专利名称:单端孢菌烯结合物的制作方法 本发明总地涉及分子与结合于限定细胞群体作用物的结合，特别是涉及作用物如抗体与单端孢菌烯(trichothecene)的结合物以及使用这些结合物的方法。 使用抗体作为毒性剂的载体，有选择地杀伤肿瘤细胞是依赖于下述三个不同领域内的研究协作而进行的;(a)发展对于限定的细胞群体如肿瘤细胞具有特异性的多克隆或单克隆抗体(及其片段);(b)阐明毒性分子的化学性质和适合于它们与抗体相连接地条件;以及(c)生产和分离天然存在的毒性分子。Morgan和Foon(Monodonal Antibody Therapy of CancerPreclinical Models and Investigations;Basic and Clinical Tumor Immunology，Vol.2，Kluwer Academic Publishers，Hingham，MA)及Uhr(Journal of Immunology 133ⅰ-ⅶ，1984)已对单克隆抗体与药物、植物毒素和核糖体失活蛋白的结合物作过总结。随着对单克隆抗体研究的不断进行，人们已对有较高分子量的植物毒素分子产生了极大兴趣，因为有证据表明单克隆抗体有可能被用作为这些毒素的高特异性靶作用物。 总的来说，分子量较高的毒素具有特征性的A链和B链，其中B链负责结合(一般是通过外源凝集素与寡糖分子结合)，而A链则对延伸因子2(EF2)的非可逆抑制起催化作用，从而阻止蛋白质的合成。为此设想用一种特殊的抗体取代B链的非特殊性结合能力，有选择地将A链提供给肿瘤细胞。最近已发现了一类称为“核糖体失活蛋白”(RIPS)的化合物，表现为具有A链的相当物而没有任何相关联的B链。 然而，实践中却出现了许多不利于深入认识这一简单设想的障碍。首先，显然很难于通过简单地亲合层析所达到的纯度基础上建立自A链除去B链的系统。RIPS和克隆的毒素则是解决该问题的实际途径。第二，网状皮内系统将由循环血中除去某些大分子，特别是那些已改变了的大分子如已与毒素结合的抗体。第三，显然在蛋白质植物毒素上天然存在着糖类的受体。这些亦可促使非特异性摄取，进而产生非特异毒性。最后，一个愈发明确的问题是B链不仅可用细胞结合，而且似乎利于A链向细胞内尤其是向胞浆内的转位，从而影响其细胞毒性。 鉴于这些障碍，故该 R2是H、OH、或OCOCH2CH(CH3)2; 且 R′是选自于下列所示的基团
表4
R′ 有代表性的大环
单端孢菌烯
疣孢菌素A
疣孢菌素B
疣孢菌素J
Satratoxin C)
2-脱氢疣孢菌素A
杆孢霉素A
杆孢霉素D
杆孢霉素E
(Satratoxin D)
杆孢霉素H

Satratoxin F
Satratoxin G
Satratoxin H
轮单孢菌素
Mytoxin A
Mytoxin C
Mytoxin B
如R2＝H Myrotoxin A
如R2＝OAc Myrotoxin B
如R2＝H Myrotoxin C
如R2＝OAc Myrotoxin
D 杆孢霉毒素A
杆孢霉毒素B


除了上面所示的普通结构外，还从较高等植物Baccharis megapotamica中分离出了许多“酒神菌素”，Jarvin等人已在文献中作了描述(Chemistry of Alleopathy，ACS Sym-posium Series No.268;ed.A.C.Thompson，1984，pp.149-159)。
倍半萜烯环在结合核糖体和抑制蛋白质合成方面可与A链植物毒素相似的方式发挥功能。大环结构则以一种未知的方式提高细胞结合及内化作用。各类中有些分子虽然可在无细胞体系中作翻译的强有力的抑制物，但对于真核细胞却只有很小的细胞毒性(抑制剂量〔ID50〕＝10μg/ml)。
