专利名称：具有低氯化钠浓度的免疫原性组合物的制作方法为了确保能维持免疫原性，蛋白质抗原的配制尤为重要。有时使用免疫刺激剂以改善针对任何给定抗原而产生的免疫应答。然而，在疫苗或免疫原性组合物中包含佐剂会增加成分制备的复杂性以及疫苗组合物的分布和配制的复杂性。配制者必须考虑每种佐剂成分以及抗原性成分的制备。具体地讲，应当考虑抗原性成分与佐剂成分的相容性。这尤其是在预期将冻干抗原或抗原制剂与佐剂制剂重配的情况下。在这种情况下，重要的是，佐剂制剂的缓冲液对于抗原或抗原制剂而言是合适的并且抗原的免疫原性或溶解度不会受到佐剂的影响。蛋白质抗原PRAME和NY-ES0-1 (分别描述于US5830753和US5804381)或其片段或衍生物都是对癌症治疗具有潜在益处的蛋白质抗原。发明概述本发明人已经发现某些抗原例如PRAME和NY-ES0-1对被称为“盐析”的现象特别敏感，该现象可定义为通过盐例如氯化钠的饱和而使蛋白质从其溶液中沉淀下来。本发明人已经发现，当氯化钠浓度低至150mM时，这些抗原就会聚集和沉淀。因此，在一个实施方案中，抗原或抗原制剂是当溶于含氯化钠(NaCl)浓度或离子强度大于5禮、101111、151111、201111、301111、401111、501111、601111、701111、801111、901111或1001111的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。本发明提供包含PRAME或NY-ES0-1的免疫原性组合物，其中所述组合物的氯化钠浓度小于IOOmM。附图简述图I. QS21溶解活性曲线。图2.在不同ASA制剂中，每种3D-MPL同类物(congener)的百分率。图3.用于冻干PRAME/CpG的冻干周期。图4.在ASA(150mM NaCl)和ASA(山梨醇)中重配的PRAME和NYES0-1之间的图示比较。图5.在实验I中经用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的体液应答。图6.在实验I中经用不同佐剂组合物配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的肿瘤保护作用。图7.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的体液应答。图8.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的CD4+应答。图9.在实验2中经用ASA(150mM NaCl)、ASA(山梨醇)或液体制剂ASA配制的PRAME/CpG免疫的小鼠的肿瘤保护作用。发明详述本发明提供包含本文所述的抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于lOOmM。具体地讲，本发明提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于约IOOmM,例如小于约 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物中的氯化钠浓度小于IOmM或小于等于5mM。在另一个具体的实施方案中，免疫原性组合物基本不含氯化钠。基本不含是指氯化钠浓度为或非常接近OmM。使用已知技术和试剂盒，技术人员可以容易地测试钠离子(Na+)和氯离子(CD的浓度。例如，可使用试剂盒例如来自Biosupply的钠的酶学测定试剂盒(Sodium EnzymaticAssay Kit)(目录号BQ011EAEL)来检测钠。可使用试剂盒例如来自Biosupply的氯的酶学测定试剂盒(Chloride Enzymatic Assay Kit)(目录号BQ006EAEL)来检测氯。在本发明的又一个实施方案中，提供包含本文所述的抗原的免疫原性组合物，其中离子强度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物中的离子强度小于IOmM或小于等于5mM。在又一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度为或非常接近OmM(即l、2、3mM)。可使用技术人员已知的技术来测定本发明的佐剂或免疫原性组合物的离子强度，例如使用电导仪。