专利名称：含有大豆蛋白水解物的抗氧化剂及其用途的制作方法包括人在内的需氧型生物为了生存通过呼吸摄入氧，此时摄入体内的氧的一部分在能量代谢时转变为过氧化物自由基、过氧化氢、羟基自由基等活性氧。这样的活性氧本来与以细菌或病毒感染时的巨噬细胞的病原体除去机制为代表的生物体防御等相关，在维持健康方面发挥重要的功能。但是，由于大气污染、紫外线等环境因素、或吸烟等生活习惯、精神压力等，生物体内的平衡被破坏，活性氧一旦过剩，即会与生物体中的蛋白质、脂质、DNA等发生反应，引起蛋白质改性、过氧化脂质生成、遗传损伤等，从而导致发生生活习惯病、促进衰老。因此，逐渐认识到除了生物体所具有的机制以外，来自饮食的抗氧化活性成分的摄 取对于维持健康也是非常重要的，并推荐积极地摄取抗氧化物质作为第7种营养素。大豆据报告具有多种生理功能,关于抗氧化活性也有一些报告。例如，大豆异黄酮被确认具有与其他类黄酮类同样高的抗氧化活性。另外，关于大豆蛋白水解物的抗氧化活性，对显示抗氧化活性的肽序列进行了鉴定。但是，从大豆蛋白水解物中大量分离特定的肽以用作抗氧化剂在制造上存在困难。因此，如果能够将作为各种肽的混合物的大豆蛋白水解物本身用作抗氧化剂，则是有用的。其中，专利文献I中记载了抗氧化能力增强了的大豆蛋白的水解物，并记载肽的平均分子量为3kDa 30kDa (3000 30000)。该文献为了避免出现由于过度水解所导致的苦味，得到的是较高分子量的肽。另外，专利文献2和3中也记载了显示抗氧化能力的大豆蛋白的水解物，但专利文献2中记载的肽的平均分子量为500 5000，专利文献3的肽的平均氨基酸链长为10 100个，其分子量相当于约1200以上。此外，专利文献4中作为具有抗氧化活性的大豆蛋白水解物，记载了使用来源于枯草杆菌或米曲霉等的各种蛋白酶而得到的水解物，并记载了滤取该水解物的分子量为2000以下的水解物、该水解物的游离氨基酸的含有比例为20 30重量％。虽然认为这些大豆蛋白水解物具有一定的抗氧化活性，但该活性未必是能够作为抗氧化剂得到实用的水平，因此还需要显示更高的抗氧化活性的大豆蛋白水解物。现有技术文献专利文献专利文献I :日本特开2005 - 80668号公报专利文献2 :日本特开平10 - 203994号公报专利文献3 :日本特开2000 - 4896号公报专利文献4 :日本特开2003 - 210138号公报非专利文献非专利文献I J. Agric. Food. Chem.，52，4026-4037，200
发明所要解决的问题本发明的课题在于提供能用于饮食品或药品的、显示高的抗氧化活性的抗氧化剂。用于解决问题的方法本发明人对该课题进行了深入研究，结果发现，通过得到蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物，能够得到与以往相比显示更高的抗氧化活性的抗氧化剂，从而完成了本发明。S卩，本发明提供以下的(I) (13)。·(I) 一种抗氧化物质，其特征在于，其在预防或治疗生物体的氧化所导致的疾病的方法中作为有效成分使用，其含有大豆蛋白水解物，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。(2)根据上述(I)所述的抗氧化物质，其中，生物体的氧化所导致的疾病为动脉硬化、心肌梗塞、癌、糖尿病、阿耳茨海默病、或花粉病。(3)根据上述(I)所述的抗氧化物质，其中，所述大豆蛋白水解物是除去了水解后的不溶物的大豆蛋白水解物。(4)根据上述(I)所述的抗氧化物质，其进一步含有选自维生素类、多酚类、类胡萝卜素类、皂苷类和大蒜素中的I种以上的抗氧化物质。(5) 一种用于预防或治疗生物体的氧化所导致的疾病的饮食品或药品的制造方法，其特征在于，添加有效成分即大豆蛋白水解物作为抗氧化物质，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。