至少约90重量％，更优选约100重量％(N X 6.25)d.b.的蛋白含量。
[0074]根据共同待决的美国专利申请第12/693，714号中描述的程序，提供大豆蛋白产品的方法的最初步骤也包括使来自大豆蛋白源的大豆蛋白溶解。大豆蛋白源也可以为大豆，或者从大豆加工得到的任何大豆产品或副产品，包括但不限于大豆柏、大豆片、大豆粒和大豆粉。大豆蛋白源可以全脂形式、部分脱脂形式或完全脱脂形式使用。在大豆蛋白源含有可观的脂肪量时，一般在工艺中需要除油步骤。从大豆蛋白源回收的大豆蛋白可以为天然存在于大豆的蛋白，或者，似蛋白材料可以为通过基因操纵改性的蛋白但其具有天然蛋白的特征性疏水性和极性特性。
[0075]蛋白溶解可通过使用食品级钠盐溶液(例如食品级氯化钠溶液)实施。在大豆蛋白产品用于非食品用途时，可使用非食品级化学品。也可使用其它单价盐，如氯化钾。随着盐溶液浓度增加，来自大豆蛋白源的蛋白的溶解度开始增加，直至达到最大值。盐浓度的任何随后增加均不会增加总的溶解蛋白。引起最大蛋白溶解的盐溶液的浓度取决于涉及的盐而改变。钠盐溶液的浓度选择也受希望通过胶束途径得到的蛋白的比例影响。较高盐浓度(优选约0.5M至约1.0M) 一般在将经浓缩的大豆蛋白溶液稀释到冷水时得到更多蛋白胶束团。可用较高浓度的氯化钠溶液实施萃取，或者可选地，可用小于0.5M氯化钠(例如0.1OM或0.15M氯化钠)的溶液实施萃取，且然后，在去除大豆蛋白源后，向大豆蛋白溶液加入另外的盐。
[0076]在批次过程中，蛋白的盐溶解在约1°C至约100°C (优选约15°C至约35°C )的温度下实施，优选伴随搅拌，以减小溶解时间，溶解时间通常约I至约60分钟。优选实施溶解以基本上从大豆蛋白源萃取可行的尽可能多的蛋白，以提供总的高产品产率。
[0077]在连续过程中，从大豆蛋白源萃取蛋白按照和从大豆蛋白源实施蛋白的连续萃取一致的任何方式进行。在一个实施方案中，使大豆蛋白源与食品级盐溶液连续混合，根据本文所述参数通过具有一定长度的管或导管并以一定流速运送混合物足以实施期望的萃取的停留时间。在此连续过程中，在最多约10分钟时间内快速实施盐溶解步骤，优选实施溶解以基本上从大豆蛋白源萃取可行的尽可能多的蛋白。连续过程中的溶解在约1°C和约100°C之间，优选约15°C和约35°C之间的温度下实施。
[0078]萃取可在大豆蛋白源/盐溶液体系的天然pH(—般约5至约7)实施。可选地，为了用于萃取步骤，可根据需要使用任何合适的酸(通常为盐酸)或碱(通常为氢氧化钠)，将萃取的PH调节到约5至约7范围内的任何期望值。
[0079]在溶解步骤期间，大豆蛋白源在食品级盐溶液中的浓度可宽泛地变化。一般浓度值为约5至约15% w/v ο
[0080]用盐水溶液的蛋白萃取步骤有使大豆蛋白源中可能存在的脂肪溶解的另外的作用，这又造成脂肪存在于水相中。
[0081]从萃取步骤得到的蛋白溶液一般具有约5g/L至约50 g/L,优选约10g/L至约50g/L的浓度。
[0082]盐水溶液可含有抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。所用抗氧化剂的量可以从溶液的约0.01至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制蛋白溶液中任何酚类的氧化。
