专利名称：重组抗体的组成以及制作和使用方法狂犬病是由狂犬病毒感染中枢神经系统引起的急性神经系统疾病，狂犬病毒属于棒状病毒家族。由于它的古老和可怕的自然属性，狂犬病毒在历史上非常重要，而且由于其在野外有广泛的宿主物种分布，它一直是人类以及牲畜感染的重要威胁。在世界的大部分地区，狂犬病毒在地区物种中是地方病，而不同地区的病毒变异体之间相似性很小。虽然在包括联合王国，澳大利亚，日本，以及各个岛屿上没有地方性狂犬病，英国和澳大利亚也已发现了狂犬病和蝙蝠相关的狂犬相关病毒。狂犬病毒为子弹形状的包被颗粒，平均75×180纳米。病毒颗粒包含一条单链负链RNA基因组和5个结构蛋白核蛋白分子(N)，磷酸蛋白(NS)，多聚体(L)，基质蛋白(M)，和病毒糖蛋白(G)。N蛋白和G蛋白都带有抗原决定簇，从而使各种狂犬病毒株带有不同的血清学特征。N决定簇在分离出的各种病毒株中高度保守，因此成为使用特异抗体进行免疫组织学检测的非常有用的靶标。另一方面，G蛋白抗原决定簇在各株病毒之间变异非常大。用疫苗产生的病毒中和抗体被检测出是抗G蛋白的。虽然已经很清楚，T细胞对G，N，NS都产生反应并在实验条件下参与免疫反应，对狂犬病毒的免疫性检测基本上限制在血清学方面，尤其是病毒中和抗体方面。在人的狂犬病常见的地区，狗是病毒的主要宿主。当狗狂犬病基本被疫苗消除的地方，狐狸，山狗，臭鼬，浣熊，蝙蝠以及许多哺乳动物可以携带病毒。在许多地方，野生动物携带的病毒仍在蔓延。而且，狂犬病毒能被通常与狂犬病毒无关的动物如猫，兔子等传递到人或其他宿主。狂犬病当临床症状一旦出现时几乎就是致命的，但感染者如果马上用被动和主动免疫联合治疗则可能被逆转。被动免疫包括注射从狂犬病毒免疫个体上得到的病毒中和抗体(人狂犬病免疫球蛋白，HRIG)或从超免疫马得到的中和抗体(马狂犬病免疫球蛋白，ERIG)。两者对受者均有一定的风险，包括不同病毒株的抗原特异性。HRIC是用提取的人血清制备的，因此可能被已知的或未知的人类病原污染。另一方面，作为异种抗原制备物，ERIC可能产生严重的过敏反应。鼠单克隆抗体被试图用作暴露于病毒后的预防，但如同ERIG，对人体也有抗原性。这将导致其很快被人体清除或可能产生过敏反应。人单克隆抗体的使用受限是因为人杂交瘤细胞系制备困难，不稳定，且在合理花费下不能产生足量的和特异性的单克隆抗体。单克隆抗体的生产成本使得人们试图寻找更经济的方法从杂交瘤中得到单克隆抗体。组成免疫球蛋重链和轻链可变区和铰链区的Fab和Fab2区域对狂犬病毒感染无保护作用，这已经非常清楚。抗体的体内效能依赖于整个序列，也意味着只有特定抗体才表现出抗狂犬病毒活性。抗体的固定区才有免疫反应性。因此，固定区的特性才是对狂犬病毒感染有保护作用。可变区与另一抗体的固定区结合，因此不是对狂犬病毒自然产生的抗体是无效的。在诊断，预防，治疗狂犬病毒感染中，对重组抗体产生了需求。需要制造和合成重组抗体，以及包含该抗体的药物成分和它的制造方法。
在诊断，预防，治疗攻击神经组织的病原感染中，对重组抗体产生了需求。需要制造和合成重组抗体，以及包含该抗体的药物成分和它的制造方法。
为提供更好的制剂，人的单克隆抗体的制备使用了EB病毒转化的狂犬病毒特异的人B细胞与鼠—人不均一杂交瘤细胞融合。组成编码抗体重链和轻链的cDNA克隆，使得抗体能在不同一的表达体系中表达。从而能从一个被控制的体系生产特异性中和狂犬病毒的人抗体并提纯。本发明是关于单克隆狂犬病毒中和抗体重链和轻链的核酸序列，以及编码蛋白的氨基酸序列。本发明还提供了使用此单克隆抗体作为有效治疗暴露于狂犬病毒个体的预防治疗的方法。