因此，在一个实施方案中，抗原或抗原制剂是当溶于含氯化钠(NaCl)浓度的溶液或其中溶液离子强度大于 5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM或IOOmM的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。本领域技术人员可以通过将抗原溶于和/或混合于该溶液中来确定抗原是否满足该定义。不满足该定义的抗原在溶解和/或混合后24小时将仍留在溶液中，即液体仍澄清而无沉淀。在溶于含IOOmM氯化钠浓度的溶液中之后沉淀、凝结或聚集的抗原，在24小时或更短时间之后，可通过溶液的浊度而观察到沉淀。另外，无法目测的聚集也可使用技术人员已知的方法来观察，所述方法包括但不限于SEC-HPLC。在一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于IOOmM,例如小于约 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10 或 5mM，并且其中所述抗原是PRAME (也称为DAGE)或其片段或衍生物。在本发明的又一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的离子强度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM，并且其中所述抗原是PRAME(也称为DAGE)或其片段或衍生物。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度小于IOmM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是PRAME或其片段或衍生物。抗原及其制备描述于美国专利号5，830，753。PRAME以下列登录号存在于注释的人类基因数据库(Annotated Human Gene Database, H-Inv DB) U65011. I、BC022008. I、AK129783. UBC014974. 2、CR608334. UAF025440. UCR591755. UBC039731. UCR623010. I、CR611321. UCR618501. U CR604772. U CR456549. I 和 CR620272. I。也可使用包含PRAME抗原的融合蛋白。可使用PRAME或其片段或衍生物，任选其形式是与异源融合伴侣融合的融合蛋白。具体地讲，可适当地使用PRAME抗原，其形式是与B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)的蛋白D或其部分或其衍生物的融合蛋白。可适当使用的蛋白D部分并不包含分泌序列或信号序列。适当地，融合伴侣蛋白包括在融合蛋白序列N端上或其中的氨基酸Met-Asp-Pro并且其中融合伴侣蛋白不包含蛋白D的分泌序列或信号序列。例如融合伴侣蛋白可包括蛋白D的大约或正好氨基酸17-127、18-127、19-127或20-127或者由它们组成。基于与蛋白D的融合蛋白的合适PRAME抗原描述于W02008/087102，所述文献通过引用全部结合到本文中。在一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中氯化钠浓度小于IOOmM,例如小于约 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM、10 或 5mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。 在本发明的又一个实施方案中，提供包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的离子强度小于 IOOmM,例如小于 90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM 或 15mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物的离子强度小于IOmM或小于等于5mM，并且其中所述抗原是NY-ES0-1或其片段或衍生物。NY-ES0-1可以是全长的或者可使用其片段或其衍生物，任选其形式是与异源融合伴侣的融合蛋白。NY-ES0-1描述于US5804381，所述文献通过引用全部结合到本文中。蛋白NY-ES0-1的长度大约为180个氨基酸并被描述成由3个区域组成(a)约氨基酸1_70的N-端区，(b)约氨基酸71-134的中央区，和(c)约氨基酸135-180的C端区。