专利名称：一种低溶剂残留的糖蛋白组合物及其制备方法和用途的制作方法治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质，包括绒毛膜促性腺激素(HCG)、绝经期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)，其中绝经期促性腺素是含有卵泡刺激素和黄体生成素且两者成一定比例(I 0.1-1)的混合物。HCG、FSH、LH都是由a链和0链两个亚基通过非共价键的形式结合，其中它们的a亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺 是发生N-糖基化的氨基酸。HCG的P亚基有145-147个氨基酸，分子量22200-39000D，其中第13、30位置上的天冬酰胺以及第121、127、132、145位置是发生糖基化的地方。FSH的^亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的P亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D。临床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特定妇女(孕期或绝经期)的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。治疗不孕症的糖蛋白的第一代产品是上世纪60年代Serono公司的Profasi (HCG)、Pergonal (HMG)，它们的纯度都较低，含有大量杂质。上世纪80年代之后，Serono公司分别推出了 Metrodin-HP，它是一种杂质含量很低的高纯度的FSH制剂；后来又推出利用DNA重组技术生产的Gonal-F (rFSH)、Luveris (rLH)等,另外，Ferring公司也推出了高纯度绝经期促性腺素-Menopur。由此可见，目前市场上都在致力于高纯度糖蛋白的开发和应用，来替代普通的低纯度产品，以克服普通低纯度产品中的杂蛋白造成的过敏反应。CN1309567A公开了含有FSH或其变体的液体制剂。但是，因为液体形式必须保存在-20°C以下，否则糖蛋白容易失活，液体形式不容易保存和运输；液体形式由于会遇到冻结-溶解过程，甚至是反复的冻结-溶解过程，更容易导致糖蛋白失活；液体形式还会遇到包装容器在低温下接近脆性点容易破裂的危险等。而对于制剂成品来说，液体形式除了不容易运输外，还遇到液体形式的糖蛋白药物的稳定性较差，而且必须要加防腐剂才能保证在有效期内微生物不会滋生，给临床应用带来安全性的隐患。因此，固体形式的糖蛋白组合物更适合工业化生产。而固体形式的获得主要是通过冷冻干燥和真空干燥的手段，但高纯度的糖蛋白在冷冻干燥的过程中很容易发生变性失活，其变性失活主要表现为完整分子降解成a链和3链两个亚基，而这些亚基也是杂质，它们是没有疗效或可能产生副作用的异构物，在投料时都要多加10-30%的量，以抵消冷冻干燥过程的失活情况，而且成品中还会产生一定量的亚基，降低了产品的纯度。CN101347613A公开了一种制备糖蛋白组合物的冻干方法可以制备高纯度的几乎不含亚基的糖蛋白冻干组合物，但是用此法去除有机溶剂的效果并不理想。而真空干燥通常是将有机溶剂与糖蛋白溶液充分混和，形成沉淀后再脱水，然后将沉淀进行真空干燥，这种方法虽然可以减小糖蛋白变性失活，但是干燥后的糖蛋白中的有机溶剂含量较高，质量百分含量超过I %。有机溶剂大多都对人体有害，2010年中国药典明确规定药品中乙醇限度为0. 5%。因此，本领域迫切需要开发出一种能降低糖蛋白中有机溶剂残留的真空干燥方法，并由此获得低有机溶剂残留的糖蛋白组合物。