(6)根据上述(5)所述的饮食品或药品的制造方法，其中，并用选自维生素类、多酚类、类胡萝卜素类、皂苷类和大蒜素中的I种以上的抗氧化物质。(7) —种预防或治疗生物体的氧化所导致的疾病的方法，其特征在于，使用含有大豆蛋白水解物的抗氧化物质作为有效成分，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。(8) 一种抗氧化剂，其特征在于，含有大豆蛋白水解物，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。(9)根据上述(8)所述的抗氧化剂，其中，所述大豆蛋白水解物是除去了水解后的不溶物的大豆蛋白水解物。(10)根据上述(8)所述的抗氧化剂，其进一步含有选自维生素类、多酚类、类胡萝卜素类、皂苷类和大蒜素中的I种以上的抗氧化物质。 (11) 一种饮食品，其添加有上述(8 )所述的抗氧化剂。(12) —种药品，其以上述(8)所述的抗氧化剂为有效成分。(13)大豆蛋白水解物在抗氧化剂的制造中的用途方法，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。发明的效果通过本发明，可以提供不是使用了从大豆蛋白水解物中分离出的具有特定的抗氧化活性的肽、并是使用了该大豆蛋白水解物(肽混合物)本身的实用并且显示高的抗氧化活性的抗氧化剂，从而能够在生物体的氧化所导致的动脉硬化等疾病的预防或治疗中发挥作用。

图I为表示蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量与ORAC值之间的相关关系的图表。

分子量低于500的肽的含量如下算出通过肽用凝胶过滤色谱法测定蛋白水解物中的分子量低于500的肽和游离氨基酸级分的比例，然后减去通过氨基酸分析算出的蛋白水解物中的游离氨基酸含量。如上特定的大豆蛋白水解物优选尽可能减少除分子量低于500的肽以外的肽和游离氨基酸的比例。即，蛋白水解物中的游离氨基酸含量相对于肽与游离氨基酸的总量优选为12重量％以下、更优选为5重量％以下、进一步优选为3重量％以下。此外，由于该蛋白水解物中的肽体优选为更低分子的肽，因此蛋白水解物中的分子量为500以上的级分比例相对于肽与游离氨基酸的总量优选为40重量％以下、更优选为38重量％以下、进一步优选为35重量％以下。
(蛋白酶)用于获得本发明的大豆蛋白水解物的蛋白酶无论是动物来源、植物来源还是微生物来源均可，可以从蛋白酶的分类中被分类为“金属蛋白酶”、“酸性蛋白酶”、“硫醇蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶”的蛋白酶、优选从被分类为“金属蛋白酶”、“硫醇蛋白酶”、“丝氨酸蛋白酶”的蛋白酶中适当选择。由于使属于2种以上或3种以上的不同分类的酶依次或同时发挥作用的分解方法能够增加分子量低于500的肽的比例，因此特别优选。该蛋白酶的分类为酶学领域中通常采用的根据活性中心的氨基酸的种类不同而进行的分类方法。作为各自的代表，“金属蛋白酶”中可列举出杆菌属(Bacillus)来源的中性蛋白酶、链霉菌属(Streptomyces)来源的中性蛋白酶、曲霉属(Aspergillus)来源的中性蛋白酶、“Termoase”等,“酸性蛋白酶”中可列举出胃蛋白酶、曲霉属(Aspergillus)来源的酸性蛋白酶、“Sumizyme FP”等，“硫醇蛋白酶”中可列举出菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等，“丝氨酸蛋白酶”中可列举出胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、链霉菌属(Streptomyces)来源的碱性蛋白酶、“Alcalase”、“Bioprase”等。