[0083]然后，从萃取步骤得到的水相可以以任何合适的方式从残余大豆蛋白源分离，例如，利用沉降式离心机或任何适合的筛，随后碟式离心和/或过滤，以去除残余的大豆蛋白源材料。经分离的残余大豆蛋白源可干燥用于处理。可选地，可处理经分离的残余大豆蛋白源，以回收一些残余蛋白。可用新鲜钠盐溶液和澄清时得到的蛋白溶液与初始蛋白溶液组合来重新萃取经分离的残余大豆蛋白源，用于如下所述进一步处理。可选地，可通过常规等电沉淀过程或任何其它合适的过程处理经分离的残余大豆蛋白源，以回收这些残余蛋白。
[0084]在大豆蛋白源含有显著量的脂肪时，如转让给本文的受让人的美国专利第5，844，086和6，005，076号(其公开内容通过引用并入本文)所述，则其中所述的脱脂步骤可对经分离的蛋白水溶液实施。可选地，可通过任何其它合适的方法完成经分离的蛋白水溶液的脱脂。
[0085]大豆蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适的条件下实施，一般在经分离的蛋白水溶液的环境温度下。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v，优选约0.05%至约2% w/V的量。可通过任何合适的方法例如通过过滤从大豆蛋白溶液去除吸附剂。
[0086]作为用盐水溶液萃取大豆蛋白源的替代，可只用水实施此萃取。在利用此替代时，则可在从残余大豆蛋白源分离后，以上面讨论的浓度将盐加入到蛋白溶液。在实施第一脂肪去除步骤时，一般在此操作完成后加入盐。
[0087]另一种替代过程是用食品级盐溶液在高于约7，一般上至约11的相对高pH下萃取大豆蛋白源。可用任何合适的食品级碱(如氢氧化钠水溶液)将萃取体系的pH调节到期望的碱值。可选地，可用盐溶液在低于约PH5，一般低至约pH3的相对低pH下萃取大豆蛋白源。可通过使用任何合适的食品级酸(如盐酸或磷酸)将萃取体系的pH调节到期望的酸值。在利用此替代时，则然后从大豆蛋白源萃取步骤得到的水相以任何合适的方式从残余大豆蛋白源分离，例如，利用沉降式离心机，随后碟式离心和/或过滤，以去除残余大豆蛋白源。如上所讨论，经分离的残余大豆蛋白源可干燥用于处理，或经进一步处理，以回收残余蛋白。
[0088]然后，在如下讨论的进一步处理前，将从高或低pH萃取步骤得到的大豆蛋白水溶液调节PH到约5至约7的范围，如上讨论。此pH调节可适当用任何合适的酸(如盐酸)或碱(如氢氧化钠)实施。如果需要，在pH调节后和进一步处理前，可通过任何合适的过程如离心或过滤使蛋白溶液澄清。[0089]可浓缩大豆蛋白水溶液，以增加其蛋白浓度，同时保持其离子强度基本恒定。一般实施此浓缩，以提供具有约50 g/L至约400 g/L，优选约100g/L至约250 g/L的蛋白浓度的经浓缩的蛋白溶液。
[0090]浓缩步骤可以与批次操作或连续操作一致的任何合适的方式实施，例如，通过利用任何合适的选择性膜技术，如使用膜(比如空心纤维膜或螺旋缠绕膜)的超滤或渗滤，所述膜按照不同的膜材料和结构具有适合的截留分子量，比如约3，000至约1，000，000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿，并且对于连续操作，其尺寸在蛋白水溶液通过膜时允许期望浓度。
[0091]众所周知，超滤和类似的选择性膜技术允许低分子量物种通过膜，同时防止较高分子量物种通过。低分子量物种不仅包括食品级盐的离子物种，而且包括从源材料萃取的低分子量材料，如碳水化合物、颜料、低分子量蛋白和抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂，这些本身为低分子量蛋白。通常按照不同膜材料和结构选择膜的截留分子量，以保证在溶液中保留显著比例的蛋白，同时允许污染物通过。
