专利名称：免疫原性组合物和相关的方法佐剂是掺入疫苗制剂中以增强疫苗抗原免疫原性的物质。铝盐(例如磷酸铝和氢氧化铝)是现今在人和兽用疫苗中使用的最常用佐剂。虽然许多包含铝的佐剂是可得的，但是对于任何一种特定的疫苗制剂，由其提供的佐剂/抗原效果可能不是最优的。两种方法已一般被用于制备具有铝化合物的疫苗和类毒素-在存在抗原下原位沉淀铝化合物和将抗原吸附到预形成的铝凝胶上。在铝佐剂的原位沉淀或到预形成的铝凝胶上期间，在铝佐剂上吸附抗原取决于抗原的物理和化学特性、使用的铝佐剂类型和吸附条件。可影响抗原在铝佐剂上的吸附的因素包括静电力、疏水相互作用、范德瓦尔斯力、氢结合、pH、温度、凝胶颗粒尺寸和反应混合物的离子强度。通常，抗原通过静电吸引(即，佐剂和抗原具有相反的电荷)和/或配体交换(例如，抗原上的磷酸基置换佐剂表面上的氢氧基)吸附于招佐剂(Seeber SJ,等 Vaccine 1991 ;9:201-3 ;Iyer S.等，Vaccine2004 ；29:1475-9)。氢氧化铝在其脱氢、结晶形式化学上是偏氢氧化铝[AlO(OH)],但在其水相通过获得另外的水分子，它变成氢氧化铝[Al(OH)3] (Hem S. L.等2007 Vaccine25:4985-4986)。偏氢氧化铝具有11的零电荷点(PZC)，因此它在pH 7. 4下带正电荷。该正电荷使得偏氢氧化铝对于带负电荷的抗原(例如酸性蛋白)是好的吸附剂。在一个研究中，发现用磷酸阴离子预处理氢氧化铝佐剂改变佐剂的表面电荷特性，使得碱性蛋白(溶菌酶，即P.+11.1)可被吸附。发现磷酸阴离子降低佐剂的正 电位(mV)，且佐剂表面电荷的该改变将佐剂和溶菌酶之间的静电力从排斥变化为吸引，使得蛋白被佐剂吸附(Rinella Jr. J. V.,等，Vaccine 1996 ; 14(第 4 期)298-300)。可以单层吸附于佐剂的抗原最大量被称为“吸附能力”和吸附力的强度被称为“吸附系数”(Jendrick等，Vaccine 2003 ； 21:3011-8)。吸附能力对疫苗免疫原性的影响研究表明吸附的抗原剂量百分比与制剂的免疫原性不相关(Chang M-F.等，Vaccine2001 ； 19:2884-9 ；Romero Mendez IZ 等 Vaccine 2007 ;25 (5) : 825-33)。与此相反，一个研究显示抗原与包含铝的佐剂的吸附系数与由制剂引起的免疫反应之间相关(Hansen等，Vaccine 2007;25:6618-6624)。吸附可影响蛋白的结构和稳定性。来自关于吸附于包含铝的佐剂的影响的研究结果不完全一致在一个研究中，吸附到Alhydrogel 或Adju_Phos 上后，去稳定化三种蛋白(牛血清白蛋白(BSA)、溶菌酶和卵白蛋白)；在另一研究中，通过吸附到氢氧化铝上，稳定化BSA和 2-乳球蛋白(BLG)的结构(Jones L. S.等，J. Biol Chem 2005 ；280(14) :13406-13414 ;Zheng Y.等，Spectroscopy 2007 ;21 (5-6) : 257-268)。用于稳定化具有铝盐佐剂的疫苗组合物液体制剂储存的方法包括冻干、冷冻和冷冻干燥，但经常引起佐剂团聚、免疫原浓度降低和免疫原性损失(例如，Maa等，(2003) J. Pharm. Sci.92:319-332 ；Diminsky 等(1999) Vaccine 18:3-17 ；Alving 等(1993) Ann. NY Acad.Sci. 690:265-275 ;和Warren 等(1986) Ann Rev Immunol. 4:369-388，所有的这些通过引用结合)。甚至对于在冷藏条件(例如2V -8°C )下保持的那些制剂，吸附的抗原可能化学上不稳定，因此，随时间推移可经历水解和破碎。因此，需要一种用于解决这些问题(例如，化学不稳定性、抗原浓度降低)的生产包含铝盐佐剂的疫苗组合物的方法。发明概沭 本发明涉及制备抗原稳定性增加的包含至少一种抗原和含有氢氧基的铝化合物的免 疫原性组合物的方法。该方法包括(a)将含有氢氧基的铝化合物用选自以下的化合物处理(i)磷酸盐、(ii)羧酸盐、(iii)碳酸盐、(iv)硫酸盐、(v) 二膦酸盐和(vi) (i)-(v)中两种或更多种的混合物；和(b)将步骤(a)中的制备物与至少一种抗原混合。可将铝化合物备选地用氟化物处理。相对于其中抗原与未处理的含有氢氧基的铝化合物混合的组合物，将抗原与处理的含有氢氧基的铝化合物混合增加抗原的稳定性。亦提供包含至少一种抗原和已用磷酸盐、羧酸盐、碳酸盐、硫酸盐、二膦酸盐、氟化物或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物以及使用这些组合物用于预防和治疗疾病的方法。