专利名称：一种生产大豆蛋白寡肽的方法 近年来研究发现，人体对肽和氨基酸的吸收是通过两套完全不同的机制进行的，寡肽可以被人体直接吸收。寡肽水解物除了和氨基酸一样能为人体提供氮营养源之外，还因为其中的某些寡肽具有生理活性而表现出保健功能。目前，将大豆蛋白水解为肽的方法主要有酸解法和酶解法两种。酸解法的弊端是容易破坏色氨酸和一些羟氨酸，难以控制水解程度，水解产物以氨基酸为主，不利于寡肽制备。相比之下，酶解法条件缓和，能够克服酸解法的缺点。以下专利披露了酶解大豆蛋白的具体方法，如CN1151848A；CN1168770A；CN1323535A；CN1344138所公开的内容。已有专利所公开的酶解方法有两个特点，其一是均采用碱性蛋白酶，其二是水解过程中均要求不断向水解液中补加碱溶液，以维持水解液pH值恒定。水解大豆蛋白的关键在于如何提高原料(底物)的降解率。在pH6.5-8.5的碱性环境中，碱性蛋白酶的水解效率高。但是，在酶解过程中，随着蛋白质肽键的不断打开，游离出的羧基数量不断增加，水解液的pH值会不断下降。因此，在单纯使用碱性蛋白酶的情况下，必须通过补加碱液，稳定pH值，从而维持碱性蛋白酶的水解活性。否则，难以得到满意的原料(底物)降解率和寡肽含量。然而，维持pH值的碱溶液在水解物中会产生明显的碱性异味并引入盐类杂质。因此，必须在下游处理中采用复杂的脱盐除杂操作。这将增加现有方法实施的难度和产品的成本。
本发明的目的是提供一种在不外加碱的PH值渐变条件下，用酶水解大豆蛋白制备寡肽的方法。经研究发现这一目的可以通过碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同水解作用实现首先利用碱性蛋白酶水解大豆蛋白，水解液的PH值随着酶解反应的进行和游离羧基的数量增多开始逐渐下降。当水解液的PH值低于碱性蛋白酶所要求的下限值，即开始呈现弱酸性时，碱性蛋白酶的水解活性受到抑制，但酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶被激活。于是，蛋白质在酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的作用下继续水解。随着打开肽键数量的继续增多，水解液的PH值继续下降，酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以保持高水解活性。本发明的技术方案按如下所述实现向带有机械搅拌装置的普通发酵罐中加入适量自来水，并按照底物浓度要求向其中加入一定量的大豆蛋白。启动机械搅拌浆，使之以适当的速度搅动浆液，同时通过水夹套或/和水蒸汽直接接触将反应浆液温度提到指定温度。用pH计和固定于发酵器内的pH计电极测定水解反应之前的浆液酸碱度。然后，向发酵罐中加入蛋白酶，开始水解反应。最后，用pH计监测水解液酸碱度的变化，并通过采样(搅拌均匀的水解液)分析不同时刻的原料降解率、蛋白质水解度和水解物中肽分子量分布。水解反应结束之后，将水解液在95℃煮沸5-10分钟使蛋白酶变性失活，终止反应。
本发明的核心是蛋白酶的选择和使用，影响本发明实施效果的水解条件包括底物浓度、水解温度和时间。
蛋白酶根据使用时所要求的pH值条件不同，可以划分为碱性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶。
本发明使用的蛋白酶包括碱性蛋白酶。常见碱性蛋白酶如碱性霉菌蛋白酶(来源于米曲霉，使用pH值6.5-8.5，使用温度45-60℃)，碱性细菌蛋白酶(来源于地衣芽孢杆菌，使用pH值6.5-8.5，使用温度55-70℃)，Alcalase碱性细菌蛋白酶(来源于枯草杆菌，使用pH值6.5-8.5，使用温度55-70℃)。