发明概述本发明提供了重组抗体，该抗体的组成和制备方法。根据本发明某些方面，本发明提供了重组抗狂犬病毒的抗体已经该抗体的组成和制备方法，本发明提供了重组抗体的特异性固定区，该固定区对攻击神经系统的病原特别有效。
本发明进一步涉及分离的DNA序列，产生上述序列的重组载体，包含上述载体的宿主细胞，以及使用上述宿主细胞制备重组抗体的方法。
本发明还涉及使用该重组抗体对病原感染神经组织，特别是狂犬病，进行诊断，预防和治疗。
本发明提供分离的核酸分子，其具备一条重链核酸分子和一条轻链核酸分子，分别编码一条重链氨基酸序列和一条轻链氨基酸序列。该重链和轻链氨基酸序列即单克隆狂犬病毒中和抗体，特异性与狂犬病毒蛋白结合。
本发明包括分离的核酸分子，共编码单克隆狂犬病毒中和抗体。核酸分子是从cDNA序列重链SEQ.ID.No1和轻链SEQ.ID.No2得到。
本发明涉及分离的人单克隆狂犬病毒中和抗体，该抗体由cDNA克隆编码抗体的重链和轻链，在不均一表达体系中表达，且经过纯化。该分离的人单克隆狂犬病毒中和抗体的氨基酸序列为重链SEQ.ID.No3和轻链SEQ.ID.No4。
本发明涉及一个融合的基因，该基因编码一个手性免疫球蛋白轻链，该手性轻链包含第一条DNA序列编码免疫球蛋白轻链可变区，该可变区属于由一个杂交瘤细胞系产生的单克隆狂犬病毒和抗体，以及第二条DNA序列编码一条人轻链固定区。本发明还包括一个表达这个融合基因的表达载体。为该表达载体提供一个宿主细胞是更远的目标。
本发明包括一个融合的基因，该基因编码一个手性免疫球蛋白重链，该手性轻链包含一个序列编码免疫球蛋白重链可变区，该可变区属于由一个杂交瘤细胞系产生的单克隆狂犬病毒和抗体，以及第二条DNA序列编码一条人重链固定区。本发明还包括一个表达这个融合基因的表达载体。为该表达载体提供一个宿主细胞是更远的目标。
本发明包括由一个从融合基因编码手性免疫球免疫球蛋白轻链和一个从融合基因编码的手性免疫球蛋白重链组合成的分离的单克隆狂犬病毒中和抗体。
本发明包括使用有效治疗剂量人单克隆狂犬病毒中和抗病毒中和抗体治疗暴露于狂犬病毒的个体的方法。该抗体由cDNA克隆编码抗体的重链和轻链，并将抗体提纯。从而防止病毒侵及中枢神经系统。
发明的详细说明本发明包括特异性结合到不同狂犬病毒株的糖蛋白的单克隆抗体。暴露后使用单克隆抗体的治疗，或混合使用不同单克隆抗体，将在病毒入侵处中和狂犬病毒，阻止病毒入侵中枢神经系统。因此，若皮下或肌肉组织暴露于狂犬病毒，可将狂犬病特异的单克隆抗体滴到被咬部位，同时全身应用。因为病毒复制几乎被限制在神经细胞，在其进入神经细胞之前，用单克隆抗体中和并清除是一种有效的暴露后预防。
本发明的一个方面是包含抗狂犬病毒的单克隆抗体序列。大部分MAb57的可变区是已知的(cheung等，J.Virol.666714-6720，1992，包含在参考文献中)，而固定区却还是未知的。包括固定区和可变区的整个单克隆抗体已被克隆和测叙。本发明包括了新发现的MAb57固定区核苷酸序列，核苷酸476-1413，包括固定域I(CHI)和铰链区。该序列可被用于重组抗体狂犬病毒抗体或抗其他攻击神经组织病原的抗体，如脑炎或疱疹。
本发明涉及重组抗体，编码抗体的克隆基因，克隆基因的载体和包含载体的宿主细胞。本发明还包含制备和使用重组抗体的方法。
本发明包括从MAb 57得到的重组抗体。从杂交瘤得到的MAb 57是IgG2抗体，从MAb 57得到的重组抗体是IgG1抗体。本发明涉及MAb 57得到的重组抗体，编码抗体的克隆基因，克隆基因的载体和包含载体的宿主细胞。本发明还包含制备和使用重组抗体的方法。