[0092]可在完全浓缩之前或之后，使蛋白溶液经受渗滤步骤，优选使用与萃取溶液相同摩尔浓度和pH的盐水溶液。可用约I至约40体积的渗滤溶液，优选用约2至约25体积的渗滤溶液实施渗滤。在渗滤操作中，通过用渗透物通过膜，从蛋白水溶液去除其它量的污染物。可实施渗滤操作直到在渗透物中不存在显著的进一步的量的污染物或可见颜色。可用与浓缩步骤相同的膜实施此渗滤。然而，如果期望的话，可按照不同膜材料和结构使用具有不同截留分子量的分离膜实施渗滤步骤，膜例如具有约3，000至约1，000, 000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿范围的截留分子量的膜。
[0093]在渗滤步骤的至少一部分期间，在渗滤介质中可存在抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，且可以从约0.01至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制经浓缩的大豆蛋白溶液中存在的任何酚类的氧化。
[0094]浓缩步骤和任选的渗滤步骤可在任何合适的温度(一般约2°至约65°C，优选约20°至约35°C)实施一段时间，以实现期望的浓缩和渗滤度。在某种程度上，使用的温度和其它条件取决于实施膜处理使用的膜设备、期望的溶液蛋白浓度和对于渗透物去除污染物的效率。
[0095]在大豆中有两种主要的胰蛋白酶抑制剂，即Kunitz抑制剂(具有约21，000道尔顿分子量的热不稳定分子)和Bowman-Birk抑制剂(具有约8，000道尔顿分子量的较热稳定分子)。最终大豆蛋白分离物中胰蛋白酶抑制剂活性的水平可通过操纵各种工艺变量来控制。
[0096]例如，可按有利于与其它污染物一起去除渗透物中的胰蛋白酶抑制剂的方式操作浓缩和/或渗滤步骤。通过使用较大孔径(例如约30，000至约1，000，OOODa)的膜、在升高的温度(例如约30至约65°C )操作和利用较大体积(如约10至约40体积)的渗滤介质，可促进胰蛋白酶抑制剂的去除。
[0097]此外，通过使大豆材料暴露于使抑制剂的二硫化物键破坏或重排的还原剂，可实现胰蛋白酶抑制剂活性的降低。适合的还原剂包括亚硫酸钠、半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸。[0098]可在全部过程的不同阶段实施此还原剂的加入。还原剂可与大豆蛋白源材料一起在萃取步骤中加入、可在残余大豆蛋白源材料去除后加入到澄清的大豆蛋白水溶液、可在渗滤之前或之后加入到经浓缩的蛋白溶液或者可与经干燥的大豆蛋白产品干混。还原剂的加入可与上述膜处理步骤组合。
[0099]如果期望在经浓缩的蛋白溶液中保留活性胰蛋白酶抑制剂，则这可通过利用具有较小孔径的浓缩和渗滤膜、在较低温度操作膜、利用较小体积的渗滤介质和不利用还原剂而实现。
[0100]如果需要，可使经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液经受进一步脱脂操作，如美国专利第5，844，086和6，005，076号所述。可选地，可通过任何其它合适方法实现经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液的脱脂。
