一种调控木材发育的相关基因及其应用的制作方法[0002]随着社会经济发展和人口的不断增加，人类对能源的需求越来越多，由于化石能源是有限的，石油等产品的价格不断上涨，对经济的稳定持续发展造成威胁。[0003]可再生的生物质能是理想的替代能源之一，生物乙醇是目前最有前景和最主要的生物质能源。自20世纪70年代中期的石油危机以来，以美国和巴西为主的一些国家开始积极推行生物乙醇发展计划，本世纪以来，全球生物乙醇产量迅速增加。早期多利用粮食作物如玉米等作为原料生产乙醇，导致粮食价格上涨，与国家的粮食安全存在矛盾，不能进行大规模生产。近年来，欧美等国大量投入开展以木质纤维素为原料的生物乙醇生产技术和工业实践，同时积极培育适合本国的能源作物。我国也在积极的开展木质纤维素乙醇发酵的研究。[0004]木质纤维素乙 醇生产主要有四步:1预处理，破坏木质纤维素的结构，去除阻碍糖化和发酵的木质素等物质；2酸或酶水解纤维素和半纤维素成单糖；3用发酵菌将六碳糖和五碳糖发酵成乙醇；4蒸馏脱水纯化乙醇，使其达到作为能源的要求。其中第1、2步的生产成本过高，效率很低，严重限制了纤维生物质能源的发展，导致木质素生物乙醇生产成本居闻不下。[0005]此外，木质纤维素在造纸工业中也有广泛应用。目前主要有两大类造纸制浆工艺:机械法制浆和化学法制浆。机械法制浆通过机械分离纸纤维，不去除其中的木质素，可以得到高的纸浆产量，但是由于木质素的存在导致其可漂白率低，生产的纸张在光下易发黄。化学法制浆利用化学物质移除细胞壁中的木质素，可得到长而柔韧的纸纤维，从而可生产高品质的纸张。纸浆的漂白是制浆造纸工业另外一道重要工序，主要是通过化学物质进一步去除纸浆中的木质素或改变木质素发色基团，从而提高纸浆的白度和白度稳定性。传统的漂白剂多为含氯漂白剂，废水中含有具有强烈致癌性的有毒物质，对环境污染很大。[0006]因此本领域还没有一种适于生产生物燃料和造纸的木材植物，因此迫切需要研究调控木材发育的相关基因，并开发适用于生产可再生能源和造纸的木材品种。
[0007]本发明的目的就是提供一种调控木材发育的相关基因及其应用。
[0008]在本发明的第一方面，提供了一种PtMAN6多肽或PtMAN6多肽的编码序列，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.: 2所示，所述PtMAN6多肽的编码序列如SEQ IDN0.:1所示。
[0009]在本发明的第二方面，提供了 PtMAN6多肽或其编码序列的用途，所述用途任选自下组的一种或多种:[0010](1)降低木质部次生细胞壁的合成；
[0011](2)降低结晶纤维生物质的积累；
[0012](3)降低木质素(较佳地降低植物茎部木质素)的含量。
[0013]在另一优选例中，所述的PtMAN6多肽选自下组:
[0014](I)具有SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.: 17所示氨基酸序列的多肽；
[0015](II)将如SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.: 17所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的由(I)衍生的多肽；或
[0016](III)氨基酸序列与SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.: 17所示氨基酸序列的同源性≥90%(较佳地> 95%，更佳地98%)由(I)衍生的多肽。
[0017]在另一优选例中，所述的PtMAN6多肽的编码序列选自下组:
[0018]⑴编码具有SEQ ID N0.:2或SEQ ID N0.: 17所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0019](ii)序列如SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.: 16所示的多核苷酸；
[0020](iii)核苷酸序列与SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.: 16所示序列的同源性≥95%(较佳地> 98%，更佳地> 99%)的多核苷酸；
[0021](iv)如SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.: 16所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；或
[0022](V)与(i)-(iv)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0023]在本发明的第三方面，提供了一种改良植物性状的方法，所述的改良植物性状选自下组:(1)降低植物木质部的次生细胞壁合成；(2)降低植物结晶纤维生物质的积累；(3)降低植物木质素(较佳地降低植物茎部木质素)的含量；
[0024]所述方法包括步骤:提高所述植物中PtMAN6多肽或其编码序列的表达或活性。
[0025]在另一优选例中，所述方法包括步骤:将PtMAN6多肽的编码序列导入植物细胞中，培养所述植物细胞，再生成植物。
[0026]在另一优选例中，所述的植物为杨柳科植物，较佳地为杨树。
[0027]在本发明的第四方面，提供了一种启动子元件，所述的启动子元件是植物PtMAN6基因的启动子，并且所述启动子元件具有植物木质部导管细胞特异启动的功能。
[0028]在另一优选例中，所述的启动子元件不具有植物木质部形成层细胞特异启动的功倉泛。
[0029]在另一优选例中，所述的启动子元件选自下组:
[0030](a)具有如SEQ ID N0.:3所示序列的多核苷酸；
[0031](b)核苷酸序列与SEQ ID N0.: 3所示序列的同源性≥95% (较佳地≥98%，更佳地≥ 99%)，且具有植物木质部导管细胞特异启动功能的多核苷酸；