本发明包括抗狂犬病毒单克隆抗体MAb JA的全部重链和轻链序列。本发涉及含从MAb JA得到的重组抗体，编码抗体的克隆基因，克隆基因的载体和包含载体的宿主细胞。本发明还包含制备和使用重组抗体的方法。
本发明提供抗狂犬病毒单克隆抗体MAb JB.1的全部重链和轻链序列。本发明涉及从MAb JB得到的重组抗体，编码抗体的克隆基因，克隆基因的载体和包含载体的宿主细胞。本发明还包含制备和使用重组抗体的方法。
根据本抗体的构造，该抗体是一个单链抗体，其重链可变区和轻链可变区用一个空间基团连接，肽段为适宜。最为适宜的是一个单链抗体，其中重链可变区位于重组抗体的N端。此单链重组抗体还包含一个效应分子或一个单链，由其宿主细胞合成以帮助抗体加工。
本发明的重组抗体可被用于在感染细胞中检测狂犬病毒，应用应用免疫荧光染色法，或应用直接免疫涂点法，免疫复合物免疫沉淀法，或其他免疫反应如结合，交叉抑制或竞争放射或酶联免疫反应。
本发明还涉及该重组抗体的制作方法。本发明的重组抗体可用重组DNA技术包括在一定条件下培养宿主细胞以表达所述的抗体来制备。
最为特殊的是本发明涉及重组该抗体的制作及分离过程，包括培养宿主细胞，并用杂交载体将其转化，其载体包含一个表达体系，其中包括一个启动子和DNA编码序列，DNA编码被该启动子控制。
体外生产能提供大量的相对纯化的所需抗体。细菌、酵母菌、哺乳动物细胞培养技术已经很成熟，包括均一悬液培养如空气悬挂培养或持续搅拌培养，或固定细胞培养如在中空管中、微胶囊中、琼脂微粒或陶瓷片上。
降解序列根据遗传密码被降解，在编码过程中一些核苷酸被另一些核苷酸所代替，而不改变原先编码的氨基酸序列。此类降解序列可能因为它们有不同限制位点和/或不同的特定密码子频率，在不同的宿主中可能更合适，如大肠杆菌，而得到最佳的表达。
而且，本发明还涉及在作为混合载体的重组DNA中插入编码序列以得到目的抗体，以及复制起始点或自我复制序列，一个或多个标记序列，表达控制序列，以及更多限制位点。
载体在与宿主细胞协同作用时主要有二个功能。一个是促进编码免疫球蛋白的核酸的克隆，如提供足够的核酸(克隆载体)。另一个是给复制和表达重组基因提供合适的场所，或者作为染色体外元件，或者整合到宿主染色体中(表达载体)。一个克隆载体包括上述的重组基因，一个复制起始点或一个自我复制序列，主要标记序列，以及可能有的信号序列和一些限制位点。一个表达载体包括表达控制序列，它对重组基因的转录和翻译非常重要。
复制起始点或自我复制序列或者由载体提供，包括外源起始点如Simian病毒40(SV40)提供，或另一个病毒提供，或者由宿主细胞染色体提供。
标记物用来选择包含载体的宿主细胞。选择标记物包括对重金属抵抗的基因，如铜，或对抗生素抵抗的基因如G-418、潮霉素，或补偿宿主细胞缺陷的基因如胸腺嘧啶激酶缺失，次黄嘌呤磷酸转移酶缺失，二氢叶酸还原酶缺失等。
信号序列可能是前序列或分泌引导序列用于指导重组抗体的分泌，或剪接信号等。例如，从ompA基因，pelB基因或phoA基因得到的序列就是指导重组抗体分泌的信号序列。
作为表达控制序列，载体DNA包括一个启动子，即起始和终止转录以及固定mRNA必要的序列，可能还有增强子和其他调节序列。
基于宿主细胞的属性，多种启动序列可能被使用。作用强大而又能被调节的启动子是最有用的。Shine-Dalgarno序列就是一种起始翻译的序列。起始和终止转录及固定mRNA的必要序列一般分别位于病毒或真核cDNA的非编码5′端和3′端。增强子是刺激转录的病毒DNA序列，如Simian病毒，多瘤病毒，牛乳头瘤病毒，莫洛尼肉瘤病毒或者，尤其在鼠类，是基因组源性的。
