一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法 : [0002]当多糖以共价键连接至蛋白载体上时，能将半抗原的多糖转变成全抗原，使得多糖的免疫原性得到增强。以此方法合成的多糖-蛋白结合疫苗已被广泛地应用于小儿，成功地预防了包括肺炎球菌，流行性脑膜炎球菌以及流行性嗜血杆菌b型等细菌的感染。 [0003]用于合成多糖蛋白结合物的蛋白载体有多种，如破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉毒素变异体CRM197，以及基因重组技术生产的流行性嗜血杆菌表面蛋白D等；但是，由于不同蛋白的免疫特性，以不同蛋白载体合成的多糖蛋白结合物的免疫原性有差异，动物体免疫后，对于由不同蛋白载体与同一种多糖合成形成的多糖蛋白结合物，所显现的多糖免疫原性也不同。由此可见，采用不同技术生产的蛋白载体，合成出来的多糖蛋白结合疫苗的免疫原性有差异。 [0004]进入动物机体内后，抗原经抗原处理细胞(Antigen Process Cell, APC)处理后产生表位肽(epitope) [I],在和主要组织相容性复合物(Major HistocompatibilityComplex,MHC)分子结合后，进而呈现在APC细胞表面，能够被T淋巴细胞识别，这是免疫学通过实验已经得出的结论。现在知道，一个已知表位肽的免疫原性取决于三个因素: [0005]第一、适当表位肽的产生； [0006]第二、和表位肽结合的主要组织相容性复合物分子的呈现；
[0007]第三、识别表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物的T细胞的呈现。
[0008]其中，任何一个环节的缺少都将导致免疫应答缺失。
[0009]用小鼠进行的试验表明，缺乏适当的表位肽与主要组织相容性复合物形成的结合物分子是最常导致动物体免疫响应缺失的原因。主要组织相容性复合物具有高度的多形态性，已知的表位肽仅通过一个或者几个等位基因(Alleles)就可结合至主要组织相容性复合物，而不是全部表位肽片段。另外，有实验结果显示，由于抗原处理不适当，或者T细胞耐受性空缺,也会导致免疫响应的缺失。
[0010]有实验表明，破伤风毒素的三个表位肽中的两个，即QYIKANSKFIGITEL表位肽(称为 P2)和 FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE 表位肽(称为 P30)，以及 ISQAVHAAHAEINEAGR表位肽(称为OVAp) [2]，可和大量不同的主要组织相容性复合物Class II结合，显示其能够被T细胞识别，具有万能免疫原性的特性，被称之万能表位肽。
[0011]万能免疫原性表位肽具有和多个人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子的同型和异型体结合。这种万能表位肽和人类主要组织相容性抗原复合物Class II分子随机的结合可用于开发合成疫苗，因为其能够激活人群中的大部分个体的获得性免疫系统的应答。
[0012] 研究表明，P2表位肽由破伤风毒素的830 - 844氨基酸序列组成(QYIKANSKFIGITEL)，P30表位肽由破伤风毒素的947 - 967氨基酸序列组成(FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE)，OVAp表位肽是由卵清蛋白的323 - 339氨基酸序列组成(ISQAVHAAHAEINEAGR)。在含有这些表位肽的蛋白进入机体后，蛋白将被摄入至APC细胞内，被消化降解，但是这些表位肽将保存完整，在和主要组织相容性复合物结合后，被呈现在APC细胞表面，并被T细胞识别，这表明万能表位肽以相同的方式和多种DR分子作用。
[0013]MHC分子是加工后抗原的杂性受体，其功能是在胸腺中的免疫耐受诱导和周边免疫响应外来抗原的过程中，来呈现其抗原中的表位肽。因此，MHC分子必须在呈现大量的表位肽(容许更好的抗原识别，但更多的消耗T细胞储备)，和少许表位肽(大量的T细胞储备，但是少许有效地呈现外来抗原)中达到平衡。也就是说，如果抗原中含有在APC细胞处理后能够保存完整性、并具有代表性的少量表位肽，在和MHC结合后，就能够刺激一定量的T细胞，来建立免疫记忆效应，而这一过程不会消耗过量的T细胞造成免疫耐受，含有这种表位肽的抗原具有更强的免疫原性，这也就解释了为什么破伤风类毒素具有很强的免疫原性的原因。
[0014]现发现的大部分T细胞的刺激表位肽对于不同MHC Class II单体(haplotype)作用有限，不同动物保存和呈现不同的抗原多肽区域Gpitopes)来刺激其T细胞。这种T细胞刺激活性的基因限制严重地阻碍了以合成方法来开发疫苗，而这种方法对于基因上不同的人群的应用，应该是非常有效的方法。那些被发现具有刺激多重小鼠个体和/或与大多数人体MHC Class II分子相关联的T细胞刺激表位肽，提供了一个设计万能活化T细胞的有效途径。在普通的蛋白抗原中加入万能表位肽(也称为万能T细胞抗原簇)，如P2、P30或OVAp等，能够被大多数动物的MHC Class II分子识别。这种T细胞抗原簇能够用于直接诱导T细胞，或提供帮助B细胞生产针对于弱免疫原的抗体，增强获得性免疫应答的效应。
[0015]致病性细菌通常能够表达高分子量、包裹在细菌表面的荚膜多糖，简称多糖。对于成人来说，荚膜多糖是具有很好的免疫原性抗原，可用于制备疫苗；但是，对于小儿，即2岁以下的婴幼儿，荚膜多糖被认为是非依赖于T细胞抗原。实验显示，当用作抗原时，荚膜多糖可诱导野株或者T细胞缺失小鼠生产多糖特异性IgM抗体的响应；但是，并不诱导IgM抗体向IgG抗体的转化。人体实验也显示，作为疫苗，多糖可以诱导成人生产保护性抗体，但无法诱导婴幼儿的免疫应答；也就是说，在小儿重复免疫荚膜多糖抗原后，无第二次抗体增强响应，也无法诱导持续的T细胞记忆。
[0016]现代免疫学实验证实，多糖蛋白结合疫苗和纯多糖疫苗比较的优势在于，前者能够诱导免疫响应。当非依赖T细胞的荚膜多糖共价键地连接至载体蛋白而产生的多糖蛋白结合物，在免疫了哺乳动物后，可诱导T细胞来帮助B细胞产生针对于结合物中的多糖部分的IgG抗体。因此，多糖蛋白结合物诱导多糖特异性抗体IgM转化为IgG，记忆B细胞的分化，以及长期存在的T细胞记忆。
[0017]多糖结合疫苗在预防严重的传染病中，比如，流行性嗜血杆菌b型，肺炎球菌，以及流行性脑膜炎球菌，发挥了巨大的作用。不过，这些多糖蛋白结合疫苗的免疫原性变异性较大，这种变异性除了是由于特定多糖结构的差异性的结果外，不同免疫原性蛋白载体的使用，也是导致多糖蛋白结合物的免疫原差异主要原因。在某些高危人群中，比如小儿、老年人或免疫功能低下人，低免疫原性的多糖蛋白质结合疫苗的免疫效果不佳，保护性受到限制。因此，开发出免疫原性更强的多糖蛋白结合疫苗，仍然是该领域努力的方向。
[0018] 本发明用基因重组技术生产的含有万能表位肽蛋白载体，在多糖蛋白质结合物中引入万能表位肽。在这种结合物进入动物体后，经过抗原呈递细胞(APC)吞噬消化降解后，其万能表位肽和部分多糖重复单位，和主要组织相容性复合物Class II结合，可有效地刺激T细胞，进而增强结合物中多糖的免疫原性，导致针对细菌荚膜多糖的抗体浓度增加。



[0019]本发明的目的是提供一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，通过在蛋白载体中加入万能表位肽，采用基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；然后将多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物；这种多糖蛋白结合物与不含有万能表位肽的对应蛋白载体形成的多糖蛋白结合物相比较，其免疫原性比对照提高了 3 - 5倍。
[0020]本发明采取的技术方案如下:
[0021]一种增强多糖蛋白结合物免疫原性的方法，其特征在于:
[0022]a)在蛋白载体中加入万能表位肽，通过基因重组工程菌来生产含有万能表位肽的蛋白载体；
[0023]b)多糖通过共价键连接至所述含有万能表位肽的蛋白载体上形成多糖蛋白结合物；
[0024]进一步，在所述含有万能表位肽的蛋白载体中含有X个万能表位肽，X大于等于I。
[0025]进一步，在含有万能表位肽的蛋白载体中，万能表位肽是连接在蛋白的N -末端或C -末端，或者同时连接在N -末端和C -末端。
[0026]进一步，所述万能表位肽与指定蛋白的N -末端或C -末端之间通过GSGSG氨基酸序列进行连接。
[0027]进一步，所述万能表位肽为QYIKANSKFIGITEL(简称P2)或FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE (简称 P30)，或 ISQAVHAAHAEINEAGR(简称 OVAp)，或者是这三种万能表位肽的组合。
[0028]进一步，所述蛋白载体为白喉毒素变异体CRM197的A链(简称CRM197A)，或轮状病毒表面蛋白核VP8 (简称CoreVP8)，或白喉毒素变异体H21G的A链(简称H21G)。
[0029]进一步，所述基因重组工程菌是通过基因重组方法构建的大肠杆菌。
[0030]进一步，所述多糖是通过培养肺炎球菌、流行性嗜血杆菌b型或流行性脑膜炎球菌而获得的荚膜多糖。