即使是除这些酶以外的酶，根据作用PH或与抑制剂的反应性的不同，也能够确认其分类。活性中心不同的酶之间由于对基质的作用部位有很大不同，因此能够减少“剪切残留物”、高效地获得酶分解物。另夕卜，通过并用不同来源的(来源生物)的酶，能够进一步高效地制造酶分解物。即使分类相同但只要来源不同，对基质蛋白质的作用部位也就会不同，结果能够增加分子量低于500的肽的比例。这些蛋白酶优选外切蛋白酶活性小的蛋白酶。蛋白酶处理的反应pH或反应温度根据所使用的蛋白酶的特性进行设定即可，通常，反应PH在最适pH附近进行、反应温度在最适温度附近进行即可。大体是，反应温度为20 80°C、优选为40 60°C。反应后加热到足以使酶失活的温度(60 170°C左右)，使残留酶活性失活。蛋白酶处理后的反应液可以直接使用或浓缩后使用，但通常进行杀菌、并进行喷雾干燥、冷冻干燥等后以干燥粉末的状态使用。杀菌优选加热杀菌、加热温度优选为110 170°C、进一步优选为130 170°C。加热时间优选为3 20秒钟。另外，可以将反应液调整到任意的pH。可以将蛋白酶处理时或pH调整时产生的不溶物(沉淀物或悬浮物)通过离心分离或过滤等除去。除去不溶物能够提高大豆蛋白水解物的抗氧化活性，因此优选。还可以进一步利用活性炭或吸附树脂进行纯化。(抗氧化作用)本发明中的蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物显示高的抗氧化活性，可用作用于预防或治疗生物体的氧化所导致的疾病的有效成分。对于该水解物所具有的抗氧化活性，可以以采用非专利文献I中记载的方法测定的“ORAC”(Oxygen Radical Absorbance Capacity :活性氧吸收能力)的值(单位ymol TE/g)为指标。其中，单位中的“TE”为“Trolox equivalent(水溶性维生素E当量)”的略写，“Trolox”为标准物质“6-羟基-2，5，7，8-四甲基色满-2-羧酸”的注册商标。ORAC值越高，表示活性氧吸收能力即抗氧化活性越高，本发明中的蛋白水解物中的分子量低于500 的肽多的大豆蛋白水解物的ORAC值优选为350 μ mo I TE/g以上、更优选为450 μ mo I TE/g以上、进一步优选为500 μ mo I TE/g以上。(与其他抗氧化物质的并用)通过将本发明的大豆蛋白水解物与I种以上的其他显示抗氧化活性的物质或含有这些物质的提取物并用，能够协同地提高抗氧化活性，其中，蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上。对于并用其他的抗氧化物质的形态没有特别限定，可以预先与本发明的大豆蛋白水解物混合，制成混合制剂来使用，也可以在本发明中在使用大豆蛋白水解物时，将其他抗氧化物质另外添加来使用。作为其他的抗氧化物质，可列举出例如维生素类、多酚类、类胡萝卜素类、皂苷类、大蒜素等。作为维生素类，可列举出维生素C、维生素A、维生素E等。作为多酚类，除了异黄酮、槲皮素、杨梅素、山奈酚、橙皮甙、柚皮苷、花青素、儿茶素、白杨素、芹菜素、木犀草素等类黄酮类、芝麻素、芝麻素酚、芝麻素酚、细辛脂素、芝麻酚、芝麻酚林等木脂素类之外，还可列举出碧萝芷、姜黄素、绿原酸、没食子酸、迷迭香酸、鞣花酸、香豆素、阿魏酸、姜烯酚、可可多酚等。作为类胡萝卜素类，可列举出胡萝卜素(α —，β —，Y —，δ 一)、番茄红素等胡萝卜素类、或者叶黄素、虾青素、玉米黄素、角黄素、岩藻黄素、花药黄质、紫黄质、辣椒素等叶黄素类等。作为皂苷类，可列举出皂树属皂苷等原料药来源的皂苷、大豆皂苷、茶皂苷等。当使用这些抗氧化物质时，可以替代地使用含有这些抗氧化物质的植物提取物，例如当使用花青素时，可以使用蓝莓提取物、黑醋栗提取物、巴西莓果提取物、接骨木果提取物等。