[0101]经浓缩和渗滤的蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适条件下实施，一般在经浓缩的蛋白溶液的环境温度下。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v,优选约0.05%至约2% w/v的量。可通过任何合适方法(例如通过过滤)从大豆蛋白溶液去除吸附剂。
[0102]可使从任选脱脂和任选吸附剂处理步骤得到的经浓缩和任选渗滤的大豆蛋白溶液经受巴氏灭菌步骤，以降低微生物量。此巴氏灭菌可在任何期望的巴氏灭菌条件下实施。一般将经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液加热到约55°至约70°C，优选约60°至约65°C的温度约30秒钟至约60分钟，优选约10分钟至约15分钟。然后，可使经巴氏灭菌，浓缩的蛋白溶液优选冷却到约25。至约40°C温度，用于如下所述进一步处理。
[0103]如果需要，作为上述离子强度调节操作的替代，可通过加盐使经浓缩和任选渗滤的蛋白溶液的离子强度升高，以促进稀释时蛋白胶束团的形成。
[0104]取决于在浓缩步骤和任选的渗滤步骤使用的温度和是否实施巴氏灭菌步骤,可将经浓缩的蛋白溶液温热到至少约20°C，且至高约60°C，优选约25°C至约40°C的温度，以减小经浓缩的蛋白溶液的粘度，以促进随后稀释步骤和胶束形成的执行。不应将经浓缩的蛋白溶液加热到高于在通过冷却水稀释时不发生胶束形成的温度。
[0105]然后，稀释从浓缩步骤、任选的渗滤步骤、任选的离子强度调节步骤、任选的脱脂步骤、任选的吸附剂处理步骤和任选的巴氏灭菌步骤得到的经浓缩的蛋白溶液，以通过混合经浓缩的蛋白溶液与具有达到期望的稀释度的体积的冷却水而形成胶束。取决于期望通过胶束途径得到的大豆蛋白的比例和来自上清液的比例，可改变经浓缩的蛋白溶液的稀释度。通常，在较低的稀释度时，较大比例的大豆蛋白保留在水相中。
[0106]在期望通过胶束途径提供最大比例的蛋白时，将经浓缩的蛋白溶液稀释约5倍至约25倍，优选约10倍至约20倍。
[0107]与经浓缩的蛋白溶液混合的冷却水具有小于约15°C，一般约1°至约15°C，优选小于约10°C的温度，因为在所用的稀释因子下，用这些较冷温度达到提高的蛋白胶束团形式的蛋白分离物的产率。
[0108]在批次操作中，将经浓缩的蛋白溶液批次加入到具有期望体积的冷却水的静态主体，如上所讨论。经浓缩的蛋白溶液的稀释和随后离子强度的减小引起胶束型离散蛋白滴形式的高交联蛋白分子云状团的形成。在批次过程中，使蛋白胶束在冷却水体中沉降，形成聚集的，结合的，浓稠的，无定形的粘性面筋状蛋白胶束团(PMM)。可通过例如离心帮助沉降。此诱导沉降减小蛋白胶束团的液体含量，从而使水含量从按总胶束团计一般约70重量％至约95重量％减小到一般约50重量％至约80重量％的数值。以此方式减小胶束团的水分含量也减小胶束团的吸着盐含量，并因此减小经干燥的蛋白产品的盐含量。
[0109]可选地，可通过将经浓缩的蛋白溶液连续通到T形管的一个入口，同时将稀释水进料到T形管的其它入口，允许管中混合而连续实施稀释操作。将稀释水以足以实现经浓缩的蛋白溶液的期望的稀释度的速率进料到T形管。
[0110]经浓缩的蛋白溶液和稀释水在管中的混合引起蛋白胶束的形成，并且将混合物从T形管的出口连续进料到沉降容器，在充满时，允许上清液从该沉降容器溢出。混合物优选以使液体主体内的湍流最小的方式送入沉降容器中的液体主体内。
[0111]在连续过程中，使蛋白胶束在沉降容器中沉降，以形成聚集的，结合的，浓稠的，无定形的，粘性面筋状蛋白胶束团(PMM)，且使此过程继续，直到所需量的PMM已积聚在沉降容器的底部，然后从沉降容器去除积聚的PMM。通过沉淀代替沉积，可通过离心连续分离PMM。