NY-ES0-1可用作融合蛋白，例如作为与LAGE-I或其片段的融合物，参见W02008/089074，所述文献通过引用全部结合到本文中。当使用NY-ES0-1片段时，这些适当地包括一个或多个MHCl类或2类表位，例如被称为 A31、DR1、DR2、DR4、DR7、DP4、B35、B51、Cw3、Cw6 和 A2 的那些(参见W02008/089074)。尽管并非同样对NaCl敏感，但是可用于本发明的又一种抗原是例如MAGE-3家族例如MAGE-A3的MAGE抗原。MAGE-3抗原已被描述为例如可适宜地与NY-ES0-1配制在一起一参见W02005/105139，所述文献通过引用全部结合到本文中。MAGE抗原例如MAGE-A3可按原样使用或者以衍生物(例如经化学修饰的衍生物)形式和/或以与异源融合伴侣融合的融合蛋白形式使用。例如MAGE抗原可含有还原型二硫桥，以构成游离巯基，其可用例如甲酰胺或羧甲基衍生，参见W099/40188，所述文献通过引用全部结合到本文中。具体地讲，MAGE抗原可适宜地以与B型流感嗜血杆菌的蛋白D或其部分或其衍生物融合的融合蛋白形式使用。例如蛋白D的大约1/3或蛋白D的N-端100-110氨基酸可用作融合伴侣，参见W099/40188。在又一实施方案中，抗原或抗原性组合物可以是本文所述抗原的任何衍生物。本文所用的术语“衍生物”是指相对于其天然存在形式而言被修饰的抗原。本发明的衍生物与天然抗原非常类似，保持了抗原性并保留了允许针对天然抗原而产生免疫应答的能力。给定衍生物是否产生这样的免疫应答，可通过合适免疫学测定例如ELISA或流式细胞术来检测。本文所用的术语“片段”是指肿瘤相关抗原的片段或抗原衍生物，其含有至少一个表位，例如CTL表位，通常是至少8个氨基酸的肽。认为长度为至少8个氨基酸，例如8-10个氨基酸或至多20、50、60、70、100、150或200个氨基酸的片段落入本发明范围之内，只要所述片段具有抗原性，也就是说该片段保留了主要表位(例如CTL表位)并且该片段能够诱导与天然存在的肿瘤相关抗原交叉反应的免疫应答。示例性片段的长度可以是8-10、10-20、20-50、50-60、60-70、70-100、100-150、150-200 个氨基酸残基(包括这些范围之内的任何数值)。免疫原性组合物可包含一种或多种抗原。众所周知的是，对于胃肠外给予，溶液应当是生理等渗的(即具有药学上可接受的重量摩尔渗透压浓度)，以避免细胞变形或裂解。“等渗剂”是生理上可耐受的并赋予制剂(例如本发明的免疫原性组合物)合适张力的化合物，以防跨越与制剂接触的细胞膜的水的净流动。通常，氯化钠(NaCl)用作等渗剂。本发明人已经证明某些抗原对“盐析”特别敏感，盐析是指溶液中的蛋白质在含高浓度盐的溶液中聚集或凝结的过程，是用于制备本文描述为等渗的本发明免疫原性组合物的替代方式。在一个具体的实施方案中，提供还包含非离子型等渗剂的免疫原性组合物。用于免疫原性组合物的合适的非离子型等渗剂应当适用于人类，并且与抗原性组合物中的抗原相容并且还与其它成分例如免疫刺激剂相容。在本发明的一个实施方案中，合适的非离子型等渗剂是多元醇、糖类(尤其是蔗糖、果糖、右旋糖或葡萄糖)或氨基酸例如甘氨酸。在一个实施方案中，多元醇是糖醇，尤其是C3-6糖醇。示例性的糖醇包括甘油、赤藓糖醇、苏糖醇、阿拉伯糖醇、本糖醇、核糖醇、山梨醇、甘露醇、卫矛醇和艾杜糖醇。在该实施方案的一个具体实例中，合适的非离子型等渗剂是山梨醇。在本发明的一个具体的实施方案中，本发明组合物中的非离子型等渗剂是蔗糖和/或山梨醇。在一个实施方案中，免疫原性组合物中多元醇的合适浓度介于约3至约15% (w/v)之间,尤其是介于约3至约10% (w/v)例如介于约3至约7% (w/v)之间，例如介于约4至约6% (w/v)之间。在该实施方案的一个具体实例中，多元醇是山梨醇。在本发明的一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含一种或多种免疫刺激剂。在一个实施方案中，该免疫刺激剂可以是皂苷。用于本发明的一种尤其合适的皂苷是QuiI A及其衍生物。QuiI A是分离自南美树QuiIIaja saponaria Molina的一种阜苷制剂，首次由 Dalsgaard等人描述于 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. fiir die gesamteVirusforschung,第 44 卷,Springer Verlag, Berlin，第 243-254 页)，其具有佐剂活性。