[0031]进一步，所述多糖通过共价键连接至含有万能表位肽的蛋白载体的连接方法是还原胺法、己二酰二肼法(ADH法)或1- (3 - 二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐法(CDAP 法)。


[0032]下面举例说明本发明的具体实施方法，但不仅局限于以下实例。
[0033]实施例1:含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体结合物的合成及免疫原性的评估
[0034]一、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0035]1、CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0036]白喉毒素是由带有白喉毒素基因的β噬菌体在白喉杆菌内表达，在细菌胞浆中存在形式为多肽，由560个氨基酸组成，分子量为62，000道尔顿。其氨基酸序列如下:
[0037]MSRKLFASILIGALLGIGAPPSAHAGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAffAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0038]当分泌至细菌体外前，多肽N -末端的25个引导氨基酸序列被切除掉，变成了由535个氨基酸组成，分子量为58kD的单链多肽而分泌至细菌体外，其氨基酸序列如下:
[0039]GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDffDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDIKITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSKTHISVNGRKIRMRCRAID⑶VTFCRPKSPVYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEISSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEIKS
[0040]分泌至细菌体外的白喉毒素被酶切为A链和B链，其间由一个二硫键连接而形成一个蛋白分子。这两个多肽链具有不同的功能，A链为白喉毒素蛋白分子的N-末端片段，分子量为21kD，由193个氨基酸组成。是白喉毒素的毒性功能部分，它在真核生物细胞浆内通过将二磷酸三腺苷核糖(ADP-Ribosyl)的异柠檬酸脱氢酶(NAD+)部分转移至延伸因子
2(Elongat1n Factor - 2, EF - 2)上，从而抑制细胞中的蛋白质合成,进而抑制细胞生长，造成细胞伤亡。B链为白喉毒素蛋白分子的C -末端片段，分子量大约为37kD，由342个氨基酸组成。B链的功能是识别敏感细胞表面的特异性受体，将白喉毒素吸附在敏感细胞上，帮助A链进入细胞内。
[0041]白喉毒素的A链具有良好的水溶性，其氨基酸序列如下:
[0042]GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0043]研究发现[3]，由于β噬菌体上的毒素基因tox的突变，对于噬菌体的复制没有影响；但是，合成出来的毒素的毒性可能消失，或大大地降低，而形成白喉毒素突变体(CrossReacting Material, CRM)，而白喉毒素突变体的血清学免疫原性仍然和毒素相关联。白喉毒素突变体CRM197无白喉毒素的毒性，从氨基酸序列分析来看是由于A链中的第52位氨基酸，由甘氨酸(Gly)突变成谷氨酸(Glu)，其氨基酸序列如下:
[0044] GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDffKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0045]试验研究表明，与其它现在市场上用于肺炎球菌结合疫苗合成的蛋白载体比较，白喉毒素变异体CRM197蛋白A链多肽具备以下优势:其免疫原性和白喉毒素及白喉内毒素相关联，分子量小，水溶性高，易于生产和进行大分子合成反应。长期的白喉类毒素疫苗的临床使用，已经证明其安全性和有效性。
[0046]将基因重组表达的CRM197A蛋白作为多糖蛋白结合物合成用的蛋白载体，将其以共价键形式连接至肺炎球菌荚膜多糖、或流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖、或流行性脑膜炎球菌荚膜多糖上，制备出肺炎球菌多糖CRM197A蛋白结合物、流行性嗜血杆菌多糖CRM197A蛋白结合物以及流行性脑膜炎荚膜多糖CRM197A蛋白结合物，并制备成疫苗制剂，用作对照样品，与带有万能表位肽的CRM197A蛋白载体合成的相应多糖蛋白结合物进行免疫原性比较。
[0047]2、带有万能表位肽的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0048]将万能表位肽连接至CRM197A蛋白载体上,构建出一种新的用于合成多糖蛋白质结合物的蛋白载体。所用的万能表位肽P2、或P30、或OVAp可分别连接至CRM197A蛋白载体的N -末端或C -末端；也可将两个不同的万能表位肽分别连接至CRM197A蛋白载体的N -末端或C -末端；另一种方式是将两个万能表位肽自身连接，然后再连接至CRM197A蛋白载体N -末端或者C -末端；还有一种方式是将一个万能表位肽连接至C -末端或者N -末端，两个自身连接的万能表位肽连接至另一端。
[0049]2 - 1、含有万能表位肽P2的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0050]2 -1 - 1、P2 - N -末端CRM197A蛋白载体(称为P2CRM197A)氨基酸序列的设计
[0051]通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的N -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0052]QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0053]在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197A蛋白载体。
[0054]2-1-2、CRM197A C -末端-P2蛋白载体(称为CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0055]通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0056]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0057]在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP2蛋白载体。
[0058]2 -1 - 3、P2 - N -末端 CRM197A C -末端-P2 蛋白载体(称为 P2CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0059]通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0060]QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKR
FCTIGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNVEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKA
NSKFIGITEL
[0061]在P2氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端之间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP2蛋白载体。
[0062]2 -1 - 4、P2P2 - N -末端CRM197A蛋白载体(称为P2P2CRM197A)氨基酸序列的设计
[0063]通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0064]QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0065]在两个自身连接的P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197A蛋白载体。
[0066]2-1-5、CRM197A C -末端-P2P2蛋白载体(称为CRM197AP2P2)氨基酸序列的设计
[0067]通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0068]GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0069]在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP2P2蛋白载体。
