专利名称:免疫球蛋白结合物的制作方法免疫球蛋白是糖蛋白,即,它们是带有连在不同部位上的寡糖的蛋白质。这些寡糖上的邻二醇可以被高碘酸盐氧化产生二醛。产生的醛基可以和各种胺和肼反应,形成希夫碱和腙。例如,Willan等人在《欧洲生化学会联合会快报》(FEBS letters)80 133(1977)中氧化一个在兔的IgG的CH2区中与第297位天门冬酰胺残基相连的寡糖。(此位置采用人体IgGl骨髓瘤蛋白Eu的编号系统)这个氧化了的物质,在纯化后,与4-氨基-2,2,6,6-四甲基-哌啶-1-烃氧基自由基反应,产生的亚胺(氨基和糖上的醛基反应)用NaBH3CN还原产生一个自旋标记的蛋白质。Timofeev等人在《欧洲生化学会联合会快报》89 191(1978)中也用氧化了的糖蛋白单克隆抗体来制备自旋标记的物质。Murayama等人在《免疫学化学》(Immunochemistry)15 523(1978)将高碘酸盐氧化了的一个免疫球蛋白(IgG)中的寡糖与含氨基的化合物通过形成希夫碱进行标记。天门冬氨酸和辣根过氧化物酶是所用的“胺”。天门冬氨酸-希夫碱通过逆流免疫电泳可用于检测人体IgG的抗原性。O′Shannessy等人在《免疫学快报》(Immunology letters)8 273(1984)中将生物素酰肼化物和氧化了的免疫球蛋白的醛基偶连,并建议采用将荧光染料偶连到单克隆抗体的技术。Chua等人在《生物化学和生物物理学报》(Biochimica and Biophysica Acta)800 291(1984)中氧化了IgM的重链的稳定区的糖基(此区有较高的糖含量)产生醛。这些醛基和连在脂质体膜上的酰肼基团反应。该单克隆IgM抗体对于带有1-二甲氨基萘-5-磺酰基半抗原的蛋白质具有特异性。Rothfus等人在《生物化学杂志》(J.B.C.)238 1402(1963)中用高碘酸盐氧化然后用硼氢化物还原的方法来测定人体γ-球蛋白糖肽的糖成分的一致性。Blair等人在《免疫学方法杂志》(J.Immun.Meth.)59 129(1983),和Ghose,Blair,Kulkarni在《酶学方法》(Methods in Enzymology)93 280(1983)中综述了将细胞毒试剂连接到免疫球蛋白上的方法。Blair等人在130页,揭示了将细胞毒试剂连接到一个Ig上的寡糖上的可能性。但未提及氧化成醛并将细胞毒试剂与醛偶连。Ghose等人提到了将兔子的连有寡糖的抗牛血清白蛋白IgG用高碘酸盐氧化成醛基并将这些基团和乙二胺反应,然后硼氢物还原该希夫碱形成新的连在糖蛋白上寡糖部分上的氨乙基一级胺。《欧洲专利申请公报》(EPO Application Publication)88695广泛地叙述了一些诸如上述文章所描述的方法,即从糖部分氧化衍生出来的醛基与一种化合物的肼、酰肼或氨基这些连接基团反应来形成结合物。这份申请很显然是针对连接基的,这些连接基可以和醛-抗体结合,并且连接基本身连到一种不溶性的支持剂或次级化合物上。也对抗体结合物申请专利权,这些抗体结合物包括任一通过共价的腙、亚胺或烯胺键结合在抗体糖基上的化合物。更专门的权利要求1.制备腙结合物的方法,它包括使分子式I的长春花生物碱酰,肼化物与氧化了的糖蛋白的醛基反应,其中,R2是H,CH3或CHO;当R4和R5单独考虑时,R5是H,R3和R4之一是乙基,而另一个是H或OH;当R4和R5和与它们相连的碳一起考虑时,它们形成一个环氧乙烷环,此时R3为乙基;R是-NHNH2,-O(C1-3烷基),-NH2,-NH(C1-3烷基),-NH-CH2CH2-Y,1-吡咯烷基或1-哌啶基,其中,n值为2-4,Y是Cl,-OCH3或-SCH3;R1是H,(C1-3烷基)-CO,氯代(C1-3烷基)-CO或R6,其中R6是-COXCONHNH2,这里X是C1-4的直链亚烷基,C2-8的支链亚烷基,C2-4的亚链烯基,C3-4的亚链炔基,C3-6的亚环烷基,亚苯基,羟基取代的C1-4亚烷基,或一个直接的键,只是R1是R6时,R不能是-NHNH2,而当R是-NHNH2时,R1不能是R6。2.按照权利要求
1的方法,其中长春花酰肼是4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼,4-去乙酰基-长春碱-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-丁二酰亚胺-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰胺-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春碱-4-半戊二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春新碱-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-4′-表去氧-长春碱-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰肼-N2-戊二酰亚胺-4-半丁二酸酯酰肼,4-去乙酰基-长春新碱-3-羧酰肼,或4-去乙酰基-4′-表去氧-长春碱-3-羧酰肼。
3.按照权利要求
1或2的结合物制备方法,其中R1是H。
4.按照权利要求
3的结合物制备方法,其中糖蛋白部分为免疫球蛋白或其片段。
5.按照权利要求
4的结合物制备方法,其中免疫球蛋白为抗体或抗体片段。
6.按照权利要求
5的结合物制备方法,其中抗体是单克隆抗体或其片段。
7.按照权利要求
1到6中之一的结合物制备方法,其中糖蛋白是KS1/4。
8.按照权利要求
1到7中之一的结合物制备方法,其中每个抗体平均结合大约1-10个长春花残基。
9.按照权利要求
1的结合物制备方法,其中结合物内相对每摩尔KS1/4含大约1-10摩尔的4-去乙酰基-长春碱-3-羧酰腙。
10.按照权利要求
1的方法制备的一种长春花腙结合物。
本发明提供了将含有连在C-3或C-4位上的酰肼基团的抗癌的吲哚-二氢吲哚长春花生物碱与含醛基的氧化了的糖蛋白反应形成的免疫球蛋白结合物。
免疫球蛋白结合物制作方法
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