[0112]与批次过程相比，通过利用连续过程回收大豆蛋白胶束团，对于相同水平的蛋白萃取，初始蛋白萃取步骤的时间可显著减少，并且可在萃取步骤利用显著更高的温度。另夕卜，在连续操作中，有比批次过程更少的污染机会，引起更高的产品质量，并且可以在更紧凑的设备中实施此过程。
[0113]通过例如从沉降的团倾析残余含水相，或者通过离心，从残余水相或上清液分离沉降的胶束团。PMM可以湿的形式使用，或者可通过任何合适技术(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥成干燥形式。干燥的PMM具有超过约90重量％蛋白，优选至少约100重量％(计算为N X 6.25) d.b.的高蛋白含量，并且基本上未变性。可选地，可将湿PMM调节pH到约
2.0至约4.0，优选约2.9至约3.2的pH。pH调节可以按任何合适方式(例如通过加入盐酸或磷酸)实施。然后使所得酸化大豆蛋白溶液干燥。作为另一种替代，可使经PH调节的大豆蛋白溶液经受加热处理，以使热不稳定抗营养因子(如以上提到的胰蛋白酶抑制剂)失活。此加热步骤也提供降低微生物量的另外益处。一般将蛋白溶液加热到约70°至约100°C温度，优选约85°至约95°C的温度约10秒钟至约60分钟，优选约30秒钟至约5分钟。然后，可使经加热处理的酸化大豆蛋白溶液冷却到约2°C至约60°C，优选约20°至约35°C的温度。然后将所得酸化的、经加热处理的大豆蛋白溶液干燥。
[0114]根据美国申请第12/693，714号中要求的本发明，将钙盐或其它二价盐(优选氯化钙)加入到上清液(上清液可首先以下述方式浓缩或部分浓缩)，以提供约2 mS至约30mS，优选8 mS至约15 mS的电导率。加入到上清液的氯化钙可以为任何期望的形式，例如其经浓缩的水溶液。
[0115]加入氯化钙具有从上清液以肌醇六磷酸钙的形式沉积肌醇六磷酸的作用。沉积的肌醇六磷酸盐例如通过离心和/或过滤从上清液回收，以留下澄清溶液。
[0116]然后，可将澄清溶液的pH调节到约1.5至约4.4，优选约2.0至约4.0的值。pH调节可按任何合适的方式实施，例如加入盐酸或磷酸。如果期望，一旦已去除沉淀的肌醇六磷酸盐材料，可从本文所述不同选项(除以下提到的加热处理之外)中省略酸化步骤。
[0117]可使经pH调节的澄清酸化大豆蛋白水溶液经受加热处理，以使热不稳定抗营养因子(如以上提到的胰蛋白酶抑制剂)失活。此加热步骤也提供降低微生物量的另外益处。一般将蛋白溶液加热到约70°至约160°C温度约10秒钟至约60分钟，优选约80°至约1200C的温度约10秒钟至约5分钟，更优选约85°至约95 1:约30秒钟至约5分钟。然后，为了如下所述进一步处理，可使经加热处理的酸化大豆蛋白溶液冷却到约2°C至约60°C，优选约20°C至约35°C的温度。
[0118]如果尚未浓缩，将任选经pH调节且任选加热处理的澄清溶液浓缩，以增加其蛋白浓度。此浓缩用任何合适的选择性膜技术实施，如使用膜的超滤或渗滤，所述膜具有适合的截留分子量，允许低分子量物种(包括盐、碳水化合物、颜料、胰蛋白酶抑制剂和从蛋白源材料萃取的其它低分子量材料)通过该膜，同时在溶液中保留显著比例的大豆蛋白。按照不同膜材料和结构可使用具有约3，000至1，000, 000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿的截留分子量的超滤膜。以此方式浓缩蛋白溶液也降低所需液体的体积，所述液体要被干燥以回收蛋白。在干燥前，蛋白溶液一般浓缩到约50 g/L至约400 g/L，优选约100至约250 g/L的蛋白浓度。此浓缩操作可如上所述按批次方式或按连续操作实施。
