专利名称：一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法光学纯(-)_ Y -内酰胺是重要的医药中间体。抗艾滋病药(-)abacavir和(-)carbovir均能以(_) _ Y _内酰胺为原料进行合成，以(_) _ Y _内酰胺为光学中间体，还可以合成抗流感药物帕拉米韦[王建军等微生物学报，50 (8) : 988-994，2010]。由于上述手性药物的需求量不断增加，作为重要手性中间体的光学纯(-)_ Y-内酰胺制备研究越来越受到人们的关注。目前已有的制备方法包括化学合成法和生物拆分法。化学法制备(_)Y-内酰胺的主要问题为副产物多、产率低、制备成本高、步骤繁琐等，从而使得最终的产品 含量低，不能满足制药要求。生物拆分(±) Y-内酰胺主要是利用具有立体选择性的酶对(±) Y-内酰胺选择性拆分而得到(_) Y-内酰胺，具有反应条件温和，立体选择性好，产物光学纯度高，且不污染环境等诸多优点，有广泛的应用前景。有关该方法的研究主要集中在筛选高对映选择性的(+) Y -内酰胺酶的产生菌株。Brabban热Mahmoudian等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源，筛选得到了产(+) Y-内酰胺酶菌株荧光假单胞菌，将来源于该菌的(+) Y _ 内酸胺酶进行了分离纯化[Mahmoudian M, et al, : Tetrahedron: Asymmetry10，1201-1206，1999;AD Brabban et al, : Journal of industrial Microbiology16,8-14，1996] !Tbogoot/等在超高温古菌SwZ/Wo/ws■中分离出了(+) Y-内酰胺酶，该酶的热稳定性较好，具有绝对选择性，只专一性水解(+) Y-内酰胺，而不会水解(_) Y-内酸胺[Toogood, et al, :Tetrahedron 60, 711 - 716, 2004] 国内相关研究较少，李海泉等以N-乙酰苯丙氨酸为唯一碳源，筛选出了一株产Y-内酰胺酶的微杆菌氧化经微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)[李海泉等微生物学报，46 (4)571-575,2006];但该菌株能耐受的底物浓度较低(0.5 g/L — 20 g/L)[郑国钧等CN101113423A]，尚未达到工业化生产的要求；后来他们对该菌种进行了诱变[郑国钧等CN101240257A]，使酶活提高了 11倍。并对诱变菌株进行了细胞固定化研究，提高了细胞的稳定性，可重复使用[郑国钧等CN 101285059A]，尽管酶活有了很大的提高，但是能耐受的底物浓度仍不高，不利于工业化生产的应用。
本发明的目的是提供一种微生物立体选择性水解外消旋体2-氮杂二环-[2. 2. I]-庚烷-5-烯-3-酮(以下简称(±) Y-内酰胺)，制备㈠Y-内酰胺的方法。为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案从土壤中筛选获得具有高对映选择性(+) Y-内酰胺酶酶活的菌株一戴尔福特菌sp. ) CGMCC No. 5755，利用该微生物菌株立体选择性水解外消旋底物(±) Y-内酰胺，制备(_) Y-内酰胺。步骤如下 (I)微生物菌株的筛选将从本地化工厂附近采集的20多份土样，用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基，将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基，20-30°C培养2 - 3天，挑取单菌落，进行活性测定。将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中，在20 — 40°C、50 — 250 r/min下培养48h后，将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液(0. 01-0.5 mol/L, pH 4 - 10)中，添加终浓度为5 — 20 g/L的(±) Y-内酰胺底物，在20 - 40°C, 100 — 300 r/min下反应12- 48 h，取样进行HPLC分析。富集培养基(g/L):酵母提取物0.05 — 2，(±) Y-内酰胺0.2 — 10，NH4Cl0.2- 10，NaH2PO4 0. 01 — 0. 5，Na2HPO4 0. 01 — 0. 5，MgSO4 0. 01 — 0. 5，pH 4 — 10。 平板筛选培养基(g/L):酵母提取物0. 01 - 2，N-乙酰-L-苯丙氨酸0. 2 一 10，NH4Cl 0.2- 10，NaH2PO4 0. 01 — 0. 5, Na2HPO4 0. 01 — 0. 5,MgSO4 0. 01 — 0. 5，琼脂粉 10 —30，pH 4 — 10。发酵培养基(g/L):牛肉膏0. 3 — 20，蛋白胨 2 — 50，NaCl I — 25，pH 4 — 10。在以上培养基50 mL装于250 mL的三角瓶中，121 °C、0. 15 Mpa灭菌20 min。筛选得到一株具有较高⑴Y -内酰胺酶活性的微生物菌株JNU-GL，该菌株经鉴定为戴尔福特菌sp.，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5755。(2) 一种用所述菌株微生物立体选择性水解外消旋(±) Y-内酰胺，制备(-)Y-内酰胺的方法，采用具有立体选择性(+) Y-内酰胺酶酶活的微生物菌株，在水相体系中，以(±) Y-内酰胺为底物，进行不对称水解拆分制备(_) Y-内酰胺，步骤如下 微生物菌株戴尔福特菌sp. ) CGMCC No. 5755 ；