载体DNA的多种DNA片段是联接在一起的，比如，它们可能相互连接并在功能上有相互关联。噬菌体就是一个适合在大肠杆菌中复制核表达的载体，如λ噬菌体，或质粒，如ColE1及其衍生物象pMB9，pSF2124，pBR317，pBR322以及pBR322的衍生物象pUC9，pUCK0，pHRi148和pLc24。合适的载体包括一个完整的复制子，一个标记基因，限制性内切酶的识别序列以便外源DNA和表达控制序列能被插入这些位点，可能还有信号序列和增强子。
微生物启动子是诸如λ噬菌体的强左向启动子PL，它被一个温度敏感的抑制子所控制。大肠杆菌启动子也比较合适如lac(乳糖)启动子，它被lac抑制子控制，被异丙基β-D-半乳糖苷诱导；trp(色甘酸)启动子，它被trp操控，并被色甘酸缺乏诱导；tac(杂交trp-lac)启动子，它被lac抑制子所调控。
适合在酵母中复制和表达的载体包含一个酵母复制起始和选择性的遗传标记物。一族这样的载体包括所谓的ars序列(自主复制序列)作为复制起始。这些载体在酵母细胞中存在于染色体外，并自主复制。而且，包含所有或部分2μm质粒DNA的载体也能使用。这些载体能与已存在于细胞中的2μm质粒整合，或自主复制。要得到高频转化和高拷贝数，2μm质粒尤为适用。
适合在酵母细胞中表达的表达控制序列是诸如那些高度表达的酵母基因。因此，TRP1基因，ADHI或ADH II基因，酸磷酸酶(PHO3或PHO5)基因，异细胞色素基因的启动子，或参与糖原分解通路的启动子，如烯醇酶，3磷酸甘油醛激酶(PKG)，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡糖六磷酸异构酶，3磷酸葡糖变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸异构酶，磷酸葡糖异构酶，和葡糖激酶基因均可被利用。
适合在哺乳动物细胞中复制和表达的载体最好具有病毒来源的启动序列，如Simian病毒(SV40)，Rous肉瘤病毒(RSV)腺病毒2，牛乳头瘤病毒(BPV)，乳多空病毒BK变异体(BKV)，鼠或人巨细胞病毒(CMV)。反过来，这些载体可能包含哺乳动物表达产物的启动子，乳肌动蛋白，胶原蛋白，肌凝蛋白等。或通常与目标基因序列相关的天然启动子和控制序列如免疫球蛋白H-链或L链启动子。
一些带有病毒复制系统的合适的载体能同时适应真核和原核宿主细胞。特别时带有Simian病毒启动子的载体，如pSVgpt或pSVneo，并且还包含一个增强子，如一个通常与免疫球蛋白基因序列相关的增强子，即鼠Ig H-或L-链增强子。
本发明使用了培养转化宿主细胞以及分离生产的DNA，用重组DNA编码重组抗体。
另外，本发明涉及用上述目的重组DNA转化宿主细胞，将编码重组抗体重链和/或编码重组抗体轻链的DNA转化如宿主细胞，也即将编码单链重组抗体的DNA转化如宿主细胞。
更确切的说，本发明涉及被一个杂交载体转化的宿主细胞，该杂交载体包含一个表达体系，其中包含一个启动子和编码重组抗体的DNA。
而且，本发明包括被一个杂交载体转化的宿主细胞，该杂交载体包含一个表达体系，其中包含一个启动子，与第一个编码信号蛋白的DNA序列连接，然后用合适的阅读框与第二个编码重组抗体的DNA序列连接。
