专利名称：上皮细胞间粘接增强剂和使用该增强剂的过敏的改善、治疗或预防剂的制作方法过敏是由于免疫系统对异物产生异常反应而引起的。人体与外界异物进行接触的器官主要有表皮、呼吸器官以及消化器官。其中，尤其以消化器官，因为其具有独特的免疫体系并为影响全身免疫系统的免疫器官，近年来倍受关注。 合而产生的炎症细胞因子的表达有作用的合成类固醇内服药，但是合成类固醇内服药具报道有诱发感染症、导致动脉硬化病变、副肾机能不全、消化道紊乱和女性月经异常等副作用。确认有重度的副作用的情况下，应该考虑采用其他的治疗方法或者使用复合治疗。近年来，不仅是合成类固醇内服药，还有很多有关通过结合改善肠道的负责免疫的细胞的平衡以及免疫细胞活性化的方法而可以得到一定的治疗效果的报道。以往，作为过敏预防方法，主流方法是基于得过敏症的儿童肠内的双歧杆菌比健康」L童少的事实，改善肠内细菌丛构成平衡的方法。以调整肠内细菌丛构成平衡来改善或预防过敏的想法为基础的方法，在日本特开平8-157379 (专利文献I)中记载了使用含有低聚果糖的过敏预防剂的方法。在日本特开2003-201239 (专利文献2)中，记载有含有低聚果糖的免疫活化食品。另外，日本专利第4162147号(专利文献3)、日本特开2008-280354 (专利文献4)中记载了抑制过敏的方法。专利文献I中记载了，针对缺镁而诱发的过敏，摄取含有镁源、低聚果糖以及难消化性糖醇的组合物的方法。该方法通过使肠内细菌利用低聚果糖生产有机酸，利用该有机酸和难消化性糖醇的作用促进镁的吸收，从而预防过敏的诱发，该方法能够治疗由缺镁诱发的过敏，但是该方法无法治疗由其他原因引起的过敏，限制了治疗对象。专利文献2中记载了，通过摄取低聚果糖诱导派尔集合淋巴小结(Peyer patch)产生IgA，活化肠道免疫的方法。但是该方法的有效量很大，难以每天摄取。专利文献3记载了，低聚果糖中的I-蔗果三糖为最大组成比例的第I组合物的过敏抑制剂；专利文献4中记载了，含有低聚果糖中的I-蔗果三糖为最大组成比例的第I组合物的过敏抑制低聚糖。将这些过敏抑制剂和过敏抑制低聚糖与专利文献I 2记载的过敏症状的效果相比，过敏抑制效果比较高。然而，Clinical effects ofkestose，aprebiotic oligosaccharide, on the treatment of atopic dermatitis ininfants (非专利文献I)中也记载了，通过乳幼儿摄取1_鹿果三糖的试验结果显示，过敏症状的改善与双歧杆菌的增殖没有很强的相关性。近年来，发现成为过敏原的物质中普遍具有的半胱氨酸/丝氨酸蛋白酶活性可以分解上皮细胞间的紧密连接蛋白，进而降低上皮细胞间的粘接(非专利文献2和3)。所以，尝试了基于以下构思的方法通过修复上皮细胞间的紧密连接蛋白并促进其形成，以增强上皮细胞间粘接、抑制过敏原侵入体内的方法，来改善、治疗或预防过敏。至今，很多研究借助使用了肠道上皮细胞的模型，探索可增强上皮细胞间粘接的物质。举例来说，如来自鱼类的精子或酵母的核酸(专利文献5)、来自纤维素酶制剂的肽(专利文献6)、单唾液酸神经节苷酯3 (专利文献7)、来自乳酸菌的脂膜酸(专利文献8)、乳清蛋白质(专利文献9)等。以上这些物质都已证实是通过促进上皮细胞间紧密连接蛋白的形成从而起到抑制过敏效果的。然而，专利文献5 8中记载的物质的生产工序繁琐，并且难以进行工业化大量生产。并且，专利文献9记载的物质，虽然容易生产，但不得不摄取大量以达到治疗效果，难以每日进行摄取。由于以上理由，通过上述物质改善、治疗或预防过敏的制剂还未能实现。 现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开平8-157379号公报专利文献2 :日本特开2003-201239号公报专利文献3 :日本专利第4162147号公报专利文献4 日本特开2008-280354号公报专利文献5 :日本专利第4050799号公报专利文献6 :日本特开2002-275196号公报专利文献7 日本专利第4034364号公报专利文献8 :日本特开2008-212006号公报专利文献9 日本专利第4330088号公报非专利文献非专利文献I :Shibata R, et. a I. , Clin. Exp. Allergy, 2009Sep, 39(9),P1397-1403非专利文献2 ffan H. et. al.