核糖体结合能力的变异并非与细胞毒性密切相关，这一点有力地揭示了向细胞中核糖体的特异释放或细胞内失活化作用可能对这些药物抗真核细胞的活性起着重要作用(Bamburg，J.R.，Biological and Biochemical Actions of Trichothecene Mycotoxins，Prog.Mol.Subcell.Biol.841-110，1983;Mclaughlin，C.S.，Vaughan，M.H.，Cambell，I.M.，Wei，C.M.，Stafford，M.E.，和Hansen，B.S.，Inhibition of Protein Synthesis by Tri-chothecenes，Mycotoxins in Human and Animal Health，Pathotox Publishers，Park Forest South，IL，pp.263-273，1977;Doyle，T.W.，和Brodner，W.T.，Trichothecenes，AnticancerAgeuts Based on Natural Product Models〔Cassidy和Bouros编〕Academic press，Inc.，New York，Ny，pp.43-72，1980)例如，疣孢菌醇可能对细胞膜的结合能力差，或在细胞内失活，而不能通过与单克隆抗体结合得以克服这些不足。已通过细胞内酸催化作用(如同溶酶体中可能出现的一样)，使若干单端孢菌烯转化为生物学上无活性分子(脱辅基单端孢菌烯)的转化率进行了某些研究。大环单端孢菌烯和某些单纯单端孢菌烯(如蛇形菌素和T-2毒素)失活相当慢，而细胞毒性较小的分子(如疣孢菌醇)则失活较快。可见细胞毒性和重排成脱辅基单端孢菌烯的速率之间存在着相反地线性关系。
已在病人的Ⅰ期(Murphy，W.K.，Burgess，M.A.，Valdivieso M.，Livingston，R.B.，Bodey，G.P.，和Freireich，E.J.phase I Evaluation of Anguidine，Cancer Treat.Repts.621497，1978)和Ⅱ期(Adler，S.S.，Lowenbraun，S.，Birch，B.，Jarrell，R.，和Garrerd，J.，AnguidineA Brood Phase Ⅱ Study of the Sou-theastern Cancer Study Group，Cancer Treat，Repts.68423，1984)临床治疗试验中对蛇形菌素-一种单纯单端孢菌烯进行了应用研究。总的肿瘤反应速率很低，而且在Ⅱ期试验中存在着显著的血液学毒性。在Ⅰ期试验中，毒性包括恶心、呕吐、低血压、中枢神经系统综合证、腹泻、畏寒和发热、泛发性炎性红斑、胃炎、呼吸短促以及致命性毒性与存在肝转移或使用较高剂量所致肝功能损害之间相关的中度骨髓抑制。
单端孢菌烯分子与可识别抗原的多克隆和单克隆抗体或其片段(与正常组织比较，这些抗原在肿瘤细胞上表达时是扩增的)的联接可分为两种不同的“战略”;(1)使弱胞毒性单端孢菌烯与抗体或其片段连接，发挥细胞毒性作用;(2)将细胞毒性单端孢菌烯与抗体或其片段连接，选择性地作用于肿瘤细胞，而对正常组织则很少发挥其细胞毒性。
在本发明的范围内，单克隆抗体是通过免疫啮齿动物或其它动物、和/或自携带恶性肿瘤病人体内收获人体淋巴细胞，使用标准杂交瘤技术使这些细胞的抗体分泌永久化(Geffer等，Somatic Cell Genet.3231，1977)而制得的。另外，可在用肿瘤细胞或其它特定瘤相关抗原免疫后采集免疫动物的血清，或者自具有或已接触了肿瘤或肿瘤相关抗原的人体内采集血清，并使用标准纯化技术使之纯化，以制得多克隆抗血清。使用标准放射免疫法或酶联免疫吸附试验(ELISA)，筛选对适当靶细胞(抗原)有特异性的抗体。可用正常人组织选择具有适当肿瘤特异性的抗体以完成筛选工作。