合适的宿主细胞包括那些缺乏或少有限制性内切酶的微生物，如细菌特别是大肠杆菌E.coli X1776，E.coli Y1090，E.coli HB101，E.coli W3110，E.coli HB 101/LM1035，E.coli JA 221，E.coli DH5.alpha，E.coli K12，E.coli CC18菌株，枯草杆菌，脂嗜热杆菌，假单孢菌，嗜血杆菌，链球菌等，酵母菌类，如酿酒酵母类S.cerevisiae GRF18。更高级的宿主细胞包括已建立的人或动物细胞系，如人胚胎肺纤维母细胞L132，人恶性黑素瘤Bowes细胞，Hela细胞，SV40病毒转化的非洲绿猴肾细胞COS-7或中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，或淋巴来源的细胞，如淋巴瘤，骨髓瘤，杂交瘤，以及多瘤细胞如PAI，Sp2/0或X63-Ag8.653细胞。
本发明还涉及利用杂交载体制备合适的宿主细胞并进行挑选的过程。微生物的转化方法在文献中有记载。例如，酿酒酵母(A.Jinnen et al.，Proc Natl.Acad.Sci.USA 751929，1978)，枯草杆菌(Anagnostopoulos et al.，J.Bacteriol.81741，1961)，大肠杆菌(M.Mandel et al.，J.Mol.Biol.53159，1970)。
大肠杆菌的转化过程包括如对细胞进行钙预处理以便增加DNA摄取，并与杂交载体一起孵育。接下来选择转化成功的细胞，如在选择性培养基中根据载体DNA的标记序列将转化细胞挑选出来。不包含载体的细胞不能在选择性培养基中生长。例如，酵母细胞的转化包括用葡糖苷酶去除酵母细胞壁，在钙离子和聚乙烯乙二醇环境中将载体与得到的酵母细胞一起孵育，将处理过的细胞用琼脂包被以重新生成细胞壁。该琼脂可以同时对转化细胞进行选择。
对更高级的真核细胞诸如哺乳动物细胞可以用转染的方法进行转化。转染是用传统的方法，例如磷酸钙沉淀，微注射，原生质体融合，电穿孔，即用短暂电脉冲瞬间增大细胞膜的通透性以导入DNA，或利用辅助物质如二乙胺乙基葡聚糖，二甲亚砜，甘油或聚乙烯甘油醛等。转染后，转染细胞在选择性培养基中被检测并选择出，培养基有Dulbecco改良伊个尔格尔培养基(DMEM)，最少必要培养基，RPMI1640培养基等，可能含有相应的抗生素。
本发明的重组抗体可被由于定性或定量检测狂犬病毒的存在。总的来说，该重组抗体可被用于任何基于狂犬病毒抗原和抗体结合反应的免疫试验。这些免疫试验包括放射，荧光，化学发光，免疫沉淀，胶乳凝集以及血凝集试验，还有免疫染色方法。
本发明的重组抗体可作为酶联衍生物用于酶联免疫反应。任何已知的酶联免疫反应均能被使用，包括可溶相(均一)酶联免疫试验，固相(不均一)酶联免疫试验，单酶免疫试验和双酶(三明治)免疫试验，直接或间接检测狂犬病毒的存在。
例如，在三明治酶联免疫反应中，用上述单克隆抗体包被合适的载体，象微滴度板或试管的塑料表面，聚苯乙烯，聚丙烯聚氯乙烯，玻璃或塑料珠，滤纸，葡聚糖，醋酸纤维素膜，硝化纤维素膜，磁化颗粒等，可以单纯用浸泡吸收，也可用戊二醛或溴化氰活化载体。然后加入含狂犬病毒的测试液和结合上可检测的酶如碱性磷酸酶的重组抗体，测试液中狂犬病毒的含量与结合的重组抗体成比例，并能被加入酶底物的方法所检测到。酶底物反应可以导致象变色那样的能被眼所看到的变化，或其他测量方法。
本发明的抗体可作为放射活性标记衍生物被用于放射免疫法(RIA)。如上述的酶联免疫反应，任何已知的放免法的改良均可以使用。