本发明旨在提供一种低有机溶剂残留的糖蛋白组合物，以及获得上述糖蛋白组合物的真空干燥方法。本发明一方面提供了一种低有机溶剂含量的糖蛋白组合物，其中有机溶剂质量百分含量不超过0.5%,优选不超过0.3%,更优地不超过0.1%。 其中，所述有机溶剂为乙醇，丙酮或甲醇。其中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、绝经期促性腺素、卵泡刺激素、黄体生成素、或其混合。其中，所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和/或重组的人绒毛膜促性腺激素、或其变体；所述绝经期促性腺素是人尿来源和/或重组的人绝经期促性腺素、或其变体；所述卵泡刺激素是人尿来源和/或重组的人卵泡刺激素、或其变体；所述黄体生成素是人尿来源和/或重组的人黄体生成素、或其变体。本发明的另一方面，提供了一种简易制备得到低溶剂残留的糖蛋白组合物的方法。发明人经过深入研究，发现在将糖蛋白组合物与水系统共同真空干燥，能有效去除有机溶剂，得到具有良好稳定性的低溶剂残留的糖蛋白组合物。低溶剂残留的糖蛋白的组合物的干燥原理由于糖蛋白类物质在高温下易变性失活，故不宜采用喷雾干燥或其它加热的方式进行干燥，而冷冻干燥的方式也存在一定的失活现象，并且冷冻干燥设备昂贵，干燥量小，能耗大。采用真空干燥法(不加水体系干燥)产品降解失活不明显，但有机溶剂残留高。发明人对其溶剂残留超标的原因进行了深入分析，在样品真空干燥的前期有机溶剂和水以一定的比例共同挥发，但随着样品中有机溶剂以及水含量的降低，挥发的量越来越小，当样品中的水含量不再降低时，有机溶剂的量也不再降低。因此有机溶剂的残留量与样品中的水含量有关。发明人惊人地发现在真空干燥器中放置能释放出水蒸汽的物质，不但能够得到低溶剂残留的糖蛋白的组合物，而且样品不存在降解失活现象。发明人在获得低溶剂残留的糖蛋白的组合物后对其干燥原理进行了深入研究。在真空干燥器中放置能释放出水蒸汽的物质，目的是为了控制真空干燥过程中样品中的有机溶剂与水的挥发比例。真空干燥过程中有机溶剂与样品中的水共同挥发，在真空干燥箱内，有机溶剂和水蒸气各占一定比例的，但随着干燥的进行，水分含量有限，为了维持这一平衡，我们在干燥体系中放入能释放水蒸汽的物质，人为增加真空干燥箱内水气压，可以抑制样品中的水的挥发，同时又能促进样品中有机溶剂的挥发。从而有效的降低了样品中有机溶剂的残留，并且样品中的水含量也维持在较低水平，故样品不存在降解失活现象。发明人在获得低溶剂残留的糖蛋白的组合物后对其干燥过程又再次进行了深入研究，又惊人地发现，当有机溶剂干燥合格后，再撤去释放出水蒸汽的物质，继续真空干燥一定时间，能将样品中的水分真空干燥到合格范围内，并且有机溶剂还能进一步降低，样品在这一水份范围内稳定性良好。因此本发明的干燥过程分为两阶段，第一阶段是将样品与水体系共同真空干燥除去有机溶剂，第二阶段是撤去水体系真空干燥到样品含水量合格为止。制备方法本发明提供了一种制备低有机溶剂含量的糖蛋白组合物的方法，所述方法包括以下步骤(a)将有机溶剂与含有糖蛋白的组合物原料的溶液充分混合沉淀，收取沉淀物(1)，用有机溶剂脱水后，继续收取糖蛋白的组合物沉淀，获得含有糖蛋白组合物的沉淀物 (2);和(b)将含有糖蛋白组合物的沉淀物(2)与水系统共同真空干燥，得到本发明提供的低有机溶剂残留的糖蛋白组合物。在另一优选例中，在步骤(a)中，所述有机溶剂温度-20至25°C，优选-20至0°C。在另一优选例中，步骤(a)中，所述有机溶剂选自乙醇，丙酮或甲醇。在另一优选例中，在步骤(a)中，所述脱水用有机溶剂量为湿沉淀物(I)重量0至10倍，优选I至4倍。在另一优选例中，在步骤(b)中，所述干燥温度在0至25°C，优选0至20°C。在另一优选例中，在步骤(b)中，所述水系统包括固态、液态或气态的自来水、去离子水、反渗透水、纯水和注射用水，能释放水蒸汽的物体，以及水溶液，优选纯化水。在另一优选例中，在步骤(b)中，所述干燥时间为I至48小时，优选10至24小时。