在一个实例中，根据公开的方法，制备包含肺炎链球菌蛋白PcpA和已用选择的化合物之一(例如，磷酸盐)处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物。组合物亦可包含来自多组氨酸三联体家族的肺炎链球菌蛋白(PhtX :PhtA、PhtB、PhtD、PhtE)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素。本发明提供数个优势。例如，本发明的组合物是免疫原性的并具有改善的稳定性。本发明的其他特征和优势从下述详述、附图和权利要求中将显而易见。附图概述 参考附图，从下述描述将进一步理解本发明。图la-f.多价制剂(用AlO (OH)或磷酸盐处理的AlO (OH) (PTH)配制)中的PcpA和PhtD的稳定性。使用AlO(OH)或具有终浓度为2mM磷酸盐的PTH制备制剂，然后在各种温度(即5°C、25°C、37°C*45°C )下孵育30周。然后通过RP-HPLC评估完整的抗原浓度。图2.通过ELISA评价的PhtD和PcpA在应激条件下的稳定性。将100 μ g/mL的二价制剂在37°C孵育12周，并通过ELSIA评价抗原性。图3是关于本发明抗原(Prtl、Prt2和Prt3)和铝化合物的配制过程概况的图示。图4a，4b，4c.将Balb/c小鼠用于评估由用几种不同佐剂之一配制的二价疫苗组合物引起的免疫反应(实施例4)。使用纯化的重组PhtD和PcpA蛋白制备制剂(如在实施例I中所述)。通过终点稀释ELISA测量总抗原-特异性IgG效价(图4a)并计算各组的几何平均效价(+/_ SD)。计算抗原-特异性IgGl (图4b)和IgG2效价(图4c)以评估IgGl/2a亚类。结果的概述描绘在该图中。图5.描绘通过终点稀释ELISA测量的总抗原_特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/_ SD)。在该研究中(实施例6)，将Balb/c小鼠用于评估由新鲜制备的和老化的有佐剂的二价制剂引起的免疫反应。将重组PhtD和PcpA与A100H或含有PO4 (2 mM)的A100H配制。该研究中使用的老化的制剂在第一次免疫前已储存大约6个月(约2°C_8°C)。该研究中使用的新鲜制备的制剂在第一次免疫的一周内制备。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(IM)免疫3次。图6描绘各免疫小鼠组的存活百分比(实施例6)。在该研究中，使用鼻内攻击模型评价重组PhtD和PcpA的二价制剂。将免疫的动物用致死剂量的肺炎链球菌菌株(MD、14453 或 941192)攻击。 图7.描绘通过定量ELISA测量的总抗原_特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/_ SD)。在该研究中(实施例6)，将Balb/c小鼠用于评估由新鲜制备的和老化的有佐剂的二价制剂引起的免疫反应。为了制备二价制剂，将重组PhtD和PcpA与用PO4 (2 mM)处理的A100H配制。老化的制剂在开始研究前已在2-8°C或37°C储存大约6-7个月。该研究中使用的新鲜制备的制剂在第一次免疫的一周内制备。将多组小鼠用合适的制剂以3周间隔肌内(頂)免疫3次。图8.描绘通过定量ELISA测量的总抗原_特异性IgG效价和各组的几何平均效价(+/_ SD)。在该研究中(实施例8)，将Balb/c小鼠用于评估由具有磷酸盐预处理的AlO(OH)和不同浓度的元素铝的多价制剂引起的免疫反应。图9.不同批次的A100H (A)、PTH⑶和AlPO4 (C)的X-射线衍射图。图10.不同批次的 PTH、A100H (Alhydrogel )和 AlPO4 (Adjuphos )的 TEM 分析。图11. pH对有佐剂的蛋白的物理稳定性的影响。将PcpA (A)、PhtD⑶和PlyDl(C)用不同pH值的氢氧化铝或磷酸铝辅佐(adjuvant)，并通过荧光迹线的导数分析获得Tm值。图12A 在 10% 山梨糖醇(■ )、10% 海藻糖(·)、10% 蔗糖(Λ )、TBS pH 9.0()和TBS pH 7· 4 (〇)存在下，通过RP-HPLC研究赋形剂对PcpA (在50°C储存3天)稳定性的影响。图12B在10%山梨糖醇、10%海藻糖、10%蔗糖、TBS pH 9. O和TBS pH 7. 4存在下，通过定量夹心ELISA研究赋形剂对PcpA (在50°C储存3天)抗原性的影响。将制剂在50°C储存3天。对于各制剂，在零时(白条)和三天储存后(黑条)评价抗原性。发明详述 本发明涉及制备包含抗原和含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物的稳定制剂的方法。