，J. Clin. Invest. 1999，104，P123-133非专利文献3 :Runswick S, et. al. , J. Allergy Clin. Tmmnol. , 2003, 111,P704-713发明的概要发明需要解决的课题本发明是基于通过增强上皮细胞间粘接，抑制过敏原侵入体内的方法，来改善、治疗或预防过敏的构思的发明。本发明人发现，2价金属阳离子和特定低聚糖的组合物与2价金属阳离子相比，可以进一步增强上皮细胞间的粘接，从而完成了以下发明。即，本发明的目的是提供含有特定低聚糖与2价金属阳离子的组合物，尽管通常低聚糖作为食品、2价金属阳离子作为在生物体内存在且在生理浓度范围内对生物体没有毒的物质而为人们所熟悉，但本发明的组合物与合成类固醇内服药相比，可以非常安全及有效的改善、治疗或预防过敏，或对局部的炎症反应起效果。解决课题的手段(I)上皮细胞中的细胞间粘接增强剂，其以I-蔗果三糖和/或蔗果四糖以及2价金属阳离子为有效成分。(2)根据(I)所述的增强剂，其以I-蔗果三糖和2价金属阳离子为有效成分。(3)根据(2)所述的增强剂，其中，I-蔗果三糖是纯度为95重量％以上的含有I-蔗果三糖的低聚糖，相对于所述含有I-蔗果三糖的低聚糖10重量份，2价金属阳离子为I重量份以上。(4)根据(I)至(3)中任一项所述的增强剂，其中，2价金属阳离子为钙离子。(5)根据(I)至(4)中任一项所述的增强剂，其中，上皮细胞为肠道上皮细胞。(6)过敏的改善、治疗或预防剂，其使用了(I)至(5)中任一项所述的增强剂。发明的效果 通过使用本发明中的上皮细胞间粘接增强剂和使用了该增强剂的过敏的改善、治疗或预防剂，可以抑制导致过敏原侵入体内的原因，即上皮细胞间紧密连接蛋白的破坏，此夕卜，还可以通过修复上皮细胞间紧密连接蛋白或促进其形成，从而增强上皮细胞间的粘接，有效地改善、治疗和预防过敏症状。图I表示实施例I中，通过添加I-鹿果三糖或鹿果四糖,TEER经时变化的测量结
果O图2表示实施例2中，通过添加I-蔗果三糖，TEER经时变化的测量结果。图3表示实施例3中，通过添加I-蔗果三糖，TEER经时变化的测量结果。图4表示实施例4中，通过添加I-蔗果三糖，TEER经时变化的测量结果。图5表示实施例4中，通过添加I-蔗果三糖，TEER经时变化的测量结果。图6表示实施例5中，通过添加I-蔗果三糖或蔗糖或蔗果四糖导致物质渗透量发生变化的测量结果。图7表示实施例6中，通过添加I-蔗果三糖，TEER经时变化的测量结果。

“实施例I :确认I-蔗果三糖对细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低具有促进恢复的效果的试验”实施例I中，通过使用了培养细胞的试验，对I-蔗果三糖对细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低具有促进恢复的效果进行了确认。本实施例I中使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的组成为，I-蔗果三糖为98重量％、蔗果四糖为I重量％、蔗糖为I重量％的低聚糖，即I-蔗果三糖的纯度为98重量％的低聚糖。并且，使用上皮细胞间电阻(TEER)作为培养细胞的细胞间粘接强度的指标。该测定方法利用的原理为，当上皮细胞间粘接越强，培养细胞的上层培养基与下层培养基的电阻值越大的性质，该方法还用于以上皮细胞为模型的试验等。结肠上皮癌细胞Caco-2细胞在含有10%FBS的DMEM培养基(GIBCO)上进行连续传代培养，冷冻保存第48代培养细胞，以备在接下来的试验中使用。将Caco-2细胞接种于Transwell双层细胞培养板(Corning Life Science)的上层，在含有10%FBS的DMEM培养基的存在下，置于5%C02、37°C的培养箱内培养。