Quil A的纯化片段已通过HPLC分离，其保留佐剂活性，而没有与Quil A(EP 0 362 278)例如QS7和QS21 (也称为QA7和QA21)相关的毒性。QS-21是源自Quillaja saponariaMolina的一种天然皂苷，其诱导⑶8+细胞毒T细胞(CTL)、Thl细胞和主要IgG2a抗体应答。QS21是本发明的优选皂苷。在本发明的合适形式中，免疫原性组合物中的阜苷佐剂是saponaria molinaquil A的衍生物，优选Quil A的免疫活性片段，例如QS-17或QS-21，适宜的是QS-21。在一个具体的实施方案中，在其反应原性较低的组合物中提供QS21，其中它被外源固醇例如胆固醇猝灭。存在着其中QS21被外源胆固醇猝灭的反应原性较低的组合物的若干种具体形式。在一个具体的实施方案中，皂苷/固醇呈脂质体结构的形式(WO96/33739，实施例I)。在该实施方案中，脂质体适宜含有天然脂质，例如磷脂酰胆碱，其在室温下适宜为非晶性的，例如卵黄磷脂酰胆碱、二油酰基磷脂酰胆碱(DOPC)或二月桂基磷脂酰胆碱。脂质体也可含有带电荷的脂质，其对于由饱和脂质构成的脂质体而言能增加脂质体-QS21结构的稳定性。在这些情况下，带电荷脂质的量适宜为1-20% w/w，优选5-10%。固醇与磷脂的比率为1-50% (mol/mol)，适宜地为20-25%。合适的固醇包括￠-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、麦角钙化醇和胆固醇。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物包含胆固醇作为固醇。这些固醇是本领域众所周知的，例如胆固醇公开于默克索引(Merck Index，第11版，第341页)，是存在于动物脂肪中的天然存在的固醇。当活性皂苷部分是QS21时，QS21 :固醇的比率通常为约I : 100至I : I (w/w)，适宜地介于I : 10至I : l(w/w)之间,优选I : 5至I : I (w/w) o适当过量的固醇存在，QS21 固醇的比率为至少I : 2 (w/w)。在一个实施方案中，QS21 固醇的比率为I : 5(w/W)。固醇适宜为胆固醇。在另一个实施方案中，免疫原性组合物包含免疫刺激剂，其是Toll-样受体4(TLR4)激动剂。“TLR激动剂”是指能通过TLR信号转导途径而引起信号转导反应的成分，或者是作为直接配体或者间接通过产生内源或外源配体(Sabroe等，JI 2003 pl630_5)。TLR4激动剂能通过TLR-4信号转导途径而引起信号转导反应。TLR4激动剂的合适实例是脂多糖，适宜的是脂质A的无毒衍生物，尤其是单磷酰脂质A或更尤其是3-脱酰单磷酰脂质 A(3D-MPL)。3D-MPL 由 GlaxoSmithKline Biologicals N. A.售卖，名称是 MPL，并且在全文中都称为MPL或3D-MPL。参见例如美国专利号4，436，727 ;4，877，611 ;4，866，034和4，912，094。3D-MPL主要是促进具有IFN-g(Thl)表型的⑶4+T细胞应答。可按照GB2220211A所公开的方法制备3D-MPL。从化学上说，它是具有3、4、5或6条酰化链的3-脱酰单磷酰脂质A的混合物。在本发明的组合物中，小颗粒3D-MPL可用于制备免疫原性组合物。小颗粒3D-MPL的粒径使其可通过0. 22 ii m滤器进行除菌过滤。这样的制剂描述于WO94/21292。优选地，粉状3D-MPL用于制备本发明的免疫原性组合物。可使用的其它TLR4激动剂是氨基葡糖苷磷酸烷基酯(AGP)，例如公开于W098/50399或美国专利号6，303, 347 (也公开了 AGP的制备工艺)的那些，适宜的是RC527或RC529或美国专利号6，764，840所公开的AGP的药学上可接受的盐。某些AGP是TLR4激动剂，而某些则是TLR4拮抗剂。认为这两类都可用作免疫刺激剂。其它合适的TLR-4激动剂描述于W02003/011223和WO 2003/099195,例如W02003/011223的第4_5页或W02003/099195的第3_4页上公开的化合物I、化合物II和化合物III，尤其是公开于W02003/011223的那些化合物ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057m、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680 和 ER804764。