本发明中使用的蛋白酶还包括酸性蛋白酶和中性蛋白酶。常见酸性蛋白酶如酸性霉菌蛋白酶(来源于黑曲霉，使用pH值2-5.0，使用温度45-55℃)，胃蛋白酶(来源于动物胃，使用pH值1.0-3.0，使用温度30-40℃)。常见中性蛋白酶如中性霉菌蛋白酶(来源于米曲霉，使用pH值5.0-7.5，使用温度50-65℃)、中性细菌蛋白酶(来源于枯草芽孢杆菌，使用pH值4.5-7.0，使用温度45-60℃)、ProtamexTM细菌蛋白酶(属于杆菌蛋白酶复合体，使用pH值5.5-7.5，使用温度55-60℃)。
在本发明中，碱性蛋白酶要与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用。如果允许使用温度范围相近，则酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以与碱性蛋白酶同时加入发酵罐。如果酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的允许使用温度低于碱性蛋白酶的使用温度，则应在碱性蛋白酶的水解活性基本消失之后(即水解液的pH值停止下降之后)再向发酵罐中加入酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶。并将水解温度调整到酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的适宜使用温度。
在以上所说的碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶配合使用方案中，碱性蛋白酶可以是一种酶，也可以是复合碱性蛋白酶。同样，酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶可以是一种酶，也可以是复合酸性蛋白酶或/和复合中性蛋白酶。
为了充分发挥碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同催化水解作用，碱性蛋白酶、酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的投放量(在本发明中表示为酶溶液与底物比，或酶固体占底物重量的百分率)可根据其活力不同，由这一领域中的工程师用惯用的方法确定。水解温度的选择主要取决于酶的使用温度。在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶同时加入的方式中，水解温度应根据使用温度最低的酶来定。在碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶分步加入的方式中，水解温度可根据不同水解阶段所使用的酶的允许使用温度来调整。根据本发明，水解温度的选择范围为30-70℃。
本发明可采用任何大豆蛋白为原料(底物)，如大豆分离蛋白、大豆浓缩蛋白、脱脂大豆粉、大豆粕和豆饼等。其中，优选大豆分离蛋白和大豆浓缩蛋白。根据本发明，底物浓度的选择范围为20-100克/升。底物浓度太高时，酶的水解活性低，难以得到满意的底物降解率。另一方面，底物浓度太低，虽然酶的水解活性高，但会增加下游处理过程中蒸发、浓缩水解液的难度。当把适量的大豆分离蛋白或脱脂大豆粉在搅拌下加入自来水中并加热到如上所述的水解温度范围时，大豆蛋白浆液的初始pH值能达到7-7.5，能够满足碱性蛋白酶对酸碱度的要求。
根据本发明，大豆蛋白在以上所述的条件下水解的适宜时间范围为2-24小时。水解时间太短时，不利于得到满意的底物降解率和蛋白质水解度。相反，如果水解时间过长，则不但底物降解率和蛋白质水解度增加不明显，而且水解液容易在微生物作用下变质。
底物降解率定义为被水解的大豆蛋白原料重量占投料的大豆蛋白原料重量的百分比；水解度定义为在水解过程中打开的肽键数量占蛋白质分子总肽键数量的百分比。
降解率的测定方法如下水解液在4000r/min下离心10min，把上层清液和固体物分离，将固体不溶物在110℃下干燥至恒重，称重。然后按下式计算底物降解率 其中，大豆蛋白投料量折算成干基。大豆蛋白的含水量是在110℃下干燥至恒重后测定的。底物降解率越高，表示原料的单程利用率高。