进行细胞培养直至Transwell双层细胞培养板的上层和下层间的电阻(TEER)达到400 500Ω · cm2。将含有10%FBS的DMEM培养基更换为缺钙的DMEM培养基，对培养至TranswelI双层细胞培养板的TEER达到400 500 Ω · cm2后的Caco-2细胞培养2小时。之后，向含钙的DMEM培养基的上层以I重量％的浓度添加含I-蔗果三糖的低聚糖、或蔗果四糖，每隔30分钟进行TEER经时测定，TEER的测定进行至培养22小时后(1%蔗果三糖组、1%蔗果四糖组、n=3)。作为对照组，制作只在缺钙的DMEM培养基中培养的组(阴性对照组，n=3)和只在缺钙的DMEM培养基培养2小时后更换为含有钙的DMEM培养基中培养的组(阳性对照组，n=3)，进行TEER经时变化的比较。以下，图I表示实施例I中TEER比的测定结果。阴性对照组中几乎没有见到TEER的恢复，但是1%蔗果三糖组、1%蔗果四糖组及阳性对照组中，与阴性对照组相比，均见到了明显的TEER恢复。同时，与阳性对照组相比，1%蔗果三糖组和1%蔗果四糖组也见到了明显的促进TEER恢复的效果。具体来说，由缺钙的DMEM培养基更换为含钙的DMEM培养基30分钟后的1%蔗果三糖组中，与阳性对照组相比，见到了平均2.4倍的恢复促进效果。此外，与1%蔗果四糖组相比，1%蔗果三糖组显示有更强的恢复促进的倾向。由此确认了，I-蔗果三糖对降低的上皮细胞间粘接具有强烈的恢复促进作用。“实施例2 :确认I-蔗果三糖对细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低具有促进恢复的效果是依赖于钙的试验”实施例2中，通过使用培养细胞的试验，确认I-蔗果三糖的促进从由细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低中恢复的效果依赖于钙。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的纯度与实施例I相同，在与实施例I相同的培养细胞的培养条件下进行。将含有10%FBS的DMEM培养基更换为缺钙的DMEM培养基，对培养至TranswelI双层细胞培养板的TEER达到400 500 Ω · cm2后的Caco-2细胞培养2小时。之后，向含有钙的DMEM培养基中在上层以I重量％的浓度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，每隔30分钟进行TEER经时测定，培养并进行TEER的测定，直至3小时后(韩( + )1%蔗果三糖组、n=3)。此夕卜，制作如下的组直接在缺钙的培养基上层以I重量％的浓度添加含I-蔗果三糖的低聚 糖，培养并进行TEER的测定，直至3小时后(韩(_)1%蔗果三糖组、n=3)。作为对照组，制作只在缺钙的DMEM培养基培养的组(阴性对照组，n=3)和只在缺钙的DMEM培养基培养2小时后更换为含有钙的DMEM培养基的组(阳性对照组，n=3)组成，进行TEER经时变化的比较。以下，图2表示实施例2中TEER比的测定结果。阴性对照组和钙(_)1%蔗果三糖组中几乎没有见到TEER的恢复。但是，与实施例I相同，钙(+ ) 1%蔗果三糖组和阳性对照组均见到了明显的TEER恢复；钙(+ ) 1%蔗果三糖组中，与阳性对照组相比，与实施例I相同，也见到了明显的TEER恢复促进效果。由此确认了，如果在细胞外没有钙存在的情况下，I-蔗果三糖不会显示TEER恢复的效果，I-蔗果三糖对降低的上皮细胞间粘接的恢复促进效果依赖于细胞外的钙。“实施例3 :确认I-蔗果三糖对细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低具有促进恢复的效果是依赖于浓度的试验”实施例3中，通过使用培养细胞的试验，确认I-蔗果三糖对细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低具有促进恢复的效果是依赖于浓度的。