纯化预期的抗体之后，通过一联接分子将抗体连接到单端孢菌烯衍生物分子上。用碳化二亚胺试剂处理单端孢菌烯半琥珀酸酯的羧酸，并连接到抗体的氨基上。或者制备单端孢菌烯半琥珀酸酯的N-羟基琥珀酸亚胺酯，用以使单端孢菌烯衍生物同抗体的氨基连接。这两种方法都是在单端孢菌烯与抗体分子间形成酰胺键。具有游离羟基的单端孢菌烯通过与碳化二亚胺连接分子反应而直接与抗体分子相联。硫酯键亦可用作抗体与单端孢菌烯之间的稳定键。此外，单端孢菌烯分子还可连接到聚-L-赖氨酸(分子量300～150000)上。然后通过酰胺键使聚-L-赖氨酸/单端孢菌烯复合物与抗体相联。再者，如期望使用较不稳定的键时，则可通过二硫键或硫酯键使单端孢菌烯连接到单克隆抗体(MAb)分子上。
使用TSK3000柱，通过快速蛋白液相层析(FPLC)凝胶过滤法，很容易地将免疫结合物同未经处理的单端孢菌烯分离。或者使用透析法除去未经处理的单端孢菌烯。
结合物的分子量不会比游离抗体的分子量大太多。因此，将免疫结合物同游离抗体分离，需要使用羟基磷灰石或疏水性柱层析。
用等电聚焦(IEF)和SDS-PAGE法分析结合物。IEF是检测抗体置换程度和产生的抗体带电程度的一种手段。SDS-PAGE则是基于分子量大小分离蛋白质，估计结合过程中所形成的共价聚集物。通过流动细胞测定法定量比较结合物与未结合抗体的免疫反应活性。将免疫结合物与抗原阳性细胞一同保温、洗涤、然后再将细胞与荧光素异硫氰酸酯连接的羊抗鼠抗体一同保温。可在流动细胞测定器上读出细胞结合的荧光并计算出平均荧光指数。使用标准的未结合抗体制品作为竞争物，与结合物比较其抑制作用。亦可使用抗原阴性细胞作类似分析，用以证明结合物对抗原阴性细胞之特异性的保留。
用两种方法估测免疫结合物的细胞毒性。一种是使用了3-(4，5-二甲基噻唑-Z-Z基)-2，5-二苯基四唑溴化物作底物进行比色分析。这种物质可被活细胞分解而产生一种深兰色甲
产物。这一方法需要有活性线粒体参予。底物(MTT)被溶解且在ELISA记录仪上读出数据。该分析法与标准3H-胸苷掺入法有着极好的关联，并可避免使用放射活性物质。保留3H-胸苷是为了进一步证实上述实验的主要结果。
通过将结合物与抗原阳性及抗原阴性细胞系一同保温以完成效力和选择性分析。将各种不同浓度的结合物加入细胞内，经持续和短时间接触后估算细胞存活率。结合物与细胞持续接触保温三天和短时间接触保温2小时。三天后估算细胞存活率。
还试验了结合物抑制肽基转移酶的能力。该分析法是基于与放射标记的木霉素竞争60S核糖体上结合位点而设计的。也试验了结合物抑制蛋白质合成的能力，包括使用天然的mRNA检测它们对合成蛋白质总的影响，以及使用polyU测定它们对链延伸的作用。
下列实施例旨在进一步阐明本发明，而不是以任何方式限定本发明。
实施例1
疣孢菌醇(Verrucarol)
疣孢菌醇是一种单纯的、细胞毒性差的单端孢菌烯。借助碳化二亚胺联接分子使疣孢菌醇与抗黑素瘤单克隆抗体9.2.27连接。更具体地说，即抗体(10mg)在2ml0.1M NaCl中与5mg单端孢菌烯(在0.1mlDMSO和1ml0.1M磷酸钠缓冲液〔pH6.0〕中)和30mg1-乙基-3，3-二甲基氨基-丙基-碳化二亚胺混合。将该混合物于室温下搅拌24小时。反应后将溶液对0.1M磷酸钠(pH7.0)透析。
单端孢菌烯分子的伯或仲羟基基团与碳化二亚胺反应生成单端孢菌烯衍生物。该单端孢菌烯衍生物分子再与抗体上的赖氨酸反应生成结合物。结合物对抗原阳性和抗原阴性黑素瘤细胞滴定结果表明抑制剂量(ID50)为10-8M。当用同一分析法作比较试验时，相对于单独用疣孢菌素而言，其ID50为10-5M或更大些。
实施例Ⅱ
疣孢菌素A(Verrucaria A)
依照实施例1中所述的同样方法，将疣孢菌素A或其半琥珀酸酯与单克隆抗体9.2.27连接。疣孢菌素A半琥珀酸酯按下法制备把0.375mM单端孢菌烯(在1ml无水CHCl3中)的溶液与0.45mM琥珀酸酐(1.2当量)及催化量的二甲基氨基吡啶混合。加热混合物，回流过液，用CH2Cl2稀释至30ml，并用10ml5%HCl洗涤。用Na2SO4干燥有机层、浓缩、并将所得胶状物作制备性薄层层析(TLC)(硅胶，2mm;乙酸乙酯∶己烷＝1∶1)。在CH2Cl2/己烷/乙醚中重结晶后，回收到产率为80%的单端孢菌烯半琥珀酸酯。增加结合物的滴定度，与抗原阳性和抗原阴性黑素瘤细胞一同保温，之后按本文中所述的方法试验其活性强度及选择性。其抗抗原阳性细胞的ID50为10-7M或更佳，而且不表现有抗抗原阴性细胞的毒性作用。疣孢菌素A本身的ID50为2.5×10-11M。
