专利名称：包含抗cd20抗体的高度浓缩的药物配制剂的制作方法包含抗CD20抗体的高度浓缩的药物配制剂本发明涉及供皮下注射用的，药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂。在较高量的抗CD20抗体或其混合物外，此类配制剂包含缓冲剂、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物、非离子型表面活性剂和有效量的至少一种透明质酸酶酶。本发明还涉及用于制备所述配制剂的方法及此类配制剂的用途。抗体的药学用途在过去数年里已经增加。在许多情况中，经由静脉内(IV)路径注射或输注此类抗体。不幸地，可以经由静脉内路径施用的抗体量受限于抗体的物理-化学特性，特别地受限于其在合适的液体配制剂中的溶解度和稳定性及受限于输注液体的体积。备选的施用途径是皮下或肌肉内注射。这些注射途径要求要注射的最终溶液中的高蛋白质浓度[Shire, S. J.，Shahrokh, Z.等，“Challenges in the development of highprotein concentration formulations，，, J. Pharm. Sci. 2004; 93 (6) : 1390-1402; Roskos,L. K. , Davis C. G.等，“The clinical pharmacology of therapeutic antibodies，，, DrugDevelopment Research 2004;61 (3) : 108-120]。为了增加体积，及由此增加治疗剂量(其可以安全且舒适地皮下施用)，已经提出了使用糖胺聚糖酶酶以增加可以注射抗体配制剂的间质空间[W02006/091871]。目前出售的治疗用途的药学活性抗体的稳定的配制剂的例子如下RITUXAN /MABTHERA (利妥昔单抗(Rituximab))是一种结合B细胞上的CD20抗原的嵌合抗体。商业配制剂是供静脉内(IV)施用的无菌的、澄清的、无色的、无防腐剂的液体浓缩物。利妥昔单抗以10mg/mL的浓度在IOOmg(IOmL)或500mg(50mL) —次性使用管形瓶中供应。在9mg/mL氯化钠、7. 35mg/mL脱水朽1檬酸钠、0. 7mg/mL聚山梨酯80、和注射用水中配制该产品。将pH调节至6. 5。利妥昔单抗的适合于IV施用的一种备选液体配制剂披露于美国专利No. 6,991,790中。HERCEPTIN (曲妥单抗(Trastuzumab))是一种针对HER2受体的单克隆抗体(抗HER2)，其目前在欧洲以150mg冻干粉末(含有抗体、二水合α，α -海藻糖、L-组氨酸和盐酸L-组氨酸和聚山梨酯20)形式销售，所述冻干粉末应当为了输注用注射用水重建以产生约21mg/ml的注射剂量。在美国和许多其它国家，销售装有440mg曲妥单抗的多剂量管形瓶。AVASTIN (贝伐单抗(Bevacizumab))是一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的单克隆抗体，其目前在欧洲以两类管形瓶中的液体配制剂销售分别为a)4ml中的IOOmg贝伐单抗和b) 16ml中的400mg贝伐单抗，提供含有下列赋形剂的注射用水中的25mg/ml终浓度二水合海藻糖、磷酸钠和聚山梨酯20。虽然已经发现了上述抗体配制剂适合用于静脉内施用，但是期望提供供皮下注射用的，治疗活性抗体的高度浓缩的稳定的药物配制剂。皮下注射的优点在于它容许医学从业人员相当短的干预中在对患者将其实施。此外，可以训练患者自己实施皮下注射。通常，经由皮下路径的注射限于约2ml。对于需要多剂的患者，可以在身体表面的多个部位注射多个单位剂量配制剂。皮下施用的下列两种抗体产品已经出售。HUMIRA (阿达木单抗(Adalimumab))是一种针对肿瘤坏死因子a (TNFa)的单克隆抗体，其目前在欧洲以用于皮下应用的，O. 8ml注射体积中的40mg剂量形式销售(浓度50mg抗体/ml注射体积)。X0LAIR (奥马珠单抗(Omalizumab))是一种针对免疫球蛋白E的单克隆抗体(抗IgE)，其目前以150mg冻干粉末(含有抗体、蔗糖、组氨酸和一水合盐酸组氨酸和聚山梨酯20)形式销售，所述冻干粉末应当用皮下注射用水重建以产生125mg/ml注射剂量。目前在市场上不可购得适合于皮下施用的高度浓缩的稳定的药物抗CD20抗体配制剂。因此，期望提供治疗活性抗体的此类高度浓缩的稳定的药物配制剂供皮下注射。对下皮注射胃肠外药物一般限于小于2ml的体积，这是由于皮下(SC)组织中对水力传导的此粘弹性阻力和注射后产生的反压力[Aukland K.和ReedR. , “Interstitial-Lymphatic Mechanisms in the control of Extracellular FluidVolume”，Physiology Reviews, 1993; 73:1-78],及由于疼痛的感觉所致。 高浓度蛋白质配制剂的制备是非常有挑战性的，并且需要使每种配制剂适合于所使用的特定蛋白质，因为每种蛋白质具有不同的聚集行为。