一种抗cd20单链抗体的植物种子表达系统的制作方法【技术领域】，具体涉及抗CD20单链抗体基因及利用植物种子特异性表达启动子在植物种子中高效表达抗CD20单链抗体的方法。[0002]根据《2012中国肿瘤登记年报》显示，目前我国每年新发癌症病例约312万，因癌症死亡超过200万。恶性肿瘤已经成为我们城乡居民的第一位死亡原因。非霍奇金氏淋巴瘤(Non Hodgkin’s lymphoma, NHL)是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，其中绝大多数为B细胞淋巴瘤。CD20抗原是一种B细胞分化抗原，位于B细胞的表面，仅存在于成熟B细胞和B细胞前体中，在正常组织中不表达，而在95%以上的B细胞淋巴瘤中均有过量表达。这也使⑶20成为了治疗B细胞淋巴瘤的一个理想靶点。Rituxan (Rituximab，美罗华)为美国罗氏公司产品，是一种人鼠嵌合抗体。Rituxan于1997年获得FDA批准上市，是第一个被批准用于治疗恶性肿瘤的单克隆抗体。目前用于治疗低恶度、滤泡型B细胞淋巴瘤。[0003]随着对Rituxan治疗其他一些 自身免疫性疾病研究的深入，Rituxan在临床疾病治疗方面的潜在价值将会被进一步开发，社会对其的需求也越来越大。但是由哺乳动物细胞(CHO)生产的Rituxan需要昂贵的设备和培养基，从而增加了其生产成本，导致其价格高昂(一疗程的费用约20万元人民币左右)。[0004]利用植物反应器已经成功的表达了多种具有生物活性和功能的药用蛋白，其中包括单克隆抗体、疫苗抗原、治疗用酶、血液蛋白、细胞因子、生长因子和生长激素等。而以植物作为生物反应器则具有诸多的特点和优点:(I)可根据重组蛋白的需求来选择不同形式的表达体系，可分为整株表达和组织特异性表达，如种子、须根，以及悬浮细胞等；(2)大规模生产时具有较低的生产成本和灵活性；(3)植物具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译后修饰途径，从而获得有功能的活性蛋白；(4)较高的安全性，不携带动物病原体；(5)便于储藏和运输。[0005]尽管豆类和谷类等种子植物相对于叶类作物产生较少的生物量，但却为储存提供了极佳的条件。叶类作物在采样后，叶片需要冰冻或干燥以备运输，或立即进行处理；而成熟的种子却可以在室温下长时间存储。在长期的进化过程中，种子作为植物的贮藏器官，可以在很小的空间内积累大量的蛋白质，且种子中含有丰富的分子伴侣、适宜蛋白质折叠的环境以及较少的蛋白激酶。此外，大多数的种子体积较小，这样可以使表达的重组蛋白高度集中，虽然总生物产量并没有叶片植物高，但却有利于蛋白质的下游提取和纯化；而且植物种子表达重组蛋白，不会影响植物的生长。而通过将重组蛋白定向表达至液泡中存储，不仅可以获得完整的翻译后修饰，还可以提高重组蛋白的表达量。
[0006]本发明的目的是提供一种融合基因，抗CD20单链抗体基因，以及利用植物种子表达系统表达抗⑶20单链抗体基因，生产抗⑶20单链抗体。[0007]抗⑶20单链抗体基因，它包括:轻链可变区-重链可变区-连接肽-人免疫球蛋白G的Fe片段并且在其5’端加入了编码大麦a -Amylase的信号肽序列；
所述的抗⑶20单链抗体基因，其碱基序列如SEQ ID N0.1所示；
一种植物表达载体质粒，它是在植物表达载体中插入了上述的抗CD20单链抗体基因； 所述的植物表达载体为植物种子特异表达载体Pl301b ；
所述的植物种子特异表达载体Pl301b，是由下述方法构建的:人工合成了β -phaseolin的启动子和终止子序列，并在启动子两端分别添加Xho I和Nco I酶切位点，在终止子两端分别添加Hind III和Kpn I酶切位点；并通过KpnI和Bst EII双酶切的方法从pBASTA质粒上获得35S+Bar基因；同时利用Kpn I和Bst EII双酶切pCambial301，连入35S+Bar原件,构建中间载体pl301Bas。再通过酶切,连接反应将β-phaseolin的启动子和终止子原件连接至pl301Bas中；
抗CD20单链抗体，它是由下述方法生产的:
1、将上述的一种植物表达载体质粒，转化至根瘤农杆菌EHA105中；
2、再将根瘤农杆菌转染至植物中；
3、培育所述的植物，采集种子；提取抗CD20单链抗体蛋白；
所述的植物为拟南芥、红花、玉米或亚麻芥。
[0008]上述的抗CD20单链抗体在制备治疗非霍奇金氏淋巴瘤及自身免疫性疾病药物中的应用。
[0009]本发明提供了一种抗CD20单链抗体的植物种子表达系统，它是按VL-VH-Linker-hlgGlFc顺序，在基因的5’端有编码大麦a -Amylase信号肽序列的核苷酸序列，设计并人工合成了抗CD20单链抗体基因，将基因插入植物种子特异表达载体pl301b中，通过农杆菌介导法转化植株；将带有种子特异性启动子，抗CD20单链抗体基因和终止子的表达框整合进植物基因组中；筛选和培养出了带有上述基因的植株，进一步通过筛选和扩繁得到了纯合植株，该纯合植株所产生的种子中含有所述的抗CD20单链抗体；重组蛋白定向表达在液泡内；且表达的抗⑶20单链抗体具有生物学活性，对Daudi细胞的ADCC杀伤能力与Rituxan无显著差异。