实施例Ⅲ
通过顺式-乌头酰键联接
使用标准操作方法(如上述制备半琥珀酸酯的方法)将疣孢菌醇与顺乌头酸酐共价连接。或者使疣孢菌醇的N-羟基琥珀酰亚氨酸酯与二胺反应。疣孢菌素A(VA)N-羟基琥珀酸亚氨酸酯的制备方法如下将溶解于2ml四氢呋喃中的0.068mMVA半琥珀酸酯的溶液加入各为0.36mM的N-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳化二亚胺中。于室温下将混合物放置6小时，过滤除去N-N-二环己基脲并浓缩之。通过制薄层层析(用EtAc/己烷溶剂系统)在硅胶板(2mm)上分离N-羟基琥珀酰亚氨酸酯。用二乙醚重结晶完成纯化(得率约70%)。之后使单端孢菌烯酯衍生物通过游离氨基基团与顺乌头酸酐共价连接。再按实施例1所述的方法，使用碳化二亚胺联接分子使单端孢菌烯衍生物的顺乌头基部分与抗体共价结合。
实施例Ⅳ
蛇形菌素的糖基化
蛇形菌素是一种水溶性差的单纯单端孢菌烯，但蛇形菌素经糖基化后可改善溶解度。按照W.R.Boush等人的方法(J.Am.Chem.Soc.1073354-3355，1985)完成蛇形菌素的糖基化。简单地说，将蛇形菌素(12μm)与尿苷5′-二磷酸葡糖醛酸(12μm)、B-萘并黄酮诱导的雄性大鼠的肝细胞微粒体(0.6mg蛋白/ml)、MgCl2(2.5mM)及K2HPO4(10mM，pH7.7)于37℃保温3.5小时。用这种方法所形成的蛇形菌素葡糖苷酸，产率约为60%。之后依照实施例Ⅱ的方法，将糖基化的蛇形菌素与抗体连接，形成蛇形菌素的抗体-蛇形菌素半琥珀酸酯衍生物。
实施例Ⅴ
降低中毒作用
向温血动物静脉内注射疣孢菌素A-抗体结合物，抑制抗原阳性细胞。受体动物的代谢过程可引起结合物单端孢菌烯部分过早的释放，从而导致对非抗原阳性细胞的毒性。
通过服用抗单端孢菌烯抗体，可以降低因未结合的单端孢菌烯释放而引起的中毒作用。简单地说，或者在注射疣孢菌素A-抗体结合物的某预定时间，或依据检测受体动物的毒性综合征，将抗体注入受体动物体内即能够结合疣孢菌素并阻止疣孢菌素的毒性。
另外，亦可在注射结合物后某预定时间或基于检测毒性，使中毒受体动物的血浆通过一含有固相抗疣孢菌素A抗体的亲合层析柱。该亲合柱结合疣孢菌素A，从而降低血浆中游离疣孢菌素A的水平。之后将此血浆重新输入受体动物体内。
实施例Ⅵ
降低疣孢菌素A的胃肠道内水平
给受体注射疣孢菌素A-抗体结合物，可致使游离疣孢菌素A释入受体的胃肠道内。通过降低胃肠道内游离单端孢菌烯的水平，可以降低释放的疣孢菌素A的毒性(如Buck和Bratich〔Vet.Med.8173-77，1986所述及的)。这一目的可通过给中毒受体口服活性碳来达到。活性碳结合游离疣孢菌素A，从而阻止其由胃肠道吸收。再给受体口服泻药，以利于活性碳-单端孢菌烯复合物通过肠道排出。
由上述实施例可以理解到，虽然为进一步阐明本文目的述及了本发明的若干特定实施方案，但在不背离本发明的实质和范围的前题下，可作出多种不同的变动。为此，本发明不受除待批
权利要求
1、生产单端孢菌烯和能结合于特定细胞群体之作用物所成结合物的方法，其包括
以单端孢菌烯与联接分子反应，生成单端孢菌烯衍生物；并且
使单端孢菌烯衍生物与结合于特定细胞群体的作用物结合，从而形成结合物。
2、根据权利要求
1的方法，进一步包括结合步骤之后分离单端孢菌烯衍生物。
3、根据权利要求
1的方法，进一步包括结合步骤之后纯化结合物。
4、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯具有一个中心倍半萜烯样结构。
5、根据权利要求
4的方法，其中单端孢菌烯具有一附加的大环。
6、根据权利要求