使用放射标记可在酶联免疫检测试验中用比较的方法，如125I。与检测液中狂犬病毒量相关而形成的免疫复合物量可用检测免疫复合物的放射性来得到。
对冰冻保存活或石蜡包裹组织切片的活检材料做免疫染色冰冻切片，用含有本发明中抗体的液体处理，同时该液体中含有可检测到的酶。结合的重组抗体可用合适的酶底物处理来检测，比较理想的是在重组抗体的部位经酶底物作用产生固体沉淀(染色)。在带有酶的重组抗体部位，可以用含有streptavidin和生物素-酶结合的溶液处理，从而在重组抗体部位有更高的酶浓度，因此提高了免疫染色方法的敏感性。酶底物固体沉淀可用显微镜来检测，例如荧光显微镜或染色波长光扫描光密度。
根据本发明的抗体进行狂犬病毒的检测还包括其他已知的免疫试验，例如免疫荧光反应，用抗体包裹胶乳颗粒或用抗原包裹胶乳颗粒的胶乳凝集反应，抗体包裹的或抗原包裹的红细胞的血液凝集试验，用抗体包裹光学纤维或其他将结合反应变成电或光学信号的短暂光试验等。
本发明还涉及用该重组抗体进行定性或定量检测狂犬病毒的试剂盒。另外，可选择辅剂，阳性和/或阴性对照，缓冲液，指导和对结果的描述。
该重组抗体还能被用于对可能暴露与狂犬病毒的病人进行有效的预防，和对已感染狂犬病毒的病人进行治疗。
因此，本发明还涉及有效治疗剂量的重组抗体和合适的载体。胃肠外使用的途径是最佳的。肌肉、皮下、静脉应用则需要用浓缩制剂在使用前制成等张液体溶液或悬液。油性混悬液包括植物油，注射用合成或半合成油。药物成分可能经灭菌处理并可能包含辅剂，以便保存，稳定，湿化，雾化或溶解其中成分，为调节渗透压而添加盐，为调节粘滞度而添加缓冲剂和/或其他成分如羧基纤维素钠，羧乙酰纤维素，羧甲酰纤维素钠，葡聚糖，聚乙烯吡咯烷或明胶。
本发明的药物成分包含大约0.01％到50％的有效成分。可能用剂量单位的形式包装，比如安瓿或小瓶，或呈冻干固体形式。
总的说来，对哺乳动物的有效预防和治疗剂量大约在0.5μg到250μg每公斤体重，根据抗体种类，病人状态，应用方式而不同。具体使用哪种给药方式和剂量应由医生根据病人的情况，疾病的阶段来决定。本发明的药物成分用目前已知的方法制备，如传统的混合，溶解，膏剂，冻干制作。注射制剂用最新方法在无菌条件下装入安瓿或小瓶，并密封。
在某些时候本发明涉及括鸡尾酒抗体，即同时包含两个或更多本发明中的抗体。
实施例实施例1细胞用于杂交的人B细胞是从5位捐献者得到的。这些捐献者在第三次注射狂犬疫苗后7到21天抽取外周血。另外五位狂犬病免疫捐献者在加强剂量疫苗注射后10到21天抽取外周血。所有个体使用的疫苗是RabiVacTM人二倍体细胞疫苗(病毒株Pitman Moore1503-3M，Behringwerke，Marburg，FRG)。所有捐献者HIV和乙肝检测均为阴性。用鼠-人杂交不均一骨髓瘤细胞SHM-D33细胞作为杂交细胞(Teng，N.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，7308，1983)，B95-8 Epstein-Barr病毒转化的淋巴细胞作为EBV(Henderson et al.，J.Exp.Med.Vol 76，p.152，1977)病毒来源是从ATCC得到的(Rockville，MD)。
狂犬病毒为评估所制备的抗体中和不同狂犬病毒株的能力，一些抗原性固定的试验室病毒株和两种代表病毒株被应用。Evelyn-Rokitnicki-Abelseth(ERA)，鼠脑(CVS-24)或细胞培养(CVS-11)改良的，