例如，一种合适的TLR-4激动剂是ER804057。在一个具体的实施方案中，免疫原性组合物同时包含皂苷和TLR4激动剂。在一个具体的实例中，免疫原性组合物包含QS21和3D-MPL。每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的TLR-4激动剂例如脂多糖例如3D-MPL的量介于1-100 u g之间。可使用的3D-MPL的水平为约50 u g，例如介于40-60 u g之间，适宜地为介于45-55 u g之间或介于49-51 u g之间或50 u g。在又一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含3D-MPL的水平为约25 u g，例如介于20-30 u g之间，适宜地为介于21-29 u g之间或介于22-28 u g之间或介于28-27 u g之间或介于24-26 y g之间或 25y g。每份人用剂量的免疫原性组合物中可以使用的皂苷例如QS21的量介于1-100 u g之间。可使用的QS21水平为约50 ii g，例如介于40-60 ii g之间，适宜地为介于45-55 ii g之间或介于49-51118之间或5011§。在又一个实施方案中，免疫原性组合物的人用剂量包含QS21的水平为约25ii g，例如介于20-30ii g之间，适宜地为介于21-29 y g之间或介于22-28 u g之间或介于28-27 u g之间或介于24-26 u g之间或25 u g。
当TLR4激动剂和皂苷同时存在于免疫原性组合物中时，TLR4激动剂与皂苷的重量比适宜地为介于I : 5-5 I之间，适宜地为I : I。例如，在每份人用剂量的免疫原性组合物中，当3D-MPL含量为50iig或25iig时，适宜地QS21的含量也可分别为50 y g或25 u go在一个实施方案中，免疫刺激剂是TLR9激动剂，例如W02008/142133所给出的那些。在一个具体的实例中，所述TLR9激动剂是免疫刺激性寡核苷酸，尤其是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸。这样的寡核苷酸是众所周知的并描述于例如WO 96/02555、WO99/33488和US 5，865，462。用于本文所述的免疫原性组合物的合适的TLR9激动剂是含有CpG的寡核苷酸，任选含有被至少3个、适宜地为至少6个或更多个核苷酸分隔的两个或更多二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸后接鸟嘌呤核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸间键(internucleotide bond)是二硫代磷酸键，或可能是硫代磷酸键，但磷酸二酯键和其它核苷酸间键也可使用，包括具有混合核苷酸间键的寡核苷酸。制备硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于US5，666，153、US5, 278，302和W095/26204。考虑了包含不同核苷酸间键的寡核苷酸，例如混合硫代磷酸磷酸二酯类。可使用能稳定寡核苷酸的其它核苷酸间键。适合本文所述的免疫原性组合物所包含的CpG寡核苷酸的实例具有以下序列。在一个实施方案中，这些序列含有经硫代磷酸酯修饰的核苷酸间键。OLIGO I (SEQ ID NO: I) TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826)OLIGO 2 (SEQ ID NO 2) TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758)OLIGO 3 (SEQ ID NO :3) ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACGOLIGO 4 (SEQ ID NO :4) TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006)OLIGO 5 (SEQ ID NO :5) TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668)可选择的CpG寡核苷酸可包含上述序列，其中它们可具有不连续缺失或添加。