该方法包括以足以稳定抗原的量加入铝化合物离子，例如磷酸盐、碳酸盐、羧酸盐、硫酸盐、二膦酸盐或氟化物的离子，或者这些离子的混合物。亦提供包含抗原和含有氢氧基的铝化合物的免疫原性组合物以及使用这些组合物用于预防和治疗特定疾病的方法。本文使用的术语“抗原”指，当导入哺乳动物中时，能够起始并介导相应的免疫体(抗体)形成的物质。抗原可拥有多个抗原决定簇，使得将抗原暴露于哺乳动物可产生多种具有不同特异性的相应抗体。抗原可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。抗原亦可包括较大的组分，例如细胞、细菌、病毒和其他微生物的全部或部分，以及这些组分的部分或组合。细菌和病毒(尤其是造成哺乳动物中疾病的那些)是可用于本发明中的抗原来源。细菌抗原包括来源于细胞外表面、来自细胞内部或来自鞭毛的蛋白或多糖。其他抗原可为由感染的细胞分泌或在细胞死亡或破碎时释放的那些。这样的抗原的实例包括白喉、破伤风和肉毒毒素(botulism toxin)。可结合到本发明实践中的特定抗原实例包括但不限于，白喉抗原、破伤风抗原、人乳头瘤病毒抗原、炭疽抗原、大肠杆菌(B· coif)抗原、狂犬病抗原和流感抗原、肺炎链球菌{Streptococcus pneumoniae)抗原、C型脑膜炎球菌抗原、A型脑膜炎球菌抗原、HIV抗原、疟疾抗原、单纯疱疹病毒抗原、麻疹抗原、麻疹-腮腺炎-风疹抗原、黄热抗原、水痘抗原、日本脑炎病毒抗原、登革热抗原、轮状病毒抗原、艰难梭菌{C. difficile)抗原、牙銀P卜啉单胞菌(P. gingivalis)抗原和衣原体抗原(例如，沙眼衣原体 if. iracAoffiaiis)、肺炎衣原体 ijl prwumormie)〉。本发明中使用的抗原可为抗原的天然存在的形式，如来源于其天然来源。由于毒性，可将抗原转化为保留引起针对天然抗原的免疫反应能力的较少毒性形式或片段。白喉类毒素和破伤风类毒素是一般由化学处理(例如，甲醛)产生的天然抗原的解毒形式的实例。其他用于消除抗原毒性的方法是本领域公知的，并例如包括蛋白抗原的酶促消化/片 段化、变性(通常通过热或化学处理)、缀合、化学修饰和遗传解毒。适合于本发明中使用的肺炎链球菌的解毒肺炎链球菌溶血素蛋白包括W02010/071986中描述的那些。用于本发明中使用的优选的解毒肺炎链球菌溶血素蛋白是PlyDl (SEQ ID NO: 9)。本发明中使用的抗原亦可为融合蛋白的形式。本文使用的融合多肽包含在N或C末端与任何其他多肽(下文称为肽尾)融合的本发明的多肽或多肽衍生物。获得这种融合多肽的简便方法是通过翻译框内融合的多核苷酸序列(即杂合基因)。将编码融合多肽的杂合基因插入到用于转化或转染宿主细胞的表达载体中。备选地，将编码多肽或多肽衍生物的多核苷酸序列插入到其中已经存在编码肽尾的多核苷酸的表达载体中。这样的载体及其使用说明市售可得，例如来自New England Biolabs的pMal_c2或pMal_p2系统(其中肽尾是麦芽糖结合蛋白)、Pharmacia的谷胱甘肽-S-转移酶系统或从Novagen获得的His-标签系统。这些和其他表达系统为进一步纯化本发明的多肽和衍生物提供便利的方法。融合多肽的一个有利的实例是以下的融合多肽其中本发明的多肽或同源物或片段与具有佐剂活性的多肽(例如霍乱毒素或大肠杆菌热不稳定毒素的亚基B)融合。另一有利的融合是以下融合多肽其中多肽、同源物或片段与强T-细胞表位或B-细胞表位融合。这样的表位可为本领域中已知的表位，或在本发明的另一多肽中基于计算机辅助分析可能的T-或B-细胞表位已被鉴定的表位。与本发明的该方面一致的是包含来自SEQ ID NO:1、2、5、7、9或10或者其同源物或片段的T-或B-细胞表位的融合多肽，其中该表位来源于所述多肽或同源物或片段的多种变体，各变体与另一变体不同在于多肽内其表位的位置和序列。为了实现融合，将本发明的多肽与具有至少一个T-或B-细胞表位的多肽的N或优选C末端融合。T-或B-细胞表位亦可被内部地插入本发明多肽的氨基酸序列内。本发明的抗原可为与抗原缀合的载体蛋白，例如细菌多糖。通过本领域中存在的任何已知方法可进行这些多糖的缀合，例如W02008/143709。如上文所述，术语“抗原”可包括但不限于蛋白、肽、多肽、核酸及其片段、变体和组合。本文交换地使用术语“多肽”、“肽”和“蛋白”来指氨基酸残基的聚合物。用于本发明中使用的抗原可使用本领域技术人员已知的多种方法产生。例如，可使用标准纯化技术直接自天然来源分离抗原。备选地，可使用已知技术重组产生抗原。重组产生的抗原和目标抗原的变体或片段可用于本发明。用于本文使用的抗原亦可通过化学聚合物合成(例如固相肽合成)合成。这样的方法是本领域技术人员已知的。包含多肽的抗原变体和片段亦被本发明所涵盖。“变体”指实质上类似的序列。本发明氨基酸或核苷酸序列的变体将通常与参比序列具有至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的序列同一性。