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的纯度与实施例I相同，在与实施例I相同的培养细胞的培养条件下进行。将含有10%FBS的DMEM培养基更换为缺钙的DMEM培养基，对培养至TranswelI双层细胞培养板的TEER达到400 500 Ω · cm2后的Caco-2细胞培养2小时。之后，向含有钙的DMEM培养基的上层以I重量％或O. I重量％的浓度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，每隔30分钟进行TEER经时测定，培养并进行TEER的测定，直至3. 5小时后(1%蔗果三糖组、O. 1%蔗果三糖组、n=3)。作为对照组，制作只在缺钙的DMEM培养基培养的组(阴性对照组，n=3)和只在缺钙的DMEM培养基培养2小时后更换为含有钙的DMEM培养基中培养的组(阳性对照组，n=3)组成，进行TEER经时变化的比较。以下，图3表示实施例3中TEER比的测定结果。与实施例I相同，阴性对照组中几乎没有见到TEER的恢复。但是，1%蔗果三糖组、O. 1%蔗果三糖组及阳性对照组中，与阴性对照组相比，均见到了明显的TEER恢复。此外，1%蔗果三糖组与O. 1%蔗果三糖组相比，显示了更强的TEER恢复促进效果的倾向。通过以上确认了，I-蔗果三糖对降低的上皮细胞间粘接的恢复促进效果是依赖于浓度的。
“实施例4 :调查事先投药I-蔗果三糖，对由于细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接降低起抑制效果的试验”实施例4中，通过使用培养细胞的试验，确认了事先投药I-蔗果三糖是否可以抑制由于细胞外缺钙而导致的上皮细胞间粘接的降低。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的纯度与实施例I相同，在与实施例I相同的培养细胞的培养条件下进行。对于培养至Transwell双层细胞培养板的 TEER达到400 500 Ω .cm2后的Caco-2细胞，将含有10%FBS的DMEM培养基更换为含钙的DMEM培养基，在上层以I重量％的浓度添加含I-蔗果三糖的低聚糖，在I小时或6小时后更换为缺钙的培养基，每隔30分钟进行TEER经时测定，测定3回(I小时钙(+ ) 1%蔗果三糖组、6小时钙(+ ) 1%蔗果三糖组、n=3)。作为对照组，制作在含钙的DMEM培养基上培养I小时或6小时后，在缺钙的DMEM培养基上培养的组(I小时钙(+ )阴性对照组、6小时钙(+ )阴性对照组、n=3 )，和只在含钙的DMEM培养基中培养的组(阳性对照组，n=3)组成，进行TEER经时变化的比较。以下，图4、图5表示实施例4中TEER比的测定结果。图4表示I小时钙( + )1%蔗果三糖组、I小时钙(+ )阴性对照组和阳性对照组的比较结果。确认了 I小时钙(+ ) 1%蔗果三糖组在即将更换为缺钙DEME培养基之前的TEER测定中，与I小时钙(+ )阴性对照组和阳性对照组相比，TEER显著地增加。此外，确认了在更换为缺钙的DMEM培养基并除去了I-蔗果三糖的状态下，与I小时钙(+ )阴性对照组相比，I小时钙( + )1%蔗果三糖组的TEER降低有被抑制的倾向。其次，图5表示6小时钙(+ ) 1%蔗果三糖组、6小时钙(+ )阴性对照组和阳性对照组的比较结果。与图4相同，确认了 6小时钙( + )1%蔗果三糖组在即将更换为缺钙DEME培养基之前的TEER测定中，与6小时钙(+ )阴性对照组和阳性对照组相比，TEER显著地增加。同样，确认了在更换为缺钙的DMEM培养基并除去了含有I-蔗果三糖的低聚糖状态下，与6小时钙(+ )阴性对照组相比，6小时钙(+ ) 1%蔗果三糖组的TEER降低有被抑制的倾向。由以上结果得出，事先投药I-蔗果三糖可以预防上皮细胞间粘接降低，并确认I-蔗果三糖在其存在的情况下，可以起到上皮细胞间粘接促进作用。“实施例5 :确认抵抗细胞外缺钙引起的细胞膜透性亢进的物质的透过抑制效果的试验”实施例5中，通过包括与其他低聚果糖的比较并使用培养细胞的试验，确认了I-蔗果三糖细胞显示的对抵抗细胞外缺钙引起的细胞膜透性亢进的物质的透过抑制效果。