[0070]2 -1 - 6、P2P2 - N -末端 CRM197A C -末端-P2 蛋白载体(称为 P2P2CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0071]通过将两个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端；另外，将一个P2加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0072] QYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0073]在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白的C-末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P2CRM197AP2蛋白载体。
[0074]2 -1 - 7、P2 - N -末端 CRM197A C -末端-P2P2 蛋白载体(称为 P2CRM197AP2P2)氨基酸序列的设计
[0075]通过将一个P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL连接至CRM197A蛋白载体的N -末端；另外，将两个P2进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0076]QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITELGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0077]在两个自身连接P2氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP2P2蛋白载体。
[0078]2 - 2、含有万能表位肽P30的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0079]2 - 2 - 1、P30 - N -末端CRM197A蛋白载体(称为P30CRM197A)氨基酸序列的设计
[0080]通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白载体N -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0081 ] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0082]在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197A蛋白载体。
[0083]2-2-2、CRM197A C -末端-P30蛋白载体(称为CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0084]通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE加入至CRM197A蛋白的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0085]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0086]在P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP30蛋白载体。
[0087]2 - 2 - 3、P30 - N -末端 CRM197A C -末端-P30 蛋白载体(称为 P30CRM197AP30)
氨基酸序列的设计
[0088]通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分别连接至CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0089]FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTYSFffLRYPKVSASHLE
[0090]在两个P30氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP30蛋白载体。
[0091]2-2-4、P30P30-N-末端CRM197A 蛋白载体(称为 P30P30CRM197A)氨基酸序列的设计
[0092]通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0093]FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0094]在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N-末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30P30CRM197A蛋白载体。
[0095]2-2-5、CRM197A C -末端-P30P30 蛋白载体(称为 CRM197AP30P30)氨基酸序列的设计
[0096]通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0097]GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTYSFffLRYPKVSASHLE
[0098]在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197AP30P30蛋白载体。
[0099]2-2-6、P30P30 - N -末端 CRM197A C-末端-P30 蛋白载体(称为P30P30CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0100]通过将两个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端；另外，将一个P30加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氣基酸序列如下:
[0101 ] FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0102]在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30P30CRM197AP30蛋白载体。
[0103]2 - 2 - 7、P30 - N -末端 CRM197A C -末端-P30P30 蛋白载体(称为 P30CRM197AP30P30)氨基酸序列的设计
[0104]通过将一个P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接至CRM197A蛋白载体的N -末端；另外，将两个P30进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0105]FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0106] 在两个自身连接P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP30P30蛋白载体。
[0107]2 - 3、含有万能表位肽OVAp的CRM197A蛋白载体氨基酸序列的设计
[0108]2 -3 - UOVAp - N -末端CRM197A蛋白载体(称为0VApCRM197A)氨基酸序列的设计
[0109]通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体N -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0110]ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0111]在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为0VApCRM197A蛋白载体。
[0112]2-3-2、CRM197A C -末端-OVAp蛋白载体(称为CRM197A0VAp)氨基酸序列的设计
[0113]通过将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0114]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0115]在OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A0VAp蛋白载体。
[0116]2 -3 -3,OVAp -N -末端 CRM197A C -末端-OVAp 蛋白载体(称为 0VApCRM197A0VAp)氨基酸序列的设计