在特定实施方案中，本发明抗原性多肽的变体将保留全长多肽的生物活性并因此是免疫原性的。用于产生变体序列的方法是本领域公知的，如同用于确定多肽或多核苷酸序列的百分比同一性的方法。术语“片段”指包含具体数量的连续氨基酸或核苷酸残基的多肽或多核苷酸部分。在特定实施方案中，本发明免疫原性多肽的片段可保留全长多肽的生物活性并因此是免疫原性的。多核苷酸的片段可编码保留蛋白生物活性并因此是免疫原性的蛋白片段。本发明多肽和多核苷酸的片段可为任何长度，前提是它们具有所需的特性(例如免疫原性)。用于产生多肽或多核苷酸片段的方法是本领域已知的。来自肺炎链球菌的本发明抗原可选自(但不限于)多组氨酸三联体家族(PhtX PhtA、B、D、E)、胆碱结合蛋白家族(CbpX) ,LytX家族、肺炎链球菌溶血素(Ply) >PspA,PsaA和 PcpA0PcpA多肽包含全长PcpA氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其片段及其变体。适合于本文所述的组合物中使用的PcpA多肽包括例如来自肺炎链球菌菌株B6的GenBank登录号CAB04758、来自肺炎链球菌菌株TIGR4的GenBank登录号NP_和来自肺炎链球菌菌株R6的GenBank登录号NP_359536的那些，和来自肺炎链球菌菌株14453的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PcpA的氨基酸序列是SEQ ID NO: 2。优选的PcpA多肽是 SEQ ID NO: 7。适合于本发明组合物的PhtX多肽包含全长PhtA、PhtB, PhtD或PhtE氨基酸序列(存在或不存在信号序列)、其免疫原性片段、其变体及其融合蛋白。适合于本文所述的组合物中使用的PhtD多肽包括例如尤其GenBank登录号AAK06760、YP816370和NP35851的那些。肺炎链球菌14453基因组中的全长PhtD的氨基酸序列是SEQ ID NO: I。优选的PhtD多肽(来源于肺炎链球菌14453基因组)是SEQ ID NO: 5。肺炎链球菌溶血素(Ply)是涉及肺炎球菌发病机制的多个步骤(包括抑制纤毛搏动和破坏上皮细胞之间的紧密连接)的溶细胞-活化毒素(Hirst等Clinical andExperimental Immunology (2004))。数种肺炎链球菌溶血素是已知的，且(解毒后)适合于本文所述的组合物中使用，包括例如尤其GenBank登录号Q04IN8、P0C2J9、Q7ZAK5和AB021381。在一个实施方案中，Ply具有SEQ ID NO: 10中所示的氨基酸序列。本发明的肺炎链球菌溶血素多肽优选是解毒的；即，与由肺炎链球菌产生并释放的成熟野生型肺炎链球菌溶血素蛋白相比，它们没有或具有降低的毒性。本发明的肺炎链球菌溶血素多肽可被例如化学(例如，使用甲醛处理)或遗传(例如，以突变形式重组产生)解毒。用于本发明中使用的解毒的肺炎链球菌溶血素的优选实例公开于PCT公布号WO 2010/071986。如该篇申请中所公开，解毒的肺炎链球菌溶血素可为在野生型序列的位置65、293和428上包含氨基酸取代的突变体肺炎链球菌溶血素蛋白。在优选的解毒的肺炎链球菌溶血素蛋白中，三个氨基酸取代包含T65 — C、G293 — C和C428 — A0优选的免疫原性并解毒的肺炎链球菌溶血素多肽是SEQ ID NO: 9。本文使用的“免疫原性”指，当给予受试者时，物质诱导免疫反应的能力(例如，细胞免疫原-特异性免疫反应和/或体液抗体反应)。本文使用的和本领域中定义的“抗原性”是抗体识别并结合蛋白(例如，抗原)的能力。本文使用的术语“佐剂”指连同抗原一起给予受试者以增强抗原免疫原性的物质。铝盐佐剂(或化合物)是本发明的实践中使用的佐剂之一。尤其使用氢氧化铝(例如，结晶偏氢氧化铝AlO(OH)和氢氧化铝Al (OH)3)。氢氧化铝是包含Al3+离子和氢氧基(-0H)的铝化合物。当产生的混合物是包含氢氧基的铝化合物时，亦可使用氢氧化铝与其他铝化合物(例如羟基磷酸盐或羟基硫酸盐)的混合物。具有铝盐佐剂的组合物不应该暴露于极端温度(即低于冰点(0°C )或极其热(例如，^ 70°O)是本领域公知的，因为这样的暴露可不利地影响吸附的抗原和佐剂两者的稳定性和免疫原性。 在特定实施方案中，铝佐剂是偏氢氧化铝(例如，Alhydrogel )。在本发明一个具体实施方案中，将含有氢氧基的铝化合物(例如，氢氧化铝佐剂)用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或氟化物或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理。