[0119]当上清液在加入钙盐前经部分浓缩和去除沉淀物后完全浓缩时，首先将上清液浓缩到约50 g/L或更小的蛋白浓度，然后，在去除沉淀物后，浓缩到约50至约400 g/L，优选约100至约250 g/L的蛋白浓度。
[0120]在部分或完全浓缩之前或之后，可使蛋白溶液经受渗滤步骤，优选使用水或稀释的盐溶液。渗滤溶液可是其天然PH，等于正被渗滤的蛋白溶液的pH或之间的任何pH。可用约I至约40体积的渗滤溶液，优选约2至约25体积的渗滤溶液实施此渗滤。在渗滤操作中，通过用渗透物通过膜，从水溶液去除进一步的量的污染物。可实施渗滤操作直到在渗透物中不存在显著的进一步的量的污染物或可见颜色，或直到蛋白溶液已充分纯化。可用与浓缩步骤相同的膜实施此渗滤。然而，如果期望，按照不同膜材料和结构可使用分离膜实施渗滤，膜例如具有约3，000至约1，000, 000道尔顿，优选约5，000至约100，000道尔顿范围内的截留分子量的膜。
[0121]浓缩步骤和渗滤步骤可以在本文中按这样的方式实施:随后通过干燥经浓缩和渗滤的保留物所回收的大豆蛋白产品含有小于约90重量％蛋白(N x6.25) d.b.，例如至少约60重量％蛋白(N x6.25) d.b.。通过部分浓缩和/或部分渗滤大豆蛋白水溶液，可仅部分去除污染物。然后，可干燥此蛋白溶液，以提供具有较低纯度水平的大豆蛋白产品。此大豆蛋白产品仍能够在酸性条件下生产澄清蛋白溶液。
[0122]在渗滤步骤的至少一部分期间，在渗滤介质中可存在抗氧化剂。抗氧化剂可以为任何合适的抗氧化剂，如亚硫酸钠或抗坏血酸。在渗滤介质中使用的抗氧化剂的量取决于所用的材料，且可以从约0.01重量％至约I重量％变化，优选约0.05重量％。抗氧化剂用于抑制经浓缩的大豆蛋白分离溶液中存在的任何酚类的氧化。
[0123]浓缩步骤和渗滤步骤可在任何合适的温度(一般约2°至约60°C，优选约20°至约35°C)实施一段时间，以实现期望的浓缩和渗滤度。在某种程度上，使用的温度和其它条件取决于实施膜处理使用的膜设备、期望的溶液蛋白浓度和对于渗透物去除污染物的效率。
[0124]如上所述，最终大豆蛋白产品中胰蛋白酶抑制剂活性的水平可通过操纵各种工艺变量来控制。
[0125]如前提到，可使用酸化的大豆蛋白水溶液的加热处理使热不稳定胰蛋白酶抑制剂失活。也可加热处理经部分浓缩或完全浓缩的酸化的大豆蛋白溶液，以使热不稳定的胰蛋白酶抑制剂失活。
[0126]另外，可按有利于与其它污染物一起去除渗透物中的胰蛋白酶抑制剂的方式操作浓缩和/或渗滤步骤。通过使用较大孔径(例如约30，000至1，000, 000道尔顿)的膜、在升高的温度(例如约30°至约65°C )操作膜和利用较大体积(如约10至约40体积)的渗滤介质，可促进胰蛋白酶抑制剂的去除。
[0127]与在较高pH(例如约3至约4.4)处理溶液相比，在较低pH(例如约1.5至约3)酸化和膜处理稀释的蛋白溶液可降低胰蛋白酶抑制剂活性。当在pH范围的低端浓缩和渗滤蛋白溶液时，可期望在干燥前提高保留物的pH。通过加入任何合适的食品级碱，如氢氧化钠，可使经浓缩和渗滤的蛋白溶液的PH提高到期望的值，例如pH3。
[0128]此外，通过使大豆材料暴露于使抑制剂的二硫化物键破坏或重排的还原剂，可实现胰蛋白酶抑制剂活性的还原。适合的还原剂包括亚硫酸钠、半胱氨酸和N-乙酰基半胱氨酸。