微生物菌株sp.的发酵培养条件优化的培养基组成为(g/L):蔗糖5 — 100，蛋白胨 5 — 50，牛肉膏 5 — 50，乙酰胺 5 — 150，MgSO4 0. 5 — 5，NaH2PO4 I — 10，Na2HPO4
I— 10, pH 4 — 10 ;培养温度20 — 40°C ;培养时间I 一 3天,将发酵液尚心获得湿菌体；反应体系的配制以(±) Y-内酰胺为底物，用pH 4-10,0.01-0.5 M磷酸盐缓冲液水相反应体系，底物浓度为2 g/L - 600 g/L ；
全细胞生物催化反应在上述的单一水相反应体系中，加入5 g/L — 100 g/L湿菌体，反应温度为25 - 45°C，反应时间为2 — 24 h，摇床转速为100 — 300 rpm ；
转化液的处理和分析微生物催化反应之后的转化液，离心除去菌体，上清液采用乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测；
产物的分离提取采用乙酸乙酯萃取产物，无水硫酸镁干燥，在30 - 80°C下蒸发浓缩，-20 - 4°C下冷却结晶，得到高纯度的(_) Y-内酰胺，光学纯度95. 0% - 99. 9%，化学纯度为 95% — 99%o分析方法
(-)Y-内酰胺的对映体过量值(ee)采用手性高效液相色谱法。色谱柱型号为Daicel公司CHIRALPAK AS-H ;流动相为异丙醇/乙腈(v/v) =80/20 ;流速0. 5mL/min ;检测波长230nmo本发明的有益效果本发明利用筛选获得的具有高对映选择性的(+) Y-内酰胺酶产生菌株戴尔福特菌sp. CGMCC No. 5755，在水相体系中选择性水解外消旋Y-内酰胺得到(-)Y-内酰胺，在200 g/L底物浓度条件下，产物(-)Y-内酰胺的光学纯度(ee值)达到100%，产物经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到光学纯的㈠Y-内酰胺，产物光学纯度为95. 0% - 99. 9%，化学纯度为95% — 99%。该微生物催化不对称水解制备(_) Y _内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率、高产物浓度的特点。生物材料样品保藏一株产高对映选择性(+) Y-内酰胺酶酶活的菌株,其分类命名为戴尔福特菌sp. ) JNU-GL,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 5755，保藏日期2012年2月14日。

做一个详细的说明。实施例I :具有内酰胺酶活性的微生物菌株筛选
将从本地化工厂附近采集的20多份土样，用无菌水稀释静置后取上清接种于富集培养基，将富集培养后的菌液涂布于平板筛选培养基，30°C培养2 — 3天，挑取单菌落，进行活性测定。将筛选获得的单菌落接入发酵培养基中，30°C、110 r/min培养48 h。然后将离心获得的湿菌体悬浮于磷酸盐缓冲溶液(0.05 mol/L, pH 7.0)中，湿菌体浓度50 g/L，底物(±) Y-内酰胺浓度为10 g/L，在30°C、180 r/min下反应，在48 h内取样，转化液经离心除去菌体，取上清液采用乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。筛选获得一株微生物菌株JNU-GL，表现出较高的立体选择性和转化率，产物的光学纯度(ee值)大于99. 5%。该菌株经鉴定为戴尔福特菌sp.,现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 5755。富集培养基(g/L):酵母提取物0. 1，(±) Y-内酰胺 2，NH4Cl 2，NaH2PO4 0. 1，Na2HPO4 0. 1，MgSO4 0. 1，调节 pH 7. O。平板筛选培养基(g/L):酵母提取物0. 1，N_乙酰-L-苯丙氨酸2，NH4Cl 2，NaH2PO4
0.1，Na2HPO4 0. 1，MgSO4 0. 1，琼脂粉 20，调节 pH 7. O。实施例2 :不同碳源对发酵产酶的影响
以蛋白胨(10 %)、酵母膏(5 %)为氮源，按3%浓度分别添加下列碳源葡萄糖、a-乳糖、菊糖、蔗糖、可溶性淀粉、柠檬酸、柠檬酸三钠、甘油、玉米浆，作为发酵培养基，并用于外消旋Y-内酰胺的水解反应。微生物催化反应之后的转化液，离心分离菌体，取上清以乙酸乙酯萃取，加适量无水硫酸镁干燥后，进行手性HPLC检测。考察不同碳源对菌株sp. CGMCC 5755发酵产酶和产物光学纯度的影响。由表2可以看出碳源对菌体的生物量影响不大，对ee有较大影响。采用甘油、蔗糖、可溶性淀粉、a -乳糖的ee值可以达到99. 5%以上。表2碳源对发酵产酶的影响


本发明公开了一种微生物催化不对称水解制备(-)γ-内酰胺的方法，属于生物工程技术领域。外消旋体2-氮杂二环-[2.2.1]-庚烷-5-烯-3-酮(以下简称(±)γ-内酰胺)。本发明方法利用从土壤中筛选获得的具有高对映选择性的(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株，鉴定为戴尔福特菌(Delftiasp.)，保藏号为CGMCCNo.5755；在水相体系中立体选择性水解(±)γ-内酰胺，制备(-)γ-内酰胺。在200g/L底物浓度条件下，产物(-)γ-内酰胺经萃取、蒸发浓缩、冷却结晶得到产物(-)γ-内酰胺的光学纯度95.0%－99.9%，化学纯度为95%－99%。该微生物催化不对称水解(±)γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺的方法具有高立体选择性、高反应产率和高产物浓度的特点。