通过以这种方式处理铝化合物，铝化合物中的许多氢氧基(-0H)被对其进行处理所用的相应离子置换(例如，磷酸基(P04))。该置换降低铝化合物的PZC和化合物微环境的pH。以足够的量加入磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或氟化物离子来降低微环境的PH至使抗原稳定的水平(即，抗原水解的速率降低)。必要的量将取决于许多因素，例如所涉及的抗原、抗原的等电点、抗原的浓度、抗原与佐剂之间的相互作用力、使用的辅佐方法和制剂中存在的任何另外抗原的量和性质。疫苗领域的本领域技术人员能够评估相关的因素并确定加入铝化合物中以增加抗原稳定性的磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐、氟化物的浓度(并因此，可制备相应的制剂和组合物)。例如，可进行滴定研究(即，加入增加浓度的磷酸盐等至铝化合物中)。适合使用的磷酸盐化合物包括与磷酸相关的任何化合物(例如，磷酸的无机盐和有机酯)。磷酸盐是包含磷酸根离子(PO/-)、磷酸氢根离子(HPO42-)或磷酸二氢根离子(H2PO4-)连同任何阳离子的无机化合物。磷酸酯是其中磷酸的氢被有机基团置换的有机化合物。可代替磷酸盐使用的化合物实例包括阴离子氨基酸(例如，谷氨酸、天冬氨酸)和磷脂。适合使用的羧酸盐化合物包括羧酸的任何有机酯、盐和阴离子(例如，苹果酸、乳酸、富马酸、戊二酸、EDTA和EGTA)。适合使用的硫阴离子包括包含硫酸基(SO4基)的任何化合物，例如硫酸的盐或酯(例如硫酸钠、硫酸铵、亚硫酸盐、偏亚硫酸氢盐、硫代硫酸盐)。适合使用的二膦酸盐化合物实例包括氯膦酸盐、帕米膦酸盐、替鲁膦酸盐和阿伦膦酸盐。在本发明一个优选实施方案中，将磷酸基以盐的形式加入氢氧化铝佐剂中。优选地，磷酸根离子由包含磷酸二钠一钠的缓冲溶液提供。在本发明的优选实践中，如本文所例示，将铝化合物(例如偏氢氧化铝)用磷酸盐处理(例如，通过如实施例中所述的方法)。在该方法中，将偏氢氧化铝的水性悬浮液(大约20 mg/mL)与磷酸缓冲溶液(例如，大约400 mmol/L)混合。优选的终磷酸基浓度为约2 mM-20mM。然后将混合物用缓冲剂(例如，Tris_HCl、具有盐水的Tris_HCl、HEPES)稀释以制备偏氢氧化铝与磷酸基(PO4)的悬浮液。优选地，缓冲剂是10 mM TriS-HCl和150 mM似(1，？!1为约7.4。然后将悬浮液在室温混合大约24小时。优选地，元素铝在终悬浮液中的浓度在约O. 28 mg/mL-1. 68 mg/mL的范围内。更优选地，元素铝的浓度为约O. 56 mg/mL。然后可将抗原(单独或组合地)吸附于处理的氢氧化铝。优选地，将大约O. 2-0. 4mg/mL的抗原与处理的偏氢氧化铝的悬浮液混合(例如，在室温或在2 - 8°C，在定轨混合器中，大约30分钟或大约12-15小时或大约24小时)。在一个实例中，然后可将PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素的解毒突变体的免疫原性多肽(单独或组合地)吸附于处理的氢氧化铝。优选地，将大约O. 2-0. 4mg/mL的各抗原与处理的氢氧化铝佐剂的悬浮液混合(例如，在室温或在2 - 8°C，在定轨混合器中，大约30分钟或大约12-15小时或大约24小时)。使用本领域已知的标准方法，可评估抗原吸附的百分比。例如，可移除并离心(例如，以10，OOOrpm)抗原/佐剂制备物的等分试样，以从佐剂悬液(上清液)中分离未吸附的 蛋白(沉淀)。可使用二辛可宁酸蛋白测定(BCA)或反相高效液相色谱(RP-HPLC)测定上清液中的蛋白浓度。如下计算吸附百分比%A=100-([PrSN] X 100/[PrCtr])，其中[PrSN]是上清液中蛋白的浓度，[PfCtr]是相应的无佐剂的对照中的浓度。在优选的实施方案中，％吸附范围为约70%-约100%。在更优选的实施方案中，％吸附为至少约70%。当在常规冷藏温度(例如约2V -约8°C )长期储存时，公开的制剂是稳定的。制剂显示很少或无颗粒团聚、抗原浓度无显著降低或抗原降解速率降低并保留显著水平的免疫原性和/或抗原性至少6个月或12个月，优选18个月。短语“抗原浓度无显著降低”旨在意指组合物保留至少50%、60%或70%的最初抗原浓度，更优选至少约80%、85%或90%的最初抗原浓度，更优选至少约91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上的初次配制时呈现的抗原浓度。抗原浓度可例如通过基于RP-HPLC、SDS-PAGE或ELISA的方法测量。稳定制剂或包含稳定制剂的免疫原性组合物维持实质程度的结构完整性(例如，维持实质量的最初抗原浓度等)。可通过测量例如呈现的抗原浓度(例如，通过RP-HPLC)或通过利用例如SDS-PAGE分析评估抗原降解，来评估稳定性。