在另一优选例中，步骤a所述的含有糖蛋白组合物原料的溶液可以由以下步骤制备将含有糖蛋白组合物的原料溶解在水或缓冲液中，制备含有糖蛋白组合物原料的溶液。在另一优选例中，所述的含有糖蛋白组合物的原料为固体。在另一优选例中，所述的缓冲液选自pH值缓冲范围在3至11的缓冲液；优选自；磷酸盐缓冲液，Tris缓冲液，醋酸钠缓冲液。在另一优选例中，所述溶解温度在5至20°C，优选10至16°C。在另一优选例中，所述含有糖蛋白组合物原料的溶液的pH值为3至11，优选4至10。在另一优选例中，在步骤(b)后面还可以含有以下步骤(C)撤去水系统后继续真空干燥得到本发明提供的低溶剂残留的糖蛋白的组合物。在步骤(c)中，所述干燥时间为0至48小时，优选5至24小时。在本发明的一个优选例中，制备低有机溶剂含量的糖蛋白组合物的方法包含以下步骤 (a’)用-20 0°C的有机溶剂与含有糖蛋白的组合物原料的溶液充分混合沉淀，收取沉淀物(I);(b’ )将沉淀物(I)，用有机溶剂脱水后，继续收取糖蛋白的组合物沉淀，获得含有糖蛋白组合物的沉淀物⑵；(c’)将糖蛋白的组合物沉淀物(2)与水系统在0 25°C共同真空干燥I 48小时，得到具有良好稳定性的低溶剂糖蛋白的组合物；和(d’)在步骤(c’)后，撤去水系统，于0 25°C继续真空干燥步骤(c’)制得的低溶剂糖蛋白的组合物0 48小时，得到更低溶剂残留的糖蛋白的组合物。如本文所用，“糖蛋白”选自下述的一种或多种混合绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin,CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulatinghormone,FSH)、黄体生成素(luteotropic hormone, LH)、绝经期促性腺素(human menopausal gonadotropin,HMG)。如本文所用，“糖蛋白组合物原料”是指含有糖蛋白的组合物，其中包括糖蛋白，或 者包括糖蛋白和药学上/食品学上可接受的载体。可以使用本领域现有的制备糖蛋白组合物的方法所获得的糖蛋白组合物作为原料，可以为固体或液体，例如但不限于，中国专利CN1246332C公开的制备方法获得的高纯度的HMG ;中国专利CN1958603B公开的制备方法获得的HCG ;以及CN101317103A公开的方法获得的FSH。以上糖蛋白组合物原料的获得仅是举例，本发明所述的糖蛋白组合物原料应当不受此限制。在本发明提供的获得低溶剂残留的糖蛋白组合物的方法中，所述的“将含有糖蛋白组合物的沉淀物(2)与水系统共同真空干燥”是指将含有糖蛋白组合物的沉淀物(2)放置在真空干燥器通常放置样品的地方，并在真空干燥器周围(例如底部)放置盛着能释放水蒸汽的物质的敞开的容器，所述的能释放水蒸汽的物质选自自来水、纯水、或冰水混合物。在本发明提供的获得低溶剂残留的糖蛋白组合物的方法中，所述的“撤去水体系”是指将盛着能释放水蒸汽的物质的敞开的容器移往真空干燥的环境之外。本发明的主要优点在于I、本发明提供了一种新的低溶剂残留的糖蛋白的组合物。2、本发明提供了一种新的低溶剂残留的糖蛋白的组合物的制备方法。3、本发明具有条件温和、操作过程简单、降解失活现象小，产品稳定性好，能耗低，在很大程度上减轻了工艺操作难度系数，降低了生产成本。


图I显示了乙醇含量为0. 5%的标准品的GC图谱；其中溶剂的保留时间、峰面积和质量含量如下表所列
保留时间(分钟)~峰面积质量含量(％) 溶剂种类
3. 1751040. 505ZM。图2显示了对比例2中HMG样品中的乙醇含量GC图谱；其中溶剂的保留时间、峰面积和质量含量如下表所列


本发明公开了一种低溶剂残留的糖蛋白的组合物及其制备方法，所述糖蛋白组合物中有机溶剂含量不超过0.5％；所述的方法包括步骤(a)将糖蛋白组合物的沉淀物与水系统在0-25℃共同真空干燥；(b)撤去水系统后继续真空干燥得到低溶剂残留的糖蛋白的组合物。