4的方法，其中单端孢菌烯选自木霉菌醇、疣孢菌醇、木霉菌素、蛇形菌素和T-2毒素者。
7、根据权利要求
5的方法，其中单端孢菌烯选自于疣孢菌素A，疣孢菌素B、疣孢菌素J、2′-脱氢疣孢菌素A、杆孢霉素A、杆孢霉素D、杆孢霉素E、杆胞霉素H、Satratoxin F、Satra-toxin G、Satratoxin H、轮单孢菌素、酒神菌素、Myro-toxin A、Myrotoxin B、Myrotoxin C、Myrotoxin D、Mytoxin A、Mytoxin B、Mytoxin C、杆孢霉毒素A、杆孢霉毒素B、杆孢霉毒素C和杆孢霉毒素D者。
8、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯是疣孢菌醇。
9、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯是疣孢菌素A。
10、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯含有下列结构式
其中R1是H、OH或
;
R2是H、OH、
R3是H、OH、或
，和
R4是H、OH、＝O、
。
11、根据权利要求
10的方法，其中R4包括一环氧化物基团。
12、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯含有下列结构
其中R1是OH，或
R2是H，OH，
或OCOCH2CH(CH3)2;且R′是
13、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯含有下列结构
其中R1是H，
;
R2是H，OH，
，或OCOCH2CH(CH3)2;且R′是
14、根据权利要求
1的方法，其中作用物包括单克隆抗体。
15、根据权利要求
14的方法，其中单克隆抗体是人或其它温血动物来源的。
16、根据权利要求
1的方法，其中作用物包括多克隆抗体。
17、根据权利要求
1的方法，其中特定的细胞群体包括肿瘤细胞。
18、根据权利要求
1的方法，其中特定的细胞群体包括携带肿瘤相关抗原的细胞。
19、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯衍生物是单端孢烯/碳化二亚胺分子。
20、根据权利要求
19的方法，其进一步包括在反应步骤之前使单端孢菌烯糖基化。
21、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯衍生物是单端孢菌烯/半琥珀酸酯分子。
22、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯衍生物是顺乌头酰-单端孢菌烯。
23、根据权利要求
1的方法，其中单端孢菌烯衍生物是单端孢菌烯/N-羟基琥珀酰亚氨酸酯分子。
24、生产单端孢菌烯结合物改善其溶解性的方法，包括
使单端孢菌烯糖基化;
糖基化的单端孢菌烯与一联接分子反应，生成单端孢菌烯衍生物;并
使单端孢菌烯衍生物与结合于特定细胞群体的作用物相结合，从而生成结合物。
25、根据权利要求
24的方法，其进一步包括在反应步骤之后分离单端孢菌烯衍生物。
26、根据权利要求
24的方法，其进一步包括在反应步骤后纯化结合物。
27、根据权利要求
24的方法，其中单端孢菌烯是蛇形毒素。
28、根据权利要求
24的方法，其中单端孢菌烯衍生物是单端孢菌烯/碳化二亚胺分子。

本发明公开了一种生产单端孢菌烯与可结合于 特定细胞群体作用物的结合物的方法。特别是单端 孢菌烯与多克隆或单克隆抗体或其片段所成的结合 物，其中所说的抗体或其片段可识别那些只存在于 肿瘤细胞上，或与正常组织比较在其于肿瘤细胞上表 达时得以扩增了的抗原。单端孢菌烯衍生物分子结 合于作用物上。优选的单端孢菌烯衍生物分子有单 端孢菌烯/碳化二亚胺分子，顺-乌头酰基-单端 孢菌烯以及单端孢菌烯/N-羟基琥珀酰亚氨酸酯 分子。