可将制剂中的抗原浓度与用相同但未处理(例如未用磷酸盐或碳酸盐离子处理)的铝化合物制备的制剂浓度比较。稳定性预测和/或比较工具包括例如Stability System (ScienTek Software, Inc.),其使用 Arrhenius Treatment预测储存温度(2°C -8°C )下的速率常数。用于测量抗原浓度和免疫原性的标准测定是本领域已知的并在实施例中描述。可通过例如用引起疾病的对应于制剂中存在的特定抗原的病原体或毒素攻击后评价免疫和未免疫的受试者的存活率，评估保护功效。相对于用相应的未处理的含有氢氧基的铝化合物辅佐，通过将这些多肽(单独或组合地)用处理的含有氢氧基的铝化合物辅佐，可改善例如肺炎链球菌蛋白(例如PcpA、PhtX (例如，PhtD)和肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素，PlyDl))的稳定性。当用氢氧化铝佐剂(AlO(OH))辅佐时，这些多肽的降解速率高(如在下文实施例中讨论)。发明人发现，相对于将这些多肽(例如，PcpA、PhtD)用相应的未处理的铝化合物辅佐，将它们用已用磷酸盐(或例如，碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物)预处理的含有氢氧基的铝化合物(例如，氢氧化铝)辅佐，可增加这些多肽的稳定性(例如，通过减少抗原降解)。因此，本文提供包含免疫原性PcpA多肽和/或免疫原性PhtX多肽(例如，PhtD)和/或肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素；PlyDl (SEQ ID NO:9))和已用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物制剂，其中相对于其中多肽吸附于未处理的含有氢氧基的铝化合物的组合物，该处理增加免疫原性多肽的稳定性。在优选的实施方案中，将铝化合物用磷酸盐处理。亦提供用这种处理的铝化合物为佐剂的多价组合物，其包含PcpA和PhtX (例如，PhtD)的免疫原性多肽或者包含肺炎链球菌溶血素(例如，解毒的肺炎链球菌溶血素；PlyDl)、PcpA和PhtX (例如，PhtD)多肽。免疫原性组合物优选为液体形式，但其可为冻干的(按照标准方法)或泡沫干燥的(如在 WO2OO9Ol26Ol, Antigen-Adjuvant Compositions and Methods (抗原 _ 佐剂组合物和方法)中所述)。根据本发明的一个实施方案，组合物为液体形式。可将免疫剂量配制成O. 5-1. O ml的体积。液体制剂可为适合给药的任何形式，包括例如溶液剂或混悬剂。 因此，组合物可包含可被缓冲的液体介质(例如盐水或水)。制剂(和组合物)的pH优选为约6. 4-约8. 4。更优选地，pH为约7. 4。制剂的例示性pH范围为5-10，(例如5-9、5-8、5. 5-9,6-7. 5或6. 5-7)。pH可通过使用缓冲剂维持。本发明免疫原性组合物的药物制剂亦可任选包含一种或多种本领域公知的赋形剂(例如稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、佐剂、洗涤剂和/或免疫刺激剂)。合适的赋形剂将与抗原和本领域已知的铝佐剂相容。稀释剂的实例包括粘合剂、崩解剂或分散剂，例如淀粉、纤维素衍生物、苯酚、聚乙二醇、丙二醇或甘油。药物制剂亦可包含一种或多种活性成分，例如抗微生物剂、抗炎剂和麻醉剂。洗涤剂的实例包括Tween (聚山梨醇酯)，例如Tween 80。优选地，在与一种或多种药学上可接受的赋形剂结合之前，纯化吸附于处理的铝化合物的抗原。本发明的一个实施方案的组合物可通过以下方法制备(i)将含有氢氧基的铝化合物用磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐、羧酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理，和(ii)将处理的铝化合物与至少一种抗原混合。在优选的实施方案中(如实施例中所述)，抗原单独或组合地包括(但不限于)，PcpA,PhtX (例如，PhtD)和解毒的肺炎链球菌溶血素(例如，PlyDl，SEQ ID NO: 9)。亦提供包含用根据本发明(例如，用磷酸盐)处理的含有氢氧基的铝化合物(例如氢氧化铝)(单独或组合地)辅佐的PcpA、PhtX (例如，PhtD)和/或解毒的肺炎链球菌溶血素以及包含一种或多种对组合物提供有益性质(例如，增加组合物的一种或多种蛋白的稳定性)的药学上可接受的赋形剂的制剂。在一个实例中，制剂包含磷酸盐处理的氢氧化铝(PTH)。