[0117]通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR分别连接至CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0118]ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0119]在两个OVAp氨基酸序列和CRM197A蛋白载体的C -末端之间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为0VApCRM197A0VAp蛋白载体。
[0120]2-3-4、OVApOVAp - N -末端 CRM197A 蛋白载体(称为 0VAp0VApCRM197A)氨基酸序列的设计
[0121]通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0122]ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRR
[0123]在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为0VAp0VApCRM197A蛋白载体。
[0124]2-3-5、CRM197A C -末端-OVApOVAp 蛋白载体(称为 CRM197A0VAp0VAp)氨基酸序列的设计
[0125]通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0126]GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0127]在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为CRM197A0VAp0VAp蛋白载体。
[0128]2-3-6、OVApOVAp - N -末端 CRM197A C-末端-OVAp 蛋白载体(称为0VAp0VApCRM197A0VAp)氨基酸序列的设计
[0129]通过将两个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的N -末端；另外，将一个OVAp加入至CRM197A蛋白载体的C -末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0130]ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0131]在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的C -末端间插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为0VAp0VApCRM197A0VAp蛋白载体。
[0132]2-3-7、OVAp - N -末端 CRM197A C-末端-OVApOVAp 蛋白载体(称为0VApCRM197A0VAp0VAp)氨基酸序列的设计
[0133]通过将一个OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR连接至CRM197A蛋白的N -末端；另外，将两个OVAp进行自身连接，然后再加入至CRM197A蛋白载体的C-末端，形成另一种新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0134]ISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0135]在两个自身连接OVAp氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白的C -末端间插入了GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为0VApCRM197A0VAp0VAp蛋白载体。
[0136]2 - 4、含有两个以上不同万能表位妝的CRM197A蛋白载体氣基酸序列的设计
[0137]将三种万能表位肽P2，P30和OVAp分别连接至CRM197A蛋白载体中，设计出一种新的蛋白载体。
[0138] 2 - 4 - 1、P2 - N -末端 CRM197A C -末端-P30 蛋白载体(称为 P2CRM197AP30)氨基酸序列的设计
[0139]通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列
[0140]FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE分别加入至CRM197A蛋白N -末端和C -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0141]QYIKANSKFIGITELGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNffEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLE
[0142]在P2和P30氨基酸序列和CRM197A蛋白的N -末端和C -末端间分别插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2CRM197AP30蛋白载体。
[0143]2 - 4 - 2、P30 - N -末端 CRM197A C -末端-P2 蛋白载体(称为 P30CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0144]通过将P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE和P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL分别加入至CRM197A蛋白载体N -末端和C -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0145]FNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0146]在P30和P2氨基酸序列和CRM197A蛋白的N -末端和C -末端间分别插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P30CRM197AP2蛋白载体。
[0147]2-4-3、P2P30-N -末端 CRM197A C -末端-P2 蛋白载体(称为 P2P30CRM197AP2)氨基酸序列的设计
[0148]通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接，然后加入至CRM197A蛋白载体的N -末端；将P2加入至CRM197A蛋白载体C -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0149]QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGQYIKANSKFIGITEL
[0150]在P2和P30氨基酸序列之间，以及和CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端间分别插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P30CRM197AP2蛋白载体。
[0151]2-4-4、P2P30 - N -末端 CRM197A C-末端-OVAp 蛋白载体(称为P2P30CRM197A0VAp)氨基酸序列的设计
[0152]通过将P2氨基酸序列QYIKANSKFIGITEL和P30氨基酸序列FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE连接，然后加入至CRM197A蛋白的N -末端；将OVAp氨基酸序列ISQAVHAAHAEINEAGR加入至CRM197A蛋白C -末端，形成一个新的蛋白，其氨基酸序列如下:
[0153]QYIKANSKFIGITELGSGSGFNNFTVSFffLRVPKVSASHLEGSGSGGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGSGSGISQAVHAAHAEINEAGR
[0154]在P2和P30氨基酸序列之间，CRM197A蛋白载体的N -末端和C -末端间，以及OVAp和CRM197A蛋白载体的N -末端之间分别插入了 GSGSG片段来进行连接，以此方法构建的蛋白称为P2P30CRM197A0VAp蛋白载体。
[0155]二、CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0156]1、CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0157]从GenBank获取CRM197蛋白完整氨基酸序列PRF: 224021，确定CRM197蛋白的A链片段，CRM197的氨基酸1- 193为CRM197的A链片段。以此为依据，对该片段的氨基酸的核酸序列进行优化，以便在大肠杆菌表达系统中高效表达。采用自制的表达质粒，用NdeI酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。对CRM197A的基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。CRM197A蛋白基因合成序列如下:
[0158]CATATG
[0159]GGTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0160]CATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0161]GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0162]GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0163]GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0164]ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0165]GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0166] GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0167]GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0168]TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0169]GGATCC
[0170]将空白质粒和合成的CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0171]2、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0172]2 - UP2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0173]采用自制的空白表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG，Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2CRM197A蛋白载体基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2CRM197A基因合成全序列如下:
[0174]CATATG
[0175]CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC
[0176]GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0177]ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0178]GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0179]GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0180]GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0181]ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0182]GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0183]GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0184]GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0185]TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AA
[0186]GGATCC
[0187]将空白质粒和合成的P2CRM197A蛋白基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0188]2 - 2.P2CRM197AP2蛋白载体表达质粒的构建
[0189]采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG, Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P2CRM197AP2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P2CRM197AP2基因合成全序列如下:
[0190]CATATG
[0191]CAATACATCA AGGCGAACAG CAAATTCATC GGCATCACGG AACTGGGCTC GGGCTCTGGC
[0192]GTGCGGACG ACGTTGTGGA CTCCTCAAAA TCGTTTGTCA TGGAAAACTT CAGCTCTTAT
[0193]ATGGCACCA AACCGGGTTA CGTGGACTCC ATTCAGAAGG GCATCCAAAA ACCGAAGTCA
[0194]GGCACCCAGG GTAACTACGA TGACGATTGG AAGGAATTCT ACAGCACGGA CAATAAGTAT
[0195]GATGCGGCCG GCTACTCTGT TGACAACGAA AATCCGCTGA GTGGTAAAGC AGGCGGTGTG
[0196]GTTAAGGTCA CCTATCCGGG TCTGACGAAA GTTCTGGCGC TGAAGGTCGA TAACGCCGAA
[0197]ACCATTAAAA AGGAACTGGG CCTGTCTCTG ACCGAACCGC TGATGGAACA AGTGGGTACG
[0198]GAAGAATTTA TCAAACGTTT CGGCGATGGT GCATCGCGTG TCGTGCTGAG CCTGCCGTTT
[0199]GCTGAAGGCA GTTCCTCAGT GGAATACATT AACAATTGGG AACAAGCAAA AGCTCTGTCA
[0200]GTTGAACTGG AAATCAATTT CGAAACGCGT GGCAAACGCG GTCAAGATGC TATGTATGAA
[0201]TATATGGCTC AGGCGTGTGC GGGCAATCGC GTCCGTCGCT AAGGCTCGGG CTCTGGCCAA
[0202]TACATCAAGG CGAACAGCAA ATTCATCGGC ATCACGGAAC TG
[0203]GGATCC
[0204]将空白质粒和合成的P2CRM197AP2基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0205]2 - 3、 CRM197AP2、 P2P2CRM197A、 CRM197AP2P2、 P2P2CRM197AP2、以及P2CRM197AP2P2蛋白载体表达质粒的构建
[0206]方法和上节“2 - UP2CRM197A蛋白载体表达质粒的构建”相同。
[0207]2 - 4.P30CRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0208]采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG, Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CRM197A蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CRM197A基因合成全序列如下:
[0209]CATATG
[0210]TTCAATAATT TTACGGTGTC GTTTTGGCTG CGTGTCCCGA AAGTCTCTGC GAGTCATCTG
[0211]GAAGGTTCTG GTAGCGGTGG TGCGGATGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC TTTCGTTATG
[0212]GAAAACTTCA GTTCCTATCA TGGCACCAAA CCGGGTTACG TCGATTCGAT TCAGAAAGGC
[0213]ATCCAAAAAC CGAAAAGCGG CACCCAGGGT AACTACGATG ACGATTGGAA AGAATTCTAC
[0214]TCAACGGACA ACAAATACGA TGCGGCCGGC TACTCCGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC
[0215]GGTAAAGCGG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGTC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG
[0216]AAAGTTGATA ATGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGCC TGTCCCTGAC CGAACCGCTG