怀疑聚集体至少在一些情况中引起治疗性蛋白质的免疫原性。针对蛋白质或抗体聚集体的免疫原性反应可以导致中和性抗体，其可以使治疗性蛋白质或抗体无效。似乎蛋白质聚集体的免疫原性在与皮下注射的关联时最成问题，由此重复施用增加免疫应答的风险。虽然抗体具有非常相似的总体结构，但是此类抗体在氨基酸组成(特别是在负责结合抗原的CDR区中)和糖基化样式方面有所不同。此外，另外可以有翻译后修饰，诸如电荷和糖基化变体。发明概述本发明提供了药学活性抗CD20抗体或此类抗体分子的混合物的高度浓缩的稳定的药物配制剂，优选地供皮下注射用。更具体地，本发明的药学活性抗CD20抗体配制剂的高度浓缩的稳定的药物配制剂包含-约20 至 350mg/ml 抗 CD20 抗体；-约I至IOOmM缓冲剂，其提供pH5. 5 ±2. 0;-约I至500mM稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物，其中任选地，甲硫氨酸作为第二稳定剂使用，优选地浓度为5至25mM ;-约0.01至0. 1%非离子型表面活性剂；和-优选地，有效量的至少一种透明质酸酶酶。发明详述本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且明确涵盖全长抗体、遗传工程抗体如单克隆抗体、或重组抗体、多克隆抗体、自至少两种全长抗体形成的多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、完全人抗体、及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指自基本上同质的抗体群体获得的抗体，即除了可以在单克隆抗体的生成期间生成的可能的变体(此类变体一般以少量存在)外，构成群体的抗体个体相同和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在其特异性外，单克隆抗体的有利之处在于它们不受其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体为自基本上同质的抗体群体获得的特征，并且不应解释为要求通过任何特定的方法生成抗体。例如，可以通过第一次由等，Nature, 256:495(1975)描述的杂K^hler交瘤方法来生成，或者可以通过重组DNA方法(见例如美国专利No. 4，816，567)来生成要依照本发明使用的单克隆抗体。也可以使用Clarkson等，Nature, 352:624-628 (1991)和Marks等，J. Mol. Biol.，222:581-597 (1991)中所描述的技术自噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”指单一氨基酸组成的抗体分子的制备物。因而，术语“人单克隆抗体”指具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的，展现出单一结合特异性的抗体。在一个实施方案中，人单克隆抗体是由杂交瘤生成的，所述杂交瘤包括与永生化细胞融合的自具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠获得的B细胞。本文中的术语“单克隆抗体”明确包括所谓的嵌合抗体，其中重和/或轻链的一部分与自特定物种衍生的或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与自另一物种衍生的或 属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4, 816, 567 ;及Morrison等,Proc. Natl. Acad. Sci.USA，81:6851-6855 (1984))。本文中感兴趣的嵌合抗体包括“灵长类化(primatized) ”抗体，其包含自非人灵长类(例如旧世界猴(Old World Monkey)、猿等)衍生的可变域抗原结合序列和人恒定区序列。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，一般至少包含其抗原结合部分或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2、和Fv片段；双抗体、单链抗体分子、免疫毒素、和自抗体片段形成的多特异性抗体。另外，抗体片段包含具有VH链特征，即能够与VL链装配在一起，结合CD20抗原的单链多肽。“抗体片段”还包含此类如下的片段，其本身不能提供效应器功能(ADCC/⑶C)，但是在与合适的抗体恒定域组合后以依照本发明的方式提供此功倉泛。“全长抗体”是包含抗原结合可变区及轻链恒定域(CL)和重链恒定域CHI、CH2和CH3的抗体。恒定域可以是天然序列恒定域(例如人天然序列恒定域)或其氨基酸序列变体。优选地，全长抗体具有一种或多种效应器功能。本文中的“氨基酸序列变体”抗体是具有与主要种类抗体不同的氨基酸序列的抗体。