在一个实施方案中，免疫刺激剂是母育酚。母育酚是本领域众所周知的并描述于EP0382271。在一个具体的实施方案中，母育酚是a-生育酚或其衍生物例如a -生育酚琥珀酸酯(也称为琥珀酸维生素E)。本发明也提供本发明免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括以下步骤a.将本文所述的抗原冻干，任选与本文所述的免疫刺激性寡核苷酸一起；和b.将步骤a)的冻干组合物与含水佐剂组合物重配，其中所述含水佐剂组合物的NaCl 浓度或离子强度小于 100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或10mM。在一个具体的实施方案中，冻干抗原是当溶于含氯化钠浓度或离子强度大于10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM 或 IOOmM 的溶液之后沉淀、凝结或聚集的任何抗原。在又一实施方案中，冻干抗原选自PRAME或NY-ES0-1。在一个实施方案中，步骤b)的佐剂组合物(上述)包含如上所述的皂苷和/或TLR-4激动剂，例如QS21和/或3D-MPL。在又一个实施方案中，皂苷和/或TLR4激动剂在脂质体制剂中。在一个实施方案中，佐剂组合物包含在脂质体制剂中的TLR4激动剂和皂苷，以及本文所述的非离子型等渗剂。尤其是本发明的佐剂组合物可包含山梨醇。在本发明的又一个实施方案中，提供包含以下成分的药盒a.冻干抗原，任选与CpG —起冻干；和b.含水佐剂组合物，其中NaCl浓度或离子强度小于lOOmM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、15mM 或 10mM。在本发明的一个具体的实施方案中，本文所述药盒中的抗原包含PRAME或者NY-ES0-1和它们的片段和/或衍生物。在一个替代实施方案中，提供药盒，其中CpG不与抗原一起冻干。可将CpG与含水佐剂组合物混合，或者以含水或冻干形式装入单独小管中。用于本发明药盒的含水佐剂可以是本文所定义的任何佐剂组合物。在本发明的一个具体的实施方案中，含水佐剂组合物包含TLR4激动剂和/或呈脂质体形式的皂苷。在一个具体的实施方案中，TLR4激动剂是3D-MPL，皂苷是QS21。本文所用的含水佐剂可包含等渗剂，例如多元醇，例如山梨醇。本发明还提供用于癌症的免疫治疗性治疗的本文所述的免疫原性组合物。在该实施方案的具体实例中，本发明提供用于选自以下的一种或多种癌症的免疫治疗性治疗的本文所述的免疫原性组合物前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或黑素瘤。本发明还提供在有需要的个体中治疗或预防癌症的方法，所述方法包括给所述个体提供有效量的本文所述的免疫原性组合物的步骤。在该实施方案的具体实例中，本发明提供选自以下的癌症的治疗或预防方法前列腺癌、乳癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌或黑素瘤。根据以下非限制性实例将进一步描述本发明。
实施例实施例I :佐剂组合物ASA(山梨醇)的制备制备佐剂组合物，其中包含脂质体制剂中的3-脱酰MPL和QS21。其制备如下A.脂质体的制备方法将脂质(例如合成磷脂酰胆碱)、胆固醇和3-0-脱酰MPL的有机溶液的混合物真空干燥。再加入含水溶液(例如磷酸缓冲盐水[IOOmM NaCl、20mM磷酸盐pH 6. I])并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。用高剪切混合器将该悬浮液预均质，再进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90nm+/-10nm。然后将脂质体除菌过滤。