[0032](c)如SEQ ID N0.:3所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短1-60个(较佳地1-30，更佳地1-6个)核苷酸，且具有植物木质部导管细胞特异启动功能的多核苷酸。
[0033]在本发明的第五方面，提供了一种构建物，所述构建物含有外源基因以及与外源基因可操作连接的本发明第四方面所述的启动子元件。
[0034]在另一优选例中，所述外源基因选自下组:
[0035]抗性基因、筛选标记基因、抗原蛋白基因、RNAi基因、microRNA基因、生物制剂基因、或植物品质相关基因。
[0036]在本发明的第六方面，提供了一种表达盒，所述表达盒从5’至3’依次具有下述元件:本发明第四方面所述的启动子元件、基因ORF序列、和终止子。
[0037]在本发明的第七方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第四方面所述的启动子元件、或本发明第六方面所述的表达盒。
[0038]在本发明的第八方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第七方面所述的载体、或其染色体整合有外源的本发明第四方面所述的启动子元件、或其染色体整合有本发明第六方面所述的表达盒。
[0039]在本发明的第九方面，提供了第四方面所述的启动子元件、第五方面所述的构建物、或第六方面所述的表达盒的用途，用于特异性调控外源基因在植物木质部导管细胞的表达。
[0040]在本发明的第十方面，提供了一种在植物木质部导管细胞特异性表达外源基因的方法，包括步骤:
[0041](a)提供一构建物，所述构建物含有外源基因以及与该外源基因可操作地连接的第四方面所述的启动子元件；
[0042](b)将步骤(a)中的构建物导入植物木质部导管细胞，获得转化的木质部导管细胞。
[0043]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。



[0044]下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
[0045]图1显示35S: PtMAN6过表达载体结构。
[0046]图2显示35S: PtMAN6-GFP过表达载体结构。
[0047]图3显示35S: PtMAN6AS反义表达载体结构。
[0048]图4显示MAN6G瞬时表达载体结构。
[0049]图5显示MAN6sG瞬时表达载体结构。
[0050]图6显不了各种转基因植株表型。图6A显不Werstern Blot检测转基因植株结果；图6B显示过量表达PtMAN6 (0E)，野生型(WT)，反义表达PtMAN6 (AS)植株的表型，标尺为20厘米；图6C-图6E显示转基因植株叶柄机械强度，过量表达植株(图6D，0E)相对于野生型(图6C，WT)及反义表达植株(图6E，AS)叶柄变软，箭头示叶柄，标尺为10厘米；图6F-图6H分别显示图6C-图6E中植株茎杆叶柄中木质素的沉积，叶柄经徒手切片，间苯三酚染色，红色显示木质素的沉积，标尺为500微米。
[0051]图7显示转基因及野生型杨树茎中木质素沉积及木材组分的变化结果。图7A)-图7C):野生型(图7A)，PtMAN60E (图7B)，及PtMAN6AS (图7C)植株中14节茎的徒手切片间苯三酚染色，红色显示了木质素沉积，箭头标示髓细胞中木质素的积累；图7D-图7F:分别是图7A-图7C中黑框部分的放大图，箭头标示导管细胞中木质素的积累；图7G-图71:紫外检测野生型(图7G)，PtMAN60E (图7H)，及PtMAN6AS (图71)植株中12节切片，木质化的细胞自发荧光较强，呈蓝色，木质化较弱的细胞，自发荧光较弱呈紫色，箭头标示未成熟的导管细胞；图7J为转基因植株木材中ABSL木质素的比较结果，过表达PtMAN6植株(OE)中木质素显著降低；图7K为转基因植株木材中结晶纤维素的比较，过表达PtMAN6植株(OE)中结晶纤维素显著降低；图7L为转基因植株未成熟导管细胞的面积改变结果，所测导管为图G-1中箭头标示的导管；统计学分析采用T检验，*代表P〈0.05广代表P〈0.01，图7A-图7C中标尺为500 μ m ;图7D-图71中标尺为100 μ m，图7J-图7L误差线指的是统计的标准误。
[0052]图8显示1.5年生转基因杨树木材的高度及周长分析结果，其中，图8A显示过量表达PtMAN6杨树(0E)，反义表达PtMAN6的杨树与野生型(WT)杨树的树干高度没有明显差异；图SB显示0E、AS与WT杨树的树干基部的周长没有明显差异，统计学分析采用T检验。
[0053]图9显示了 PtMAN6的酶活性分析；其中，图9A为PtMAN6的最适pH测定结果，底物为溶于PH范围为3.0-8.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的l%AZCL-glactomannan悬浮液，WT和PtMAN6分别指从野生型及过表达植株成熟叶片中提取的酶蛋白(下同)；图9B显示PtMAN6的最适反应温度测定结果，底物为溶于pH5.0的0.1M柠檬酸-磷酸缓冲液的l%AZCL-glactomannan悬浮液；图9C显不PtMAN6去糖基化处理结果,Werstern杂交分析植物中提取的PtMAN6 (第一泳道)，及Endo Hf处理0.5小时(第二泳道)及I小时(第三泳道)的PtMAN6, M:预染的蛋白质标记物；图9D为糖基化影响酶活性结果,与对照(control)相t匕，PtMAN6经Endo Hf去糖基化2小时，酶活性约降低为原来的50%。
[0054]图10显示杨树中PtMAN6基因的定量PCR分析结果。分别从I年生杨树的木质部，韧皮部，幼叶，老叶以及茎顶端组织提取RNA进行定量RT-PCR分析，以杨树中Actin基因作为内参。