[0129]可在全部过程的不同阶段实施此还原剂的加入。还原剂可在萃取步骤中与大豆蛋白源材料一起加入、可在残余大豆蛋白源材料去除后加入到澄清的大豆蛋白水溶液、可在稀释之前加入到经渗滤的保留物、可加入到上清液、可在干燥之前加入到经浓缩和渗滤的钙改性的上清液或者可与经干燥的大豆蛋白产品干混。还原剂的加入可与上述加热处理步骤和膜处理步骤组合。
[0130]如果期望在经浓缩的蛋白溶液中保留活性胰蛋白酶抑制剂，则这可通过消除或降低加热处理步骤的强度、不利用还原剂、在PH范围的高端(例如约3至约4.4)操作浓缩和渗滤步骤、利用具有较小孔径的浓缩和渗滤膜、在较低温度操作膜和利用较小体积的渗滤介质而实现。
[0131]经浓缩和渗滤的澄清蛋白水溶液可用吸附剂(如粉末状活性炭或粒状活性炭)处理，以去除颜色和/或气味化合物。此吸附剂处理可在任何合适条件下实施，一般在浓缩的蛋白溶液的环境温度下。对于粉末状活性炭，利用约0.025%至约5% w/v,优选约0.05%至约2% w/v的量。可通过任何合适方法(例如通过过滤)从大豆蛋白溶液去除吸附剂。
[0132]如果尚未利用pH调节步骤，可将经浓缩和任选渗滤和任选吸附剂处理的蛋白溶液的pH调节到约2.0至约4.0。也可如上所述加热处理经pH调节、浓缩和任选渗滤和任选吸附剂处理的蛋白溶液，以降低胰蛋白酶抑制剂活性的水平。
[0133]经浓缩和任选渗滤和任选吸附剂处理的蛋白溶液通过任何合适技术(例如喷雾干燥或冷冻干燥)干燥成干燥形式。经干燥的大豆蛋白产品具有至少约60重量％(N X
6.25) d.b.，优选超过约90重量％ (N X 6.25) d.b.，更优选至少约100重量％的蛋白含量。该大豆蛋白产品的肌醇六磷酸含量低，一般小于约1.5重量％。
[0134]可使用多种程序以提供大豆蛋白产品，优选根据本发明来自依照美国申请第12/704，078、12/703，996和12/693，714号生产的产品的分离物。在一个此类程序中，如上所述以及在前述美国专利申请第12/704,078号中获得的经浓缩的大豆蛋白溶液可经加热处理以沉降蛋白。可将全部经加热处理的样品干燥以形成大豆蛋白产品或可任选将不溶性固体回收并干燥以形成大豆蛋白产品。可选地，可将经干燥的经浓缩的蛋白溶液重新混悬于水中，如果产品在干燥前已被酸化，则将PH调节到至约6，且然后加热处理，然后将全部样品干燥或随后收集并干燥不溶性固体。作为另一种替代，可将由萃取和分离步骤产生的最初大豆蛋白溶液加热处理以沉降蛋白，随后干燥全部样品或回收并干燥沉淀的蛋白。
[0135]在另一替代程序中，可将根据美国专利申请第12/703,996号获得的经干燥的蛋白沉淀重新混悬于水中，如果产品在干燥前已被酸化，则将PH调节到约6，并施加加热处理。可将全部样品干燥以形成大豆蛋白产品或可任选将不溶性固体回收并干燥以形成大豆蛋白产品。可选地，在干燥步骤之前可将湿蛋白沉淀重新混悬于水中并加热处理，干燥全部样品或随后回收并干燥不溶性固体。
[0136]在另外的替代程序中，可使如前述美国专利申请第12/693，714号中所述获得的经干燥的酸大豆蛋白产品形成水溶液，将所述水溶液的PH增至约pH 6以沉淀大豆蛋白并且干燥样品。可选地，可将通过PH调节沉淀的蛋白回收并干燥。也可在干燥全部样品或回收并干燥沉淀的蛋白之前加热pH 6溶液。作为另一种替代，在干燥之前可将经浓缩的酸性蛋白溶液的PH增至约6以沉淀大豆蛋白，可回收并干燥所述大豆蛋白以形成大豆蛋白产品或否则可将全部样品干