[0010]采用本发明的方法生产抗⑶20单链抗体具有如下优点:
1、通过采用分泌型表达，重组蛋白可以获得正确的折叠，组装和修饰，并且定向储藏在液泡内，确保了重组药用蛋白的生物学活性的获得；
2、利用植物表达外源蛋白可以避免大肠杆菌内毒素和动物病原体的污染；
3、通过利用种子特异性强启动子，可有效提高重组蛋白的表达量；
4、利用植物种子表达系统生产抗CD20单链抗体，可以有效降低生产成本，同时有利于抗⑶20单链抗体的产业化。



[0011]图1是人工合成的植物密码子偏好性的抗人CD20单链抗体基因的酶切鉴定图；其中:1、DL2000, 2—4、质粒，5、对照质粒，6、DL15000 ;
图2是植物种子表达载体pl301-Ri的构建过程示意图；
图3是表达载体pl301-Ri的双酶切鉴定图；其中:1、DL2000，2、质粒；图4是表达载体pl301-Ri的结构详细示意图；
图5是转基因拟南芥种子的SDS-PAGE电泳图；其中:1、非转基因拟南芥，2—4、转基因拟南芥；
图6是抗人⑶20单链抗体在拟南芥种子中表达的Western Blot检测图；其中:1—6、转基因拟南芥，7、非转基因拟南芥；
图7是抗人CD20单链抗体的生物学活性检测图。

[0012]实施例1中间载体pl301b的获得
根据TC.Hall和McBride, Summerfelt等人文章公布的核苷酸序列，人工合成了β -phaseolin的启动子和终止子序列，并在启动子两端分别添加Xho I和Nco I酶切位点，在终止子两端分别添加Hind III和Kpn I酶切位点；并通过KpnI和Bst EII双酶切的方法从pBASTA质粒上获得35S+Bar基因；同时利用Kpn I和Bst EII双酶切pCambial301，连入35S+Bar原件,构建中间载体pl301Bas。再通过酶切,连接反应将β-phaseolin的启动子和终止子原件连接至pl301Bas中，构建成中间载体pl301b。
[0013]实施例2抗CD20单链抗体，即VL-VH-Linker-hlgGlFc的人工合成
委托江苏金唯智生物科技有限公司人工合成了植物偏好性密码子的基因序列，即编码大麦a -Amylase信号肽 序列的核苷酸序列,单克隆抗体C2B8的轻链可变区,连接肽,单克隆抗体C2B8的重链可变区，人IgGl的Hinge及CH2和CH3序列。此外，在合成序列的两端分别添加Nco I和Hind III酶切位点。其碱基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]实施例3抗⑶20单链抗体种子表达载体的构建
用Nco I和Hind III分别双酶切pi30Ib和含有上述单链抗体基因的质粒pUC57_Ri，将得到的约12000bp和1500bp的片段进行连接，得到抗⑶20单链抗体的植物表达载体pAmy-scFv—Fc。
[0015]实施例4农杆菌介导的拟南芥转化与筛选 1、农杆菌转化
利用冻融法将上述表达载体pAmy-scFv-Fc转入根瘤农杆菌菌株EHA105中。将7ul质粒加入IOOul农杆菌EHA105感受态细胞中轻轻混匀，冰浴30分钟；置于液氮中速冻2分钟，然后迅速置于37°C水浴锅中温育5分钟。加入ImL无抗生素的YEP，28°C条件下ISOrpm复苏2小时；复苏后取300ul菌液均匀涂布在含有卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的平板上，28°C倒置培养2天。挑选单独的菌落接种于含有卡那霉素50mg/L和利福平25mg/L的YEP液体培养基中，28°C过夜培养；
取2ul菌液作为菌液PCR检测的模板，反应条件为:94°C 5分钟，(94°C 30秒，56°C 30秒，720C I分钟)共30个循环，720C 10分钟，4°C 5分钟。反应结束后取20ul产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0016]2、拟南芥的转化和筛选
通过浸染花序法(Floral-Dip)转化拟南芥。
[0017]将上述含有目的表达载体的农杆菌于28 °C培养过夜，至0D600 ^ 2.00，4000rpm离心10分钟收集菌体；利用新鲜配制的重悬液(5%蔗糖，Selwet-77 300uL/L)将菌液浓度调节为0D600~0.8。取生长一个月左右，生长状况良好的植株，去除已经发育的荚后，利用浸染液浸染地上部分30s，去除多余浸染液后用保鲜膜包裹，避光放置48小时，后置于正常条件下生长，直至种子成熟。