蛋白质水解度的测定采用甲醛滴定法，具体测定方法如下将水解液在4000r/min下离心10min，取5ml上层清液，用0.1M的NaOH溶液滴定到pH＝8.2，加入5ml 37％的甲醛溶液(所用甲醛溶液先用NaOH滴定到pH＝8.2)，再用0.1M的NaOH滴定到pH＝8.2。记录加入甲醛后把溶液滴定到pH＝8.2所耗碱量。pH值测量使用精密pH计。然后按照下式计算蛋白质的水解度 其中，大豆蛋白彻底水解的方法是将大豆蛋白在6M HCl中于105-110℃下水解24个小时。蛋白质的水解度高，表示水解物的平均分子量小。
水解物中寡肽的含量可以用产品分子量分布测定。产品分子量分布采用葡聚糖凝胶层析法测定取上述水解物的离心上清液1ml上凝胶柱(SephedaxG-25)，洗脱液为pH值为8.0的磷酸盐缓冲溶液，用蠕动泵(DESAGA)控制流速为17.3ml/h，流出液用样品馏分收集器(SF-2120)收集，每管收集体积为1.5ml。然后用紫外光谱测定280nm处的吸光度，并做出吸光度对馏分的关系图。用分子量标准物标定水解液的分子量分布。
本发明的效果和益处是，根据本发明，大豆蛋白原料的降解率可以达到70-90％，蛋白质的水解度可以达到20％以上，水解物中小于10个氨基酸的寡肽可以达到40％以上。本发明整个水解过程中不用向水解液中补加碱溶液，因此简化了产品的下游处理工艺，并有利于降低寡肽的生产成本。

以下详细叙述本发明的具体实施例实施例1(对比实施例)将12g大豆浓缩蛋白(干基重量)和200ml自来水加入带有水夹套的发酵罐中，在搅拌下将发酵罐内的温度提高到60℃。通过pH计测得发酵罐内料液的pH值约为7.0。然后，向发酵罐内加入240μl Alcalase碱性蛋白酶(2.4L，标示活力为2.4AU/克，丹麦NOVO公司出品)，在不断搅拌下开始水解。在本例中，底物浓度为60克大豆分离蛋白/升水，酶与底物的比为20μl Alcalase碱性酶(2.4L)/克大豆分离蛋白。总水解时间为24小时。在水解过程中对pH值、底物降解率和蛋白质水解度进行跟踪分析。分析结果为水解液pH值在水解开始1小时后达到6.3-6.4并停止下降。底物降解率和蛋白质水解度也在水解开始1小时后分别达到约50％和约11％并停止增加。
实施例2重复实施例1，但在加入240μl Alcalase碱性蛋白酶的同时，加入2％(以底物干基重量为基准)的黑曲霉酸性蛋白酶(酶活力3000u/g)。分析结果为水解液pH值在水解时间内持续下降，水解进行24小时后达到约5.2。底物降解率在16-18小时后达到最高值约76％，此后变化不大，蛋白质水解度在考察时间内持续增加，当水解时间达到24小时时，水解度增加到约28％。用葡聚糖凝胶层析法测得，在水解24小时所得到的水解物中小于10个氨基酸的寡肽约占肽含量的70％。
实施例3重复实施例2，但黑曲霉酸性蛋白酶在Alcalase碱性蛋白酶加入1小时之后才加入发酵罐，并将发酵罐的温度调整为55℃。则水解24小时的结果为水解液pH值约5.1，底物降解率约为80％，蛋白质水解度约为25％。
实施例4重复实施例2，但改加1％的ProtamexTM中性细菌蛋白酶(属于杆菌蛋白酶复合体，酶标活力为1.5AU/克)和1％的黑曲霉酸性蛋白酶，代替原来所加的2％黑曲霉酸性蛋白酶。则水解10小时、18小时、24小时的结果如下表

实施例5重复实施例2，但大豆蛋白原料改为大豆分离蛋白。则水解24小时的结果为水解液pH值约4.5，底物降解率约为92％，蛋白质水解度约为30％。


本发明属于酶催化技术领域。主要涉及酶解大豆蛋白制备寡肽(小于10个氨基酸的肽)的方法。其主要技术特征是，以大豆浓缩蛋白、大豆分离蛋白、脱脂大豆粉、大豆粕、豆饼中的任何一种为原料，在不外加碱的pH值渐变条件下，利用碱性蛋白酶与酸性蛋白酶或/和中性蛋白酶的协同水解作用得到寡肽。蛋白酶协同作用水解条件为温度30－70℃，时间2－24小时。底物浓度20－100克/升。本发明效果和优点是整个水解过程中不用向水解液中补加碱溶液，因此简化了产品的下游处理工艺，并有利于降低寡肽的生产成本。