通常，氨基酸序列变体会与主要种类抗体拥有至少约70%的同源性，且优选地，它们会与主要种类抗体至少约80%，更优选地至少约90%同源。氨基酸序列变体在主要种类抗体的氨基酸序列内或附近的某些位置拥有替代、删除、和/或添加。本文中的氨基酸序列变体的例子包括酸性变体(例如脱酰胺化的抗体变体)、碱性变体、在其一条或两条轻链上具有氨基端前导延伸(例如VHS-)的抗体、在其一条或两条重链上具有C端赖氨酸残基的抗体等，并且包括对重和/或轻链的氨基酸序列的改变的组合。本文中特别感兴趣的抗体变体是相对于主要种类抗体，在其一条或两条轻链上包含氨基端前导延伸，任选地进一步包含其它氨基酸序列和/或糖基化差异的抗体。本文中的“糖基化变体”抗体是附着有与附着于主要种类抗体的一个或多个碳水化合物模块不同的一个或多个碳水化合物模块的抗体。本文中的糖基化变体的例子包括具有附着于其Fe区的Gl或G2寡糖结构，而不是GO寡糖结构的抗体、具有附着于其一条或两条轻链的一个或两个碳水化合物模块的抗体、没有附着于抗体的一条或两条重链的碳水化合物的抗体等，及糖基化变化的组合。此外，术语“糖基化变体”还包括糖工程化改造抗体诸如那些记载于WO I，331 ‘266和USP 7’ 517’ 670的。抗体“效应器功能”指那些可归因于抗体的Fe区(天然序列Fe区或氨基酸序列变体Fe区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fe受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC);吞噬；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调，等等。根据重链恒定域的氨基酸序列，全长抗体可以归入不同“类”。存在着5类主要的全长抗体IgA、IgD、IgE、IgG、和IgM，这些中的几种可以进一步分成“亚类”(同种型)，例如IgGl, IgG2、IgG3、IgG4、IgAjP IgA2。对应于不同类抗体的重链恒定域分别称作α [阿尔法]、S [德耳塔]、ε [厄普西隆]、Y [伽马]、和μ [谬]。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维结构是公知的。在本文中，单克隆抗体的“生物学活性”指抗体结合抗原，并且产生可以在体外或在体内测量的可测量生物学应答的能力。此类活性可以是拮抗的(例如在抗体是CD20抗体的情况中)或激动的。术语“人源化抗体”指其中的框架或“互补决定区”(OTR)已经进行过修饰以包含与亲本免疫球蛋白的特异性相比不同特异性的免疫球蛋白的CDR的抗体。在一个优选的实施方案中，将鼠CDR嫁接入人抗体的框架区中以制备“人源化抗体”。特别优选的CDR对应于那些代表下文对嵌合和双功能性抗体所记录的识别抗原的序列的。大体上，人源化抗体指来自接受体高变区的残基用来自具有期望特异性、亲和力和性能的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类的高变区的残基替换的人免疫球蛋白(接受体抗体)。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含在接受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。做出这些修饰以进一步改进抗体性能。一般地，人源化抗体会包含至少一个、通常为两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。任选地，人源化抗体还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区(见例如Riechmann, L.等，Nature 332 (1988) 323-327;及Neuberger, M. S.等，Nature 314(1985)268-270)。术语“嵌合抗体”指通常通过重组DNA技术制备的，包含来自一种来源或物种的可变区，即结合区和自不同来源或物种衍生的恒定区的至少一部分的单克隆抗体。包含鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体是特别优选的。此类鼠/人嵌合抗体是包含编码鼠免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码人免疫球蛋白恒定区的DNA区段的所表达免疫球蛋白基因的产物。本发明所涵盖的“嵌合抗体”的其它形式是那些其中类或亚类已经自初始抗体的类或亚类修饰或改变的。此类“嵌合”抗体也称为“类转换抗体”。用于生成嵌合抗体的方法牵涉本领域现在公知的常规重组DNA和基因转染技术(见例如Morrison, S. L.等，Proc. Natl.Acad Sci.USA 81 (1984)6851-6855;US 5，202，238 和 US5, 204，244)。 如本文中所使用的，术语“人抗体”意图包括具有自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk, Μ. Α.