上述显示抗氧化活性的物质或提取物中，特别是当将维生素C、碧萝芷、巴西莓果提取物、姜黄素或芝麻素并用时，协同效果更强，因此优选。(饮食品中的利用)本发明的蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物可以以将其作为有效成分的抗氧化剂的形式用于各种饮食品中。例如，可以以防止饮食品自身的氧化为目的而添加到饮食品中。另外，通过添加本发明的蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物,能够对摄取者发挥作为生理功能的抗氧化能力，从而得到可预防生物体的氧化所导致的下文所述的疾病的饮料、片剂、食品块(压成块的精加工食品)、沙拉用调味酱、肉制品、零食点心、甜点、点心类和营养助剂等。(药品中的利用)本发明的蛋白水解物中的分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物还可用作药品。作为生物体的氧化所导致的疾病，可列举出动脉硬化、心肌梗塞、癌、糖尿病、阿耳茨海默病、花粉病等，能够用作用于预防和治疗这些疾病的药品。当以药品的形态供给时，可以以液体、散药、片剂、胶囊等各种形态使用。实施例以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明。
(测定方法)首先，实施例中使用的各种测定方法整理如下。〈蛋白质含量〉将通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定的蛋白质量的重量相对于105°C、12小时干燥得到的大豆蛋白级分的重量作为干燥物中的蛋白质含量，用“ ％”表示。其中，氮换算系数设为6. 25。<游离氨基酸和肽的含量>通过使用了以下的凝胶过滤柱的HPLC法测定大豆蛋白水解物的分子量分布。将使用了肽用凝胶过滤柱的HPLC体系组装，对作为分子量标记物已知的肽作图，在分子量与保持时间的关系中求出标准曲线。其中，分子量标记物使用八肽[β-Asp]-血管紧张素 II 的 β-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (分子量为 1046)、六妝血管紧张素 IV 的 Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (分子量为 775)、五妝 Leu-Enkephalin 的Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu (分子量为 555)、二妝 Glu-Glu-Glu (分子量为 405)、游尚氛基酸 Pro(分子量为115)。将蛋白水解物(1%)在10，OOOrpm下离心分离10分钟，将得到的上清用凝胶过滤用溶剂稀释至2倍，其中的5 μ I供于HPLC。蛋白水解物中的游离氨基酸和分子量低于500的肽级分的比例(％)采用分子量低于500的范围(时间范围)的面积相对于总吸光度的图不面积的比例来求出(使用柱Superdex Peptide 7. 5/300GLCGE Healthcare Japan 株式会社制)、溶剂I % SDS/10mM 憐酸缓冲液、pH为8. O、柱温度为25°C、流速为O. 25ml/min、检测波长220nm)。另外，蛋白水解物中的分子量为500以上的肽级分的比例(％)与上述同样地采用分子量为500以上的范围的面积相对于总吸光度的图示面积的比例来求出。接着，利用氨基酸分析进行蛋白水解物中的游离氨基酸含量的测定。将蛋白水解物(4mg/ml)加入到等量的3%磺基水杨酸中，在室温下振荡15分钟。在10，OOOrpm下离心分离10分钟，将得到的上清用O. 