[0055]图11显示PtMAN6的免疫定位分析结果；其中，图1lA和图1lB为I年生野生型杨树第六节间的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图1lB是图1lA中黑框部位的放大图；图1lC为I年生野生型杨树第六节间的纵切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图1lD和图1lE为I年生野生型杨树茎顶端组织的横切图，显示PtMAN6定位于木质部导管细胞；图1lE是图1lD中黑框部位的放大图；图1lF为阴性对照，I年生野生型杨树第六节间的横切图，未能检测到任何定位信号。
[0056]图12显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜。图12A和图12B显示拟南芥根中稳定表达PtMAN6-GFP蛋白，该蛋白定位于质膜；图12C和图12D，30%蔗糖质壁分离拟南芥根细胞，显示PtMAN6-GFP蛋白定位于质膜；图12E为用于瞬时表达的载体；图12F为亚细胞组分的Werstern检测，M为标示蛋白分子，I为胞质组分，2为膜组分；图12G和图12H用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中`MAN6G载体；图121和图12J显示用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中MAN6sG载体；图12K和图12L用基因枪法在洋葱表皮细胞中瞬时表达图12E中CK的载体；A，C，G，I，K为GFP荧光图片；B，D，H，J，L为明场图片，标尺为 50 μ m。
[0057]图13显示过量表达PtMAN6的植株中次生壁形成相关转录因子的相对表达水平。RNA提取自I年生杨树木质部,野生型的表达被定义为I,杨树Actin基因作为内参。
[0058]图14显示了过量表达PtMAN6的植株中与次生壁组分合成基因的表达改变。图14A显示过量表达PtMAN6的植株中，木质素单体合成途径的基因以及木质素聚合相关基因受到抑制；图14B显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的纤维素合成基因CesA8的表达受到抑制；图14C显示过量表达PtMAN6的植株中，次生壁相关的木聚糖合成基因GT43B的表达受到抑制。RNA提取自I年生杨树木质部,野生型的表达被定义为I,杨树Actin基因作为内参。

[0059]本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现了一种新的PtMAN6多肽或其编码序列，所述PtMAN6多肽的氨基酸序列如SEQ ID N0.: 2所示，所述编码序列如SEQ ID N0.:1所示。此外，本发明还提供了植物中的PtMAN6基因及其编码的蛋白的用途，它们可以用于调控木质部的次生细胞壁合成和调控纤维生物质的积累；过量表达PtMAN6可以在植物中富集降解甘露聚糖类半纤维素的 甘露聚糖水解酶，同时由于PtMAN6的调控作用，该转基因植株中木质素含量降低，结晶纤维素含量降低，从而降低了木质纤维素乙醇生产和造纸的成本；此外，PtMAN6蛋白具有特异的导管细胞定位功能，其基因启动子能精确调控基因在木质部导管细胞中的表达。在此基础上完成了本发明。
[0060]术语
[0061]如本文所用，术语“本发明多肽”、“本发明蛋白”、“PtMAN6多肽”、“PtMAN6蛋白”、或“半纤维素甘露糖水解酶”可以互换使用。在一个优选例中，是指具有SEQ ID N0.:2或SEQID N0.: 17所示氨基酸序列的多肽，或其活性片段，或衍生物。
[0062]本发明的PtMAN6多肽优选来源于植物，较佳地来源于杨柳科，杨属、柳属、或钻天
柳属等。
[0063]如本文所用，术语“本发明基因”、“PtMAN6基因”可以互换使用，都是指来源于一种编码半纤维素甘露糖水解酶的核苷酸序列及其衍生序列。在本发明的一个优选例中，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.:1或SEQ ID N0.: 16所示。
[0064]本发明的PtMAN6基因优选来源于植物，较佳地来源于杨柳科，杨属、柳属、或钻天
柳属等。
[0065]如本文所用，术语“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
[0066]本发明的PtMAN6多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0067]本发明还包括具有调控木质部次生细胞壁合成和纤维生物质积累活性和功能的PtMANe蛋白片段和类似物。如本文所用，术语“片段”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然PtMAN6蛋白相同的生物学功能或活性的多肤。
[0068]本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是:(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的；或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽；或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽；或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
[0069]本发明还包括与本发明的PtMAN6多肽或蛋白具有50%或以上(优选60%以上，70%以上，80%以上，更优选90%以上，更优选95%以上，最优选98%以上，如99%)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异最好根据表I进行替换而产生。
[0070]表I
磁初的残基代表性的取代优选的取ft