本发明的组合物中可包含的化合物或赋形剂包括例如，缓冲剂(例如，甘氨酸、组氨酸)；张度剂(例如，甘露糖醇)；碳水化合物(例如糖或糖醇(例如山梨糖醇、海藻糖或蔗糖；1-30%))或碳水化合物聚合物(例如葡聚糖)；氨基酸，寡肽或多氨基酸(多达100 mM);多元醇(例如，甘油，且浓度多达20%);洗涤剂，脂质或表面活性剂(例如Tween20、Tween 80或pluronics,具有多达0. 5%的浓度);抗氧化剂；盐(例如氯化钠、氯化钾、氯化镁或醋酸镁，多达150 mM)或者它们的组合。可被使用的赋形剂的实例包括在表13和下文实施例中列出的那些。在各种实例中，赋形剂可为引起热稳定性增加(例如，至少0. 5(例如0. 5-5、1-4或2-3))的那些，如通过例如下文所述的测定(例如，SYPRO Orange的外部荧光)测量。例示性的赋形剂和缓冲剂包括山梨糖醇(例如，4-20%，5-10%)，(参见表13)。这些赋形剂可以表13中所列的浓度使用。备选地，该量可变化于例如O. 1-10倍，如本领域所理解。亦可包含本领域已知的其他碳水化合物、糖醇、表面活性剂和氨基酸。可单独或组合地使用赋形剂和缓冲剂。这种组合物的pH可为，例如5. 5-8. O或
6.5-7. 5，并可将组合物以液体或冻干形式储存在例如2-8°C。在组合物的变化中，可将山梨糖醇用蔗糖(例如，4-20%或5-10%)或海藻糖(例如，4-20%或5-10%)替换。组合物的其他变化亦是可能的并涉及使用本文所列的其他组分。基于上文，PcpA、PhtD和解毒的肺炎链球菌溶血素的例示性制剂(单独或组合地)包含10%山梨糖醇，pH 7. 4。在一个实施方案中，单价PlyDl (SEQ ID NO: 9)组合物每剂可包含，在约IOmMTris HCl和约150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范围为5-50 μ g的抗原、PTH佐剂(具有约O. 56 mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在优选的实例中，PlyDl范围为25-50 μ g/ 剂量。在另一个实施方案中，单价PhtD组合物每剂可包含，在约10mM Tris HCl和约150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范围为5_50 μ g的抗原、PTH佐剂(具有约O. 56 mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7. 5)。在优选的实例中，PlyD范围为25-50 μ g/剂量。在另一个实施方案中，单价PcpA组合物每剂可包含，在约10mM Tris HCl和约150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范围为5_50 μ g的抗原、PTH佐剂(具有约O. 56 mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7. 5)。在优选的实例中，PcpA范围为25-50 μ g/剂量。在另一个实施方案中，二价制剂组合物每剂可包含，在约10mM Tris HCl和约150mM NaClJ^JpH 7. 4中的范围各为5_50 μ g/剂量的两种蛋白(选自下述PhtD、PlyDl或PcpA)、PTH佐剂(具有约O. 56 mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约pH 7.5)。在特定实例中，两种抗原以1:1抗原/剂量比存在。在又一个实施方案中，三价制剂组合物每剂可包含，在约10mM Tris HCl和约150mM NaCl J^JpH 7. 4中的范围各为5_50 μ g/剂量的三种蛋白(PhtD、PlyDl、PcpA)、PTH佐剂(具有约O. 56 mg/mL元素铝，包含2mM磷酸钠缓冲液，在约PH 7.5)。在特定实例中，三种抗原各自的量(抗原/剂量)是以约1:1:1的比例。在另一实例中，组合物包含山梨糖醇或蔗糖，其关于稳定性已显示提供益处(参见下文)。这些组分的量可为例如5-15%、8-12%或10%山梨糖醇或蔗糖。下文描述其中这些组分以10%存在的具体实例。在一个优选的实施方案中，组合物包含10%山梨糖醇或10%蔗糖。本发明的免疫原性组合物在预防或治疗与特定抗原有关的疾病、病症、病况或症状的方法中有用。术语疾病、病症和病况本文将交换地使用。特别地，预防和治疗方法包括将治疗有效量的药物组合物给予受试者。在特定实施方案中，提供用于预防或治疗肺炎链球菌的方法。本文使用的预防疾病或病症旨在意指，将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受试者以便保护受试者免于发生与抗原相关的特定疾病或病症。治疗疾病或病症旨在将治疗有效量的本发明的药物组合物给予受疾病折磨或暴露于引起疾病的病原体的受试者，其中目的是为了治愈、愈合、缓和、缓解、改变、补救、减轻、改善或影响病况或疾病的症状。治疗有效量指，对给定的病况和给药方案提供治疗作用的量。治疗有效量可由普通技术医务人员基于患者特征(年龄、体重、性别、病况、并发症、其他疾病等)确定。治疗有效量将另外受组合物的给药途径影响。本发明的组合物可通过本领域已知的多种方法给予受试者。用于将组合物给予受试者的任何方法可在本发明的实践中使用。定义