[0217]ATGGAACAAG TGGGTACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GCGACGGTGC CTCTCGCGTT
[0218]GTCCTGAGTC TGCCGTTTGC AGAAGGCTCA TCGAGCGTCG AATACATTAA CAATTGGGAA
[0219]CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAACTTCG AAACGCGTGG CAAACGCGGT
[0220]CAGGATGCGA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAATCGTGT TCGTCGC
[0221]GGATCC
[0222]将空白质粒和合成的P30CRM197A基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和Bam HI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0223] 2 - 5、CRM197AP30、P30CRM197AP30、P30P30CRM197A、CRM197AP30P30、P30P30CRM197AP30、以及P30CRM197AP30P30蛋白表达质粒的构建
[0224]方法和上节“2 - 4.P30CRM197A蛋白表达质粒的构建”相同。
[0225]2-6、0VApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建
[0226]采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG, Bam HI酶识别位点GGATCC。经过0VApCRM197A蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。0VApCRM197A基因合成全序列如下:
[0227]CATATG
[0228]ATCAGCCAAG CGGTTCACGC AGCCCACGCC GAAATTAACG AAGCGGGTCG CGGTAGCGGT
[0229]TCTGGCGGTG CAGACGATGT TGTTGACTCC AGCAAATCAT TCGTCATGGA AAACTTTAGC
[0230]TCTTATCATG GCACCAAACC GGGTTACGTG GACTCCATTC AGAAAGGCAT CCAAAAACCG
[0231]AAATCAGGCA CCCAGGGTAA CTATGATGAC GATTGGAAAG AATTCTACTC TACGGACAAC
[0232]AAATACGATG CGGCCGGCTA CTCTGTTGAC AACGAAAATC CGCTGAGTGG TAAAGCAGGC
[0233]GGTGTGGTTA AAGTCACCTA TCCGGGTCTG ACGAAAGTTC TGGCGCTGAA AGTCGATAAC
[0234]GCCGAAACCA TCAAAAAAGA ACTGGGCCTG TCGCTGACCG AACCGCTGAT GGAACAAGTG
[0235]GGTACGGAAG AATTTATCAA ACGTTTCGGC GATGGTGCAT CGCGTGTCGT GCTGAGCCTG
[0236]CCGTTTGCTG AAGGCAGTTC CTCAGTGGAA TACATTAACA ATTGGGAACA AGCAAAAGCT
[0237]CTGAGTGTTG AACTGGAAAT CAATTTCGAA ACGCGTGGTA AACGCGGTCA GGACGCAATG
[0238]TATGAATATA TGGCCCAGGC TTGTGCAGGC AACCGTGTTC GCCGTTAA
[0239]GGATCC
[0240]将空白质粒和合成的0VApCRM197A基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0241]2 - 7、CRM197A0VAp、0VApCRM1970VAp、0VAp0VApCRM197A、CRM197A0VAp0VAp、0VAp0VApCRM197A0VAp、以及 0VApCRM197A0VAp0VAp 蛋白表达质粒的构建:
[0242]方法和上节“2 - 6、0VApCRM197A蛋白载体表达质粒的构建”相同。
[0243]2-8、P30CRM197AP2蛋白载体表达质粒的构建
[0244]采用自制的表达质粒，用Nde I酶识别质粒位点CATATG, Bam HI酶识别位点GGATCC。经过P30CRM197AP2蛋白基因序列进行分析，在序列内，无Nde I及Bam HI酶切位点。P30CRM197AP2基因合成全序列如下:
[0245]CATATG
[0246]TTCAACAATT TTACGGTCTC GTTTTGGCTG CGTGTCCCGA AAGTGTCTGC CTCACATCTG
[0247]GAAGGTAGCG GTTCAGGTGG TGCGGATGAC GTGGTTGATA GCTCTAAATC CTTTGTTATG
[0248]GAAAACTTCA GTTCCTATCA TGGTACCAAA CCGGGCTACG TCGATTCTAT TCAGAAAGGT
[0249]ATCCAAAAAC CG AAAAGTGG TACCCAGGGC AACTATGATG ACGATTGGAA AGAATTCTAC
[0250]TCTACGGACA ACAAATACGA TGCGGCCGGT TACTCGGTGG ACAACGAAAA TCCGCTGAGC
[0251]GGTAAAGCCG GCGGTGTCGT GAAAGTTACC TATCCGGGCC TGACGAAAGT GCTGGCTCTG
[0252]AAAGTTGATA ACGCGGAAAC CATCAAAAAA GAACTGGGTC TGAGCCTGAC CGAACCGCTG
[0253]ATGGAACAAG TGGGCACGGA AGAATTTATC AAACGTTTCG GTGACGGTGC ATCCCGTGTT
[0254]GTCCTGTCAC TGCCGTTTGC AGAAGGTTCA TCGAGCGTCG AATACATCAA CAACTGGGAA
[0255]CAAGCAAAAG CTCTGAGCGT GGAACTGGAA ATCAATTTCG AAACCCGTGG TAAACGCGGC
[0256]CAGGATGCTA TGTATGAATA CATGGCGCAA GCCTGCGCAG GTAACCGTGT TCGTCGCGGC
[0257]TCTGGTAGTG GCCAGTACAT CAAAGCGAAC AGTAAATTCA TCGGCATCAC GGAACTG
[0258]GGATCC
[0259]将空白质粒和合成的P30CRM197AP2基因的PCR产物中，分别加入Nde I酶和BamHI酶进行双酶切反应；纯化后，在连接体系中加入T4连接酶进行连接，完成后纯化表达质粒，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。用BL21(DE3)感受态细胞，将表达质粒转化至细胞内，筛选克隆，并用PCR鉴定体系及酶切图谱进行鉴定。获得阳性表达工程菌后，建立种子库，包括主种子和工作种子。储存于-20°C以下冰箱中。
[0260]2 -9、P2CRM197AP30、P2P30CRM197AP2、以及 P2P30CRM197A0VAp 蛋白载体表达质粒的构建
[0261]方法和上节“2 - 8.P30CRM197AP2蛋白表达质粒的构建”相同。
[0262]三、含有万能表位肽CRM197A蛋白载体和CRM197A蛋白载体的制备
[0263]实验结果表明，CRM197A蛋白载体和含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的特性相似；因此，这些蛋白载体的纯化方法相似，以下以含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体为例说明方法。
[0264]1、表达含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体工程菌的制备
[0265]用分子生物学标准方法将各个表达蛋白载体的质粒转入至感受态细胞内，并进行表达检定。筛选出蛋白表达量高，并且通过用抗血清检定合格的克隆，建立主种子库和工作种子库。
[0266]2、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体表达工程菌的发酵
[0267]从低温冰箱保存的大肠杆菌工程菌工作种子库中，取出一支表达含有特定万能表位肽的CRM197A蛋白载体的工作种子管，在室温下解冻；将种子管中的菌液无菌转移至50毫升的培养基中，在37°C，摇速为180rpm的摇床中培养至0D_ = 1.0左右；将菌液无菌接种至I升的培养基中，在37°C，摇速为180rpm的摇床中培养至0D_ = 1.0左右；接种种子液至50 -升发酵罐中的20升培养基中，在37°C下，240rpm条件下进行发酵，当0D_至7 -8时，加入IPTG诱导重组蛋白在细菌中合成；发酵至14小时后，停止发酵，离心，收集菌体待用。