B. ASA 的配制步骤I :浓缩脂质体的稀释当稀释10倍时，将Na2/K磷酸盐缓冲液IOOmM pH6. I加入到注射用水中，在终制剂中达到IOmM磷酸盐缓冲液浓度。再加入30% (w/v)山梨醇的注射用水(WFI)溶液，在终制剂中达到4. 7%的浓度。将其在室温下搅拌15-45分钟。再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的DOPC、胆固醇和MPL制成)加入到该混合物中，在终制剂中达到IOOii g/ml MPL的浓度。然后将混合物在室温下搅拌15-45分钟。步骤2:加入QS21使用蠕动泵，以200ml/min蠕动泵的速率将QS21贮液(在室温下融化24小时或在4°C融化2天，200ml)加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在终制剂中达到100 y g/ml的浓度。将混合物搅拌15-45分钟。最终ASA 制剂中含有 IOOu g MPL/ml 和 100 U g QS21/ml。步骤3 :检查 pH 为 6. 1+/-0. 3步骤4:除菌过滤以400ml/min的恒定流速,在来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器上进行除菌过滤。步骤5 :在+2°C至+8°C贮存获得佐剂组合物，其中包含在在脂质体制剂中的3-0-脱酰MPL和QS21并含有山梨醇(称为ASA(山梨醇))，然后贮存在4°C。实施例2 :佐剂组合物ASA(150mM NaCl)的制备A.脂质体的制备方法将脂质(例如合成磷脂酰胆碱)、胆固醇和3-0-脱酰MPL的有机溶液的混合物真空干燥。再加入磷酸缓冲盐水并搅拌容器直到所有脂质呈悬浮状态。再用高剪切混合器将该悬浮液预均质，然后进行高压均质，直到脂质体大小降低到经DLS测定约为90nm+/-10nm。然后将脂质体在0. 22 y m PES膜上除菌过滤。B. ASA 的配制步骤I :浓缩脂质体的稀释当稀释10倍时，将Na2/K磷酸盐缓冲液IOOmM pH6. 45和NaCl I. 5M加入到注射用水中，在终制剂中分别达到IOmM磷酸和NaCl 150mM的浓度。将该混合物在室温下搅拌5分钟。再将浓缩脂质体(分别由40mg/ml、10mg/ml和2mg/ml的D0PC、胆固醇和MPL制成)加入到该混合物中，在终制剂中达到100 u g/ml MPL的浓度。然后将所得混合物在室温下搅拌5-15分钟。步骤2:加入QS21将QS21贮液(在室温下融化24小时或在4°C融化2天，200ml)加入到稀释的脂质体中，同时磁力搅拌，在终制剂中达到IOOiI g/ml的浓度。将混合物在室温下搅拌。步骤3 :检查 pH 为 6. 1+/-0. I.步骤4:除菌过滤在来自PALL Corporation的聚醚砜(PES)滤器上进行除菌过滤。
步骤5 :在+2°C至+8°C贮存最终ASA 组合物是每毫升 2mg D0PC、500 ii g 胆固醇、IOOii g3-0-脱酰 MPL、IOOii gQS21。实施例3. QS21裂解活件已知QS21能裂解红细胞(RBC)。测试实施例I中制备的ASA (山梨醇)佐剂组合物，以确保QS21的裂解活性以与包含150mM NaCl的等量佐剂组合物(ASA(150mM NaCl))中所观察到的同样方式被猝灭。通过溶血测定，使用鸡红细胞(chicken Red Blood cell, RBC)测定QS21的裂解活性。将RBC在550g于4°C离心。弃去上清液。将沉淀小心重悬于PBS缓冲液中达原先体积并且重复同样操作，直到上清液不再呈红色(通常3次)。如果不直接使用的话，将沉淀贮存于4°C最多3-4天(并在使用当天再次洗涤)，或者如果在同一天使用的话，将其在缓
冲液中稀释大约10倍。临时在ASA缓冲液(在测定ASA样品后在盐或在山梨醇缓冲液中)中制作QS21剂量范围曲线并且制备佐剂样品(含50 ii g或90 ii g等量QS21，即相当于500 ill或900 U IASA)。在标准品和样品中用适当缓冲液(含或不含山梨醇，随所测试样品的缓冲液而定)将终体积调节至900iU。因为其为乳白色，ASA干扰光密度(0D)。因此制备ASA “空白”并从ASA测试样品的OD值中减去“空白”0D。这些空白相当于与样品中测试的体积相同的ASA体积，但用缓冲液调节至lml。这些空白中不加RBC。然后将标准品和样品与RBC—起(将100 U I稀释RBC加入到900 u I标准品和样品中)在室温下(RT)温育30分钟。再将样品在900g离心5分钟。离心后在540nm处测定光密度。通过界限试验(limit test)进行裂解活性的测定。I.检测限(LOD)定义为导致OD的最低QS21浓度-比基础水平更高(0D> 0. I)-比缓冲液(“0u g” QS21)的OD高约3倍-在曲线的上升部分-对每次试验进行测定。2.如果佐剂样品的OD大于ODmi，则佐剂样品中QS21的裂解活性始终是正的。QS21曲线的实例


本发明提供了包含抗原的免疫原性组合物，其中所述组合物的氯化钠浓度或离子强度小于100mM，并且提供了它们在药物中的用途。