45μm过滤器过滤，用氨基酸分析器“JLC500V”(日本电子株式会社制)测定游离氨基酸。蛋白水解物中的游离氨基酸含量是以相对于通过凯氏定氮法得到的蛋白质含量的比例的形式算出的。将如上得到的从“游离氨基酸和分子量低于500的肽级分的比例”中减去“游离氨基酸含量”得到的值作为蛋白质分解物中的“分子量低于500的肽的含量”。< ORAC值的测定〉将得到的样品分别称量lOOmg，使其溶解到50%乙醇中，定容到100ml，按照非专利文献I记载的方法进行测定。定量使用“Trolox”(注册商标、从Kishida化学株式会社购得)作为标准物质，用各测定值算出。(制造例I)分离大豆蛋白的制备从低改性脱脂大豆如下制备分离大豆蛋白。(I)将低改性脱脂大豆的热水提取浆料用离心分离机除去豆腐渣级分，得到脱脂豆浆。
(2)将得到的脱脂豆浆的pH调整为4. 5，进行等电点沉淀，用离心分离机得到酸沉淀酪状物，进行中和。(3)中和得到的各级分，在120°C下进行10秒钟加热杀菌。(制造例2)大豆蛋白水解物的制备(大豆蛋白水解物A、B)制备制造例I中得到的分离大豆蛋白的10%溶液，添加O. 2%或O. 5%的“Alcalase “(Novozymes Japan株式会社制),在55°C下进行15分钟酶反应。酶反应后通过90°C、20分钟的加热处理使反应停止，然后进行冷冻干燥，制得试样(大豆蛋白水解物A、B)。(制造例3)大豆蛋白水解物的制备(大豆蛋白水解物C、D)制备制造例I中得到的分离大豆蛋白的3%溶液，相对于蛋白质添加I %或2%的·金属蛋白酶“Termoase”(来源Bacillus thermoproteolyticusRokko,大和化成株式会社)，在pH为9.0、58 °C下进行60分钟酶反应。接着，相对于蛋白质加入0. 5%或1%的丝氨酸蛋白酶“Bioprase”(来源Bacillus sp.、Nagase ChemiteX株式会社),在pH为7. 5、58°C下进行60分钟酶反应。接着，相对于蛋白质加入0. 5 %或I %的金属蛋白酶“Sumizyme FP”(来源Aspergillus oryzae,新日本化学工业株式会社),在pH为7. 5、58°C下进行60分钟酶反应。在以上的酶反应后，对酶反应液进行90°C、20分钟的加热处理使反应停止，然后进行冷冻干燥，制成试样(大豆蛋白水解物C、D)。(制造例4)大豆蛋白水解物的制备(大豆蛋白水解物E、F、G)制备制造例I中得到的分离大豆蛋白的3 %溶液，相对于蛋白质加入I %、1. 5 %或2%的与制造例3相同的“Termoase”，在pH为9. 0、58°C下进行60分钟酶反应。接着，相对于蛋白质加入0. 5% >0. 75%或I %的与制造例3相同的“Bioprase”,在pH为7. 5、58°C下进行60分钟酶反应。接着，相对于蛋白质加入0. 5 %、0· 75 %或I %的与制造例3相同的“SumizymeFP ”，在pH为7. 5、58°C下进行60分钟酶反应。在以上的酶反应后，对酶反应液进行90°C、20分钟的加热处理使反应停止，进一步将通过酶反应生成的不溶物通过离心分离和利用孔径为I. Oym的膜滤器的过滤来除去，进行冷冻干燥，制成试样(大豆蛋白水解物E、F、G)。(试验例I)测定制造例2 4中得到的大豆蛋白水解物A G的蛋白质含量(％ )、分子量低于500的肽在肽与游离氨基酸的总量中所占的含量(％)、分子量为500以上的肽含量和游离氨基酸含量、以及ORAC值(μ mo I TE/g)(比较例I 4、实施例I 3)。各蛋白水解物的制备条件和分析结果整理于表I和图I。表I


本发明提供能用于饮食品或药品的、显示高的抗氧化活性的抗氧化剂。通过得到分子量低于500的肽的含量相对于肽与游离氨基酸的总量为50重量％以上的大豆蛋白水解物，能够得到显示高的抗氧化活性的抗氧化剂。