和van deffinkel, J. G. , Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374)。基于此类技术，可以生成针对极其多种祀物的人抗体。人抗体的例子记载于例如Kellermann, S. A.等，Curr. Opin.Biotechnol. 13(2002)593-597。如本文中所使用的，术语“重组人抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创建或分离的所有人抗体，诸如自宿主细胞诸如NSO或CHO细胞或者自对于使用转染入宿主细胞中的重组表达载体表达的人免疫球蛋白基因或抗体而言转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体。此类重组人抗体具有重排形式的自人种系免疫球蛋白序列衍生的可变和恒定区。依照本发明的重组人抗体已经进行过体内体细胞超突变。如此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然自人种系VH和VL序列衍生及与其相关，但在体内可以不天然存在于人抗体种系全集内的序列。如本文中所使用的，“特异性结合”指特异性结合CD20抗原的抗体。优选地，结合亲和力是10_9mol/l或更低(例如10_1(lmOl/l)的Kd值的，优选地具有10_1(lmOl/l或更低(例如10_12mol/l)的Kd值。用标准的结合测定法，诸如表面等离振子共振技术(B1ACORE )来测定结合亲和力。 如本文中所使用的，术语“核酸分子”意图包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链，但是优选的是双链DNA。“恒定域”不直接牵涉抗体对抗原的结合，但是牵涉效应器功能(ADCC、补体结合、和 CDC)。如本文中所使用的，“可变区”(轻链可变区(VL)、重链可变区(VH))意为直接牵涉抗体结合抗原的轻链和重链对之每种。人轻链和重链可变域具有相同的一般结构，并且每个域包含通过三个“高变区”(或互补决定区，CDR)连接的，其序列广泛保守的四个框架(FR)区。框架区采用片层构象，而⑶R可以形成连接b-片层结构的环。每条链中的⑶R通过框架区保持其三维结构，并且与来自另一条链的CDR —起形成抗原结合位点。抗体重和轻链CDR3区在依照本发明的抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，并且因此提供本发明的又一个目的。 术语“抗体的抗原结合部分”或“高变区”在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基。“框架”或“FR”区是与如本文中所限定的高变区残基不同的那些可变域区。因此，抗体的轻链和重链包含自N至C端的域？町、0)1 141 2、0)1 241 3、0)1 3、和FR4。特别地，重链的CDR3是对抗原结合贡献最大的区。CDR和FR区依照Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD(1991)的标准定义和/或那些来自“高变环”的残基来确定。术语“⑶20”和“⑶20抗原”在本文中可互换使用，包括由细胞天然表达的或者在用CD20基因转染的细胞上表达的人CD20的任何变体、同等型和物种同系物。本发明的抗体对⑶20抗原的结合通过灭活⑶20而介导对表达⑶20的细胞(例如，肿瘤细胞)的杀伤。可以通过下列一项或多项机制而发生对表达CD20的细胞的杀死细胞依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导细胞死亡和/或凋亡、同型聚集等。如本领域中认可的，⑶20的同义词包括B淋巴细胞抗原⑶20、B淋巴细胞表面抗原 BI、Leu-16、和 Bp35。依照本发明的术语“抗⑶20抗体”是特异性结合⑶20抗原的抗体。根据针对⑶20抗原的抗CD20抗体的结合特性和生物学活性，两种类型的抗CD20抗体(I型和II型抗CD20抗体)可以依照 Cragg, M. S.等，Blood 103 (2004) 2738-2743;及 Cragg, M. S.等，Blood101(2003) 1045-1051 区别，见表 I。表I :1型和II型抗⑶20抗体的特性本发明涉及供皮下注射用的，药学活性抗CD20抗体(诸如例如利妥昔单抗、Ocrelizumab或HuMab、或此类抗体分子的混合物)的高度浓缩的稳定的药物配制剂。特别地，本发明涉及作为组合配制剂或以共配制剂形式使用的，在合适量的抗CD20抗体外包含有效量的至少一种透明质酸酶酶的配制剂。所述配制剂另外包含至少一种缓冲剂(诸如例如组氨酸缓冲剂)、稳定剂或两种或更多种稳定剂的混合物(例如糖类，诸如例如α,α-海藻糖二水合物或蔗糖，和任选地作为第二稳定剂的甲硫氨酸)、非离子型表面活性剂和有效量的至少一种透明质酸酶酶。还提供了用于制备此类配制剂的方法及其用途。