术语“包含”涵盖“含有”以及“由…组成”(例如，组合物“包含”x可仅由X组成或可包含另外的某物，例如，X+Y)。术语“实质上”不排除“完全地”(例如“实质上不含”Y的组合物可完全不含Y)。与数值X有关的术语“约”意指，例如X土 10%。 术语“免疫原”是能够诱导获得性免疫反应的物质。术语“受试者”涵盖以下物种，例如哺乳动物(例如人或动物(例如小鼠、狗、猫、马、绵羊、猪等))、鸟类。除非特别说明，否则包括将两种或更多种组分混合的步骤的方法不要求任何具体的混合次序。因此组分可以任何次序混合。当有三种组分时，那么可将两种组分彼此混合，接着可将组合与第三种组分混合等。应认识到，可电离基可以本文所示的中性形式存在，或可以带电荷的形式存在，例如取决于pH。本公开内引用的所有参考文献通过弓I用以其整体结合到本文中。
实施例以上公开大体上描述了本发明。通过参考下述具体实施例可获得更完整的理解。描述这些实施例仅用于例证的目的而不旨在限制本发明的范围。形式的改变和等价替代预期为可表明或提出权宜的情况。虽然本文已使用特定的术语，但是这样的术语旨在描述性的意思而不是限制的目的。在本公开和这些实施例中使用但未明确描述的分子遗传学、蛋白质生物化学、免疫学和发酵技术方法，在科学文献中被充分报道并完全在本领域技术人员的能力内。实施例I
本实施例描述表面修饰的佐剂和具有该佐剂的制剂的制备。通过将氢氧化铝佐剂(Alhydrogel , Brenntag)用磷酸盐处理,制备表面修饰的佐剂。使用的氢氧化招佐剂是湿凝胶悬浮液，其根据制造商耐受再高压灭菌但如果冷冻则损坏。根据制造商，当PH维持在5-7时，佐剂具有正电荷并可吸附带负电的抗原(例如，当在中性pH下保持时具有酸性等电点的蛋白)。a)磷酸盐处理AlO (OH)-将AlO (OH)的水性悬浮液(大约20 mg/mL)与磷酸盐缓冲液的忙存液(大约400 mmol/L)混合,并用约pH 7. 4的10 mM Tris-HCL缓冲液(SigmaAldrich)稀释，以制备具有大约13 mg/mL A100H/200 mM PO4的磷酸盐处理的AlO (OH)悬浮液(本文称为“PTH” )。然后在室温将该悬浮液混合大约30分钟至24小时。b)重组制备PcpA蛋白和PhtD蛋白-简言之，将来自肺炎链球菌(血清型6菌株14453，在1997年6月27日作为ATCC 55987保藏)的两种重组来源的蛋白抗原PhtD(W02009/012588)和PcpA (WO 2008/022302)在大肠杆菌中重组表达，常规纯化方案后通过系列柱层析分离并纯化。更具体而言，使用AccuPrime高保真性聚合酶(Invitrogen)以及引物Spn0211和Spn0213，从肺炎链球菌14453基因组(血清型6菌株，在1997年6月27日作为ATCC55987保藏，小鼠-强毒荚膜血清型6B菌株)PCR扩增#切基因(但不包括其天然信号肽)。Spn0211和Spn0213分别将NocI和XhoI限制性位点导入到5’和3’端中(参见表I)。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并在琼脂糖凝胶上运行来确定大小。将PCT产物和pET28a(+)载体(Novagen)两者用AfcoI和通ol消化，并随后使用QIAEX凝胶提取试剂盒(Qiagen)从琼脂糖凝胶中纯化。使用T4 DNA连接酶(Invitrogen)将消化的载体与基因连接在一起。将连接混合物转化到化学感受态大肠杆菌DH5 α中，并通过接种在包含SOPg/ml卡那霉素的Luria琼脂上，挑选阳性克隆。将来自质粒克隆pBAC27的DNA分离，并通过测序确认为正确的。
然后通过电穿孔将质粒(pBAC27)导入到大肠杆菌BL21 (DE3)细胞中。在大约37°C培养转化的菌株并通过加入ImM IPTG来诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE分析，由正确大小(即，大约91. 9 kDa)的诱导蛋白条带的存在证实基因产物的表达


本公开涉及用于在免疫原性组合物中使用的佐剂，所述组合物包含至少一种抗原和已用磷酸盐、羧酸盐、碳酸盐、硫酸盐、二膦酸盐或者这些化合物中两种或更多种的混合物处理的含有氢氧基的铝化合物，亦提供使用这些组合物用于预防和治疗疾病的方法。