[0268]3、含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化
[0269]由于构建含有不同万能表位肽的蛋白载体都是以CRM197A为主体，实验表明，尽管加入了万能表位肽，但对蛋白纯化的参数影响不大，只需要在纯化CRM197A蛋白载体的工艺参数上进行一些修饰，就可建立起其他含有万能表位肽的CRM197A蛋白载体的纯化方法。
[0270] 称重50g湿菌体于2升离心杯中，加入300mlIxPBS ρΗ7.0缓冲液混悬菌体，在磁力搅拌器上搅拌混匀30min ;在4°C下,4000rpm,离心20min,弃上清,收集菌体；重复该步骤两次；加入300mllxPBS pH7.0至菌体离心管，在均质机上进行破碎；在41:下，lOOOOrpm，离心20min ;收集沉淀，弃上清液；加入300mlIxPBS pH7.0缓冲液，在磁力搅拌器上搅拌30min ；在4°C下，4000rpm,离心20min ;弃上清液,收集包涵体，加入900ml变性缓冲液至洗漆后的包涵体，在25°C下，1000rpm离心30min，收集上清液，弃沉淀；将离心上清液转移至6 -8KD透析袋中，封闭透析袋；置透析袋于10升复性缓冲液I中，室温下，在磁力搅拌器上搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液2中，室温搅拌透析8 - 10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液3中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入10升复性缓冲液4中，室温搅拌透析8 -10小时；将透析袋转入10升复性缓冲液5中，室温搅拌透析过夜；次日将透析袋转入2升储备缓冲液中，室温搅拌透析8 - 10小时；更换储备缓冲液二次，室温透析过夜；取Iml透析液,室温12000rpm离心1min,收集上清,测蛋白质浓度；将蛋白溶液上样至预先平衡的DEAE胶柱，用等梯度洗脱，并收集目的蛋白峰；然后上样至Phenyl疏水柱进一步纯化，收集洗脱峰；最后上样SP胶柱，收集洗脱峰；将收集获得的纯化目的蛋白转至透析袋中，在0.15M的氯化钠中透析，完成后转移至4°C下储存待用。
[0271]四、细菌荚膜多糖的制备
[0272]对三种细菌的荚膜多糖，包括肺炎球菌的13个血清型，流行性嗜血杆菌b型，以及流行性脑膜炎球菌的A、C、Y、和W135群，进行纯化，以便用于结合疫苗的合成，其质量达到WHO合成多糖蛋白结合疫苗的多糖质量标准。
[0273]1、肺炎球菌荚膜多糖制备
[0274]1- 1、种子库的建立
[0275]从ATCC购买的13个血清型肺炎球菌，包括1(货号:9163)、3(货号:10813)、4(货号:BAA - 334)、5(货号:BAA - 341)、6A(货号:BAA - 659)、6B(货号:700675)、7F(货号:10351)、9V(货号:700671)、14 (货号:6314)、18C(货号:10356) U9A(700673)、19F (700905)、和23F (700669)。取出ATCC购买的菌种(原始种子批)，加入0.5ml的肺炎球菌AHC液体培养基将菌种混匀，取0.25ml菌液于5 %羊血AHC培养液中。接种后的5 %羊血AHC培养液管置于36°C ± 1°C的培养摇床上，摇速120rpm，培养12 - 20小时。待OD6tltl至1.0时，用接种环将5%羊血AHC培养液接种至AHC琼脂培养基平皿上，置于36°C ±1°C的培养箱内培养12 - 20小时。用接种环将AHC琼脂平皿上的I至数个菌落接种于1ml的AHC培养液中，置于36°C ± I°C，在培养摇床上培养12小时，摇速150 - 200rpm。培养液中细菌0D_长到1.0，取出5ml细菌AHC培养液接种到200ml的新鲜AHC培养液中，置于360C ±1°C的培养摇床上培养12小时左右，摇速150 -200rpm。OD600至1.0时，将细菌培养液以Iml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，1min)，去除上清培养液，然后加入0.5ml的新鲜AHC培养液和0.5ml的无菌脱脂牛奶，混匀，在乙醇干冰上快速冷冻。真空冻干，编号，作为主种子批保存于4°C冰箱内。取出主种子批建立，按照主种子建立方法，将细菌培养液接种到另一个200ml的新鲜AHC培养液中，置于36°C ± 1°C的培养摇床上培养12小时，内培养12小时左右，摇速150 -200rpm。待OD6tltl至1.0时，将细菌培养液以Iml分装于200个小试管中，离心(4000rpm，1min)，去除上清培养液，然后加入0.6ml的新鲜AHC培养液和0.4ml的40%甘油溶液，混匀。速冻于干冰上，作为工作种子保存于-70°C低温冰箱中。
[0276]1- 2、肺炎球菌的发酵
[0277]从种子库中取出冻干工作种子管，加入1ml AHC富集培养液溶解冻干细菌。将溶解的菌液接种于5ml AHC富集培养液试管中，在CO2培养箱中静置培养过夜。观察有细菌生长时，将菌液接种于10ml的AHC富集培养液三角瓶中。置培养瓶于摇床中，36°C下，200rpm/min培养至OD_为1.0。将10ml细菌培养液分别接种于2个装有1-升的AHC富集培养液瓶中。置培养瓶于摇床中，36°C下，200rpm/min培养至OD6tltl为1.0。将35升的无菌过滤AHC富集培养液注入50升发酵罐中。接种2升OD为I的菌液至发酵罐中。当细菌生长到达平台期，杀菌，收获培养上清液。
[0278]1- 3、荚膜多糖的纯化
[0279]用深层滤膜过滤，进一步去除残存细菌及碎片。将无菌的上清培养液用10Kd超滤膜超滤浓缩十倍(约600ml)。以6升25mM醋酸钠溶液进行超滤清洗。加入HB储存液使得最终浓度为1% (w/v)，混匀，将溶液放置于冷库过夜。离心，4000rpm，l小时，收集多糖/HB沉淀，摈弃离心液。加入25mM的sodium acetate+1 % HB至多糖/HB沉淀容器中，搅拌悬浮沉淀，离心，4000rpm，I小时，收集多糖/HB沉淀，弃离心液。重复3次该步骤。用600ml的0.25M氯化钠溶液溶解沉淀。离心，4000rpm，I小时，丢弃不溶的核酸污染物。加入10%碘化钾溶液入多糖+HB混合溶液中，混匀，碘化钾最终浓度为0.5%，将溶液置于冷库中过夜。用深层过滤器过滤溶液，除去溶液中的HB/I沉淀，并用0.25M氯化钠/0.5%碘化钾溶液清洗深层过滤器上的沉淀，收集过滤液，弃去沉淀。将粗制的多糖溶液通入活性炭深层过滤器进行循环过滤30分钟(4%活性炭/0.5mg/ml多糖粗制溶液)。加入磷酸钠缓冲液pH6.8，最终浓度25mM加入到多糖溶液中。将以上溶液过HA柱(50 - 100ml)，循环30分钟。用相同磷酸盐溶液洗柱4-5个柱体积。用30Kd膜超滤浓缩多糖溶液5-倍，用无热源水超滤清洗多糖溶液。用0.22 μ m膜过滤，冻干。
[0280]2、流行性嗜血杆菌b型荚膜多糖的制备
[0281]2 - 1、种子库的建立
[0282]由赠送获得的流行性嗜血杆菌b型菌株作为原始种子株建立主种子库和工作种子，建立方法见肺炎球菌种子库节。
[0283]2 - 2、流行性嗜血杆菌b型细菌的发酵
[0284]将流行性嗜血杆菌b型(Hib)工作种子接种到平皿培养基上，在36.5°C培养箱过夜。取一个Hib菌斑，接种到5毫升的新鲜基本培养液中，在36.5°C和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6-1.0 ;将接种的培养液转接到250毫升培养瓶中，其中有45毫升的新鲜基本培养液，在36.5°C和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期，OD为0.6 - 1.0 ;将接种的培养液转接到4升培养瓶中，其中有I升的新鲜基本培养液，在36.5°C和300rpm细菌培养摇床培养。当接种的培养液达到了指数生长中期(约16 - 18小时)，OD为0.6 - 1.0 ;将接种的培养液转接到发酵罐中，其中有20升的新鲜基本培养液。当Hib细菌达到指数生长中期时，加入新鲜基本培养液和补充培养液，最终培养液中的糖浓度为23g/L，所加入的新鲜补充培养液的总体积为25升。培养14.5小时后停止发酵。
[0285]2 - 3、荚膜多糖的纯化
[0286]将Hib培养液离心沉淀的Hib菌体，悬浮在2升的蒸馏水中，用磁力搅拌器混匀。加入200ml的12% Deoxycholate sodium溶液入细菌悬浮液中，搅拌混匀30分钟，然后转入到I (TC ±3°C冷柜中搅拌8 - 24小时，保证菌体完成裂解、多糖释放出来。用50%的醋酸调节细菌裂解液的pH值到6.4 - 6.8，温度为20°C ±5°C，停止搅拌，静止12 - 24小时。以10，OOOrpm离心I小时，收集上清液，丢弃沉淀物。用0.05M的磷酸盐pH7.0透析多糖上清液。加入等体积的0.2% HB溶液，用磁力搅拌器混匀30分钟，然后，转入到4°C冷柜中静至过夜。以10，OOOrpm离心30min,收集沉淀,丢弃上清液。加入10ml的0.5M氯化钠溶液溶解沉淀。加入680ml无水乙醇，混匀，然后，转入到4°C冷柜中静至过夜。以10，OOOrpm离心30min，收集上清液，丢弃沉淀。加入5.2升无水乙醇，混匀，然后，转入到4°C冷柜中静置过夜。以10，OOOrpm离心30min,收集沉淀,丢弃上清液。加入500ml的蒸懼水溶解沉淀,透析。冻干。
[0287]3、流行性脑膜炎球菌荚膜多糖的制备
[0288]3 - 1、种子库的建立
[0289]由赠送获得的流行性脑膜炎球菌A、C、Y、和W135群菌株作为原始种子株建立主种子库和工作种子，建立方法见肺炎球菌种子库节。
[0290]3 - 2、流行性脑膜炎球菌细菌发酵和纯化
[0291]见“2、流行性嗜血杆菌b型多糖纯化”节。
[0292] 五、多糖蛋白结合物的制备
[0293] 不同细菌多糖的化学结构中含有不同的基团，需要采用不同的合成方法将多糖共价键地连接至蛋白载体形成结合物，并且不同方法合成的结合物的产量和免疫原性有所不同。本发明根据实验结果，采用三种合成方法，即还原胺法，CDAP法(1- (3 - 二甲基氨基丙基)-3 -乙基碳化二亚胺盐酸盐法)和ADH法(己二酰二肼法)，来合成特定的多糖蛋白结合物。本发明的多糖蛋白结合物包括13价肺炎球菌多糖结合物、流行性嗜血杆菌b型多糖结合物、以及4价流行性脑膜炎球菌多糖结合物。
[0294]1、13价肺炎球菌多糖P2CRM197A蛋白结合物的制备
[0295]设计并生产出共26种用CRM197A蛋白载体来合成的多糖蛋白结合物，由于蛋白质的结构相似，用于特定的多糖合成时，所采用的方法是还原胺法，ADH法或者CDAP法中的一种。在下面的示例中仅用P2CRM197A蛋白载体的合成过程来说明方法；而用其它蛋白载体合成时，采用方法相似，在此不一一列举具体方法。
[0296]1- 1、肺炎球菌血清型I荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0297]称取5mg的Pnl降解多糖于反应瓶中，量取0.5ml的lmol/L NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。记录多糖溶液的初始pH，分别量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min,30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min (用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5)。3min后立即向反应瓶中加入5mg的P2CRM197A蛋白，在室温下(25°C )搅拌反应lh。量取37.5 μ 12mol/L赖氨酸加入反应瓶中，用0.1N HCl调节溶液pH至9.0。室温下搅拌反应30min，将反应瓶转移到4°C下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWC06 - 8000)中，在4°C下，对0.85%NaCl溶液透析3次，61/次。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm，离心1min后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物,并收集结合物峰,取样送检。
[0298]1- 2、肺炎球菌血清型3荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0299]称取20mg的Pn3降解多糖于反应瓶中，量取2ml的0.15M NaCl加入反应瓶中；磁力搅拌使多糖完全溶解。量取适量的CDAP溶液，加入反应瓶中。室温下搅拌反应1.5min，30s时测定溶液的pH。1.5min后，用0.2mol/L NaOH调节溶液的pH至9.5，室温下搅拌反应3min (用0.2mol/L NaOH维持pH在9.5)。加入最终浓度为0.8M的ADH至反应瓶中，搅拌混匀，室温下反应2 小时。将衍化后的多糖转至10KD的透析袋中对0.15M NaCl溶液进行透析，换液三次。上样6-50柱，用0.1511 NaCl洗脱，收集外水体积峰。然后转移至透析袋中，对水透析，换液三次。称取5mg衍化后的Pn3多糖，溶解至0.5ml的0.15M NaCl溶液中，加入5mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀后，加入30mM的EDC，在室温下反应4小时，转移到4°C下反应过夜。将反应混合物转移至透析袋(MWC06 - 8000)中，在4°C下，对0.85%NaCl溶液透析3次，61/次。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm，离心1min后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物,并收集结合物峰,取样送检。
[0300]1- 3、肺炎球菌血清型4荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0301]称取5mg活化多糖至反应瓶中，量取100 μ I的0.5Μ磷酸钠缓冲液，加入反应瓶中，量取5mg的P2CRM197A蛋白至反应瓶中，磁力搅拌使多糖完全溶解；量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride,加入反应瓶中。将反应体系置于30°C的干浴器中反应12h。反应结束后，量取1.5ml的0.15M sodium chloridesolut1n加入反应瓶中。称取2.5mg的sodium borohydride,加入反应瓶中。反应体系置于22°C下反应5h ;将反应混合物转移至透析袋(MWC012 - 14Kd)，在4°C下，对0.15M sodiumchloride solut1n透析3次，每次透析液量6L。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm,离心1min后取上清液,采用Sepharose CL - 4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0302]1- 4、肺炎球菌血清型5荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0303]称取5.0mg活化多糖，加入至反应瓶中，向反应瓶中加入100 μ I的0.5Μ磷酸钠缓冲液；称取4.0mg的P2CRM197A蛋白，加入反应瓶中，量取0.5ml纯水加入反应瓶中，磁力搅拌使反应物溶解，测定反应体系的pH ;称取5.0mg sodium cyanoborohydride,加入反应瓶中；将反应体系置于室温下反应48小时；称取2.5mg的sodium borohydride,溶解于10 μ I纯水中，用移液枪混匀溶解完全后，加入反应瓶中；将反应体系置于23°C下搅拌反应5小时；将反应混合物转移至透析袋(MWC06 - 8KD)中，在4°C下，对0.15M氯化钠溶液透析3次，每5小时换液一次。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm，离心1min后取上清液，采用Sepharose CL - 4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物,并收集结合物峰,取样送检。
[0304]1- 5、肺炎球菌血清型6A荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0305]称取6.0mg活化Pn6A多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入ImL纯化水，搅拌至完全溶解后测初始pH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0 ;向反应体系中加入4mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride,加入上述反应瓶中，在室温反应18小时；反应结束后取样送检；称取2.7mg的Sodium borohydride,加入上述反应瓶中，在室温反应5小时；反应结束后取样送检；将反应混合物转移至透析袋，在4°C下，对0.15M氯化钠溶液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm，离心1min后取上清液，采用Sepharose CL-4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物,并收集结合物峰,取样送检。
[0306]1- 6、肺炎球菌血清型6B荚膜多糖-P2CRM197A蛋白结合物合成
[0307]称取5.0mg的Pn6B多糖加入至反应瓶中，向反应瓶中加入ImL纯化水，搅拌至完全溶解后测初始PH值；用0.1M NaOH调节反应液pH值至7.0 ;向反应体系中加入2.5mg的P2CRM197A蛋白，搅拌混匀；称取5.0mg的sodium cyanoborohydride,加入上述反应瓶中，在室温反应20小时；称取2.5mg的Sodium borohydride,加入上述反应瓶中，在室温反应6小时；将反应混合物转移至透析袋，在4°C下，对0.15M NaCl溶液透析5次，6L/次。透析结束后将反应混合液lOOOOrpm,离心1min后取上清液,采用Sepharose CL - 4B凝胶柱纯化透析后的多糖结合物，并收集结合物峰，取样送检。
[0308]1- 7、肺炎球菌血清型7F荚膜多糖-P2CRM197A