[0018]Tl代种子完全成熟后收集阴干，将消毒后的种子均匀播种于含有草铵膦10mg/L的MS培养基上，置于4°C纯化48小时后移至光照培养箱中，在22°C，16光/8暗的条件下生长一周；选取抗性幼苗移入土中继续培养。待幼苗长大后利用叶片提取基因组DNA，进行PCR验证后收集阳性植株的种子用于进一步的分析。
[0019]实施例5转基因拟南芥的PCR检测
以上述获得的不同单株的基因组DNA为模板，分别利用位于单链基因两端的引物进行PCR检测，反应条件为:94°C 5分钟，(940C 30秒，56°C 30秒，72°C I分钟)共30个循环，72°C 10分钟，4°C 5分钟。反应结束后取20ul产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。反应结束后取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到预期的约1500bp的条带。
[0020]实施例6拟南芥种子总蛋白的提取
查取50粒拟南芥种子置于离心管中，用50ulTris-HCl (pH 8.0)进行研磨，研磨充分后加如10ul5X蛋白loadi ng buffer,于沸水中煮10分钟，于12000g离心30分钟。取15ul上清进行电泳。结果见图5，第一道为非转基因拟南芥种子总蛋白，第二道至四道为转基因拟南芥种子总蛋白，剪头所示为重组蛋白。
[0021]实施例7拟南芥种子中重组蛋白的Western Blot检测。
[0022]1、种子总蛋白的SDS-PAGE电泳和转膜
种子总蛋白用10%不连续Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶在Bio-rad公司的垂直电泳装置中进行分离，条件为60V电泳45分钟后改为100V至溴酚蓝抛出凝胶。电泳结束后利用Bio-rad公司的蛋白电泳转移设备，将蛋白转移至0.45umPVDF膜上，条件为100V电泳I小时。
[0023]2、膜的杂交
转移好的膜先用含有5%BSA的TBST封闭液封闭2小时，抗体选用HRP藕联的抗人IgG (H+L),以 1:1500 稀释后孵育，经清洗后使用 Pierce 的 Super Signal west picoChemiluminescent Substrate进行显色。Western Blot结果表明，在转基因拟南芥种子中有抗人⑶20单链抗体的表达，产物大小约为53kD，与预期一致。Western Blot分析结果见图6。
[0024]实施例7重组片段抗体的纯化 1、种子总可溶性蛋白的提取
称取500mg转基因拟南芥种子,液氮研磨充分后,加入50ml己烧镟润震荡10分钟,后离心5000g，30分钟，弃去上清后真空低温干燥。将干燥后的粉末再次液氮研磨，己烷提取，弃上清，真空低温干燥。用50mM磷酸缓冲溶液(pH7.4) 45mL重悬沉淀，冰浴30分钟。
[0025]将冰浴好的提取液20000g离心30分钟，小心吸取上清至一干净离心管中，先经
0.45 μ m抽滤，再利用0.22 μ m滤膜抽滤后获得蛋白提取液。
[0026]2、Protein A亲和层析纯化重组片段抗体
将预装柱HiTrap rProtein A FF (GE)连接至AKTA纯化系统，以50mM磷酸缓冲溶液进行平衡后，将0.22 μ m抽滤后的蛋白提取液上柱，经50mM磷酸缓冲溶液洗去杂蛋白，后利用0.1M柠檬酸缓冲液进行洗脱重组片段抗体。(注:收集管中预先加入100μ LpH9.0的IMTris-HCl缓冲液，每管收集Iml洗脱液)
实施例8拟南芥表达的抗人CD20单链抗体的生物学活性检测
1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离
无菌采集静脉血，注入含有肝素20U/ml的离心管中，轻轻混匀，加入等体积的PBS溶液；每管加入6ml平衡至室温的淋巴细胞分离液，倾斜离心管，沿管壁缓慢加入抗凝外周血6ml/管；20°C，800g离心30分钟，自然降速；用吸管轻轻插入毛玻璃样层，缓慢吸出外周血单个核细胞，放入另一 15ml离心管中；PBS稀释后加入无酚红RPM1-1640培养液调整细胞密度为6x107ml，加入160U/ml的IL-2预激活，置于37°C，5%C02细胞培养箱中备用。
[0027]2、细胞与抗体的作用
以Daudi为靶细胞，分别取对数期细胞，用无酚红的RPM1-1640重悬细胞至3X105/ml备用；设定培养基实验孔、背景孔、效应细胞+靶细胞自发释放值孔和效应细胞+靶细胞最大释放值孔，每种情况都设3个平行孔；将重组scFv-Fc和Rituxan稀释至浓度分别为100 μ g/mL、20 μ g/mL、4 μ g/mL、0.8 μ g/mL 和 0.16 U g/mL ;根据 CytoTox 96? (Progema,USA)非同位素法细胞杀伤检测试剂盒的说明在490nm进行吸光值的测定。抗人CD20单链抗体具有生物学活性，对Daudi细胞的ADCC杀伤能力与Rituxan无显著差异。见图7。