基于协同组装的基因治疗药物递送系统的制作方法[0002]随着人类基因组计划的实施，一大批与人类疾病相关的基因相继被发现，这使人们对疾病的分子遗传机制有了更深刻的了解和认识，使基因治疗药物成为生物技术药物发展的重要领域之一。基因治疗(gene therapy)是将外源正常基因导入患者的特定组织和细胞进行适当的表达，以纠正或补偿因基因缺陷或异常引起的疾病，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗药物正在成为生物技术药物的重要组成部分，相比传统的蛋白质药物具有制备简便、特异性强、生物活性高等特点，除DNA外，近年来快速发展的siRNA、反义核酸、核酸适体(Aptamer)等新的基因治疗药物显示了广阔应用前景。[0003]作为负电性核酸类生物大分子，基因药物亲水性强，在血浆中易被核酸酶降解，半衰期很短，很难穿透脂性细胞膜到达细胞质或细胞核作用靶点，生物利用度极低，极大地削弱了基因的治疗优势，特别是全身用药的实际效果不佳。解决基因成药性问题主要有三类方法:(I)物理方法:基因枪、电穿孔和微注射。(2)化学方法:对基因药物进行化学修饰；[3]药剂学方法:用载体系统包载、保护和递送基因。物理方法仅是一种给药方法，对改善基因成药性并没有作用，而且该方法对靶细胞的选择有一定的局限性，且耗时、效率低，目前只能应用于皮肤、肌肉等有限的几种组织。化学修饰的方法也不能从根本上解决成药性问题，往往只能对某一、二种性质进行变化，如经化学修饰的siRNA-027作为治疗老年性眼黄斑退行性病变的局部用药，最终因毒副作用大而终止在二期临床试验。因此，载体系统成为基因药物进入临床应用的不可或缺的桥梁。[0004]目前用于基因药物传递的载体主要包括病毒性和非病毒性载体。病毒性载体虽然具有较高转染的效率，但其安全性差，具有免疫刺激性等严重问题极大的限制了在临床上的应用。非病毒载体因其低毒，低免疫反应，易于组装等优点而得到了广泛的关注和深入研究。非病毒载体一般为阳离子载体，其可以通过静电相互作用与负电性siRNA形成稳定的二元复合物，并通过胞吞作用将siRNA传递到细胞内。常见的用作阳离子载体材料有阳离子聚合物，如聚赖氨酸(PLL)，聚乙烯亚胺(PEI)，壳聚糖及其衍生物等。此外，阳离子脂质如2，3- 二油酰氧-N-[2 (精胺酸基酰胺)乙基]-N，N- 二甲基-1-丙基-三氟乙酸胺(DOSPA)等,市售阳离子脂质体试剂盒Lipofectamine2000常被用于体外siRNA递送的对照试剂。[0005]虽然这些阳离子载体在体外研究中具有巨大的潜在价值，但却因其会引起免疫、炎症反应及自身毒性使其在临床上的应用受到了极大的限制。目前，降低阳离子载体毒性的策略主要是减小其表面的正电性，可对阳离子载体材料进行减少用量或降低分子量、化学结构修饰，但是通过这些方法降低正电性来降低毒性的代价就是载体复合率和复合物稳定性的下降。而且化学结构修饰载体的方法也常常结合功能基团的修饰，例如用聚乙二醇(PEG)或透明质酸(Hyaluronic acid, HA)修饰PEI，但具有长循环作用的PEG的空间位阻在降低了 PEI的正电性及其与siRNA结合率的同时还阻碍了肿瘤细胞的内吞，而且PEG化载体在连续注射后，发生血衆快速清除效应(Accelerated blood clearance effect, ABC效应)。与化学修饰方法相比，应用适宜材料包覆脂质体复合物或聚合物复合物，使之具有正常生理环境能接受的电中性或负电性质，比前述直接降低材料正电性的方法更为普遍。这种基于物理相互作用以及包括有“复合”与“包覆”的组装过程称为“层-层组装”(Layer-by-Layer, LbL)技术。对于纳米复合物的表面包覆而言，这种依赖物理相互作用的方法存在严重的不足，如纳米复合物表面没有特定的结合位点，物理相互作用力复杂，在组装过程中特异性和识别能力差，纳米粒子的尺寸相对于分子来说较大，靠分子之间的弱相互作用很难进行稳定有效的组装等。除上述缺点外，在层层组装的具体实施中通常选用负电性聚合物通过静电作用包覆，静电作用力强于其它物理作用力如氢键、疏水键等，但是许多研究已经指出，在进行层层组装时负电性的聚阴离子很容易竞争结合复合物中的阳离子载体，将基因药物从二元复合物中置换出来，大大降低结合率或载药量。而且，这种依赖静电作用形成的包覆层稳定性仍然较差，在体内转运过程中易脱离或被血液中负电性组分如血浆蛋白等竞争而解组装，而且包覆量不易定量和控制，产品中存在的过量游离材料甚至可能干扰或影响递送系统的靶向功能。[0006]因此，克服现有物理层层组装方法的弊端和解决阳离子载体材料的安全性问题是提高基因成药性、促进基因药物有效递送和早日进入临床应用的两个关键科学问题。

[0007]本发明公开了一种药物脂质体，除了含有常规的药物、脂质、胆固醇外，还含有修饰剂和选自下列任一结构的炔基化衍生物: [0008]