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的纯度与实施例I相同，在与实施例I相同的培养细胞的培养条件下进行。将含有10%FBS的DMEM培养基更换为缺钙无色HBSS培养基(GIBC0)，对培养至Transwell双层细胞培养板的TEER达到400 500 Ω ·ο 2后的Caco-2细胞培养2小时后，在缺钙无色HBSS培养基(GIBCO)上层以I重量％的浓度添加含1_蔗果三糖的低聚糖、或蔗糖、或蔗果四糖，同时在上层以100 μ M的浓度添加作为细胞间透过物质的荧光黄(LuciferYellow) (MP Biomedical公司)，培养3小时后，回收下层的HBSS培养基，通过荧光酶标仪对从上层渗透至下层的荧光黄(Lucifer Yellow)的残留浓度进行测定(1%蔗果三糖组、1%蔗糖组、1%蔗果四糖组、n=3)。作为对照组，制作只在缺钙的HBSS培养基培养的组(阴性对照组、n=3)和只在缺钙的HBSS培养基中培养2小时后更换为含钙的HBSS培养基的组(阳性对照组、n=3)组成,进行细胞间透过物质量的比较。以下，图6表示实施例5中荧光黄(Lucifer Yellow)在下层残留浓度的测定结果。与阴性对照组相比，1%蔗果三糖组、1%蔗果四糖组和阳性对照组中的残留浓度都明显的较低。此外，与阳性对照组相比，1%蔗果三糖组和1%蔗果四糖组显示更少的残留浓度，1%蔗果三糖组的残留浓度最低。由以上结果得出，I-蔗果三糖通过促进上皮细胞间粘接，可以抑制成为过敏原的蛋白质等的透过性。“实施例6 :确认对由炎症性细胞因子IL-I β引起的上皮细胞间粘接降低的抑制效果的试验”实施例6中，通过使用培养细胞的试验，确认了 I-蔗果三糖具有抑制由炎症性细胞因子引起的上皮细胞间粘接降低的效果。使用的含有I-蔗果三糖的低聚糖的纯度与实施例I相同，在与实施例I相同的培养细胞的培养条件下进行。向DMEM培养基上层以I重量％的浓度添加含1_蔗果三糖的低聚糖，对培养至Transwell双层细胞培养板的TEER达到400 500 Ω · cm2后的Caco-2细胞培养24小时后，以10ng/mL的浓度向下层添加炎症性细胞因子IL-I β ,48小时后进行TEER测定，计算出与最初TEER的测定值的比(1%蔗果三糖( + )、IL-1 β ( + )组、n=3)。作为对照组，制作只添加IL-I β的组(1%鹿果二糖(-)、IL_1 β ( + )组、η=3),以及未添加含I-鹿果二糖的低聚糖和IL-I β的组(1%蔗果三糖(_)、IL-10 (_)组、n=3)，进行TEER比的比较。以下，图7表示实施例6中TEER比的测定结果。与1%蔗果三糖(_)、IL-I β (-)组的TEER比的平均值O. 914、标准偏差O. 031相比较，1%蔗果三糖(_)、IL-I β ( + )组的TEER比的平均值为O. 585、标准偏差为O. 002，1%蔗果三糖( + )、IL-I β ( + )组的TEER比的平均值为O. 849、标准偏差为O. 0003。由此结果可以得出，通过添加含有I-蔗果三糖的低聚糖可以抑制大约26%由IL-I β降低的TEER。由以上结果得出，I-蔗果三糖具有可以抑制局部炎症反应所导致的上皮细胞间粘接降低的效果。用于产业的可能性本发明通过对作为过敏原因的上皮细胞间紧密连接蛋白进行修复或促进其形成，可以有助于改善、治疗并预防过敏。


本发明公开了一种含特定的低聚糖和2价金属阳离子的组合物，尽管组合物中的成分通常作为食品或作为在生物体内存在且在生理浓度范围内对生物体没有毒的离子而为人们所熟悉，但该组合物可以有效的改善、治疗或预防过敏或局部炎症反应，并且与合成口服类固醇药剂相比具有安全有效的特点。一种上皮细胞的细胞间粘接增强剂，以1-蔗果三糖和／或蔗果四糖以及2价金属阳离子为有效成分。该增强剂可阻止导致过敏原侵入体内的原因，即上皮细胞间紧密连接蛋白的破坏，还可以修复上皮细胞间紧密连接蛋白或促进其形成，从而增强上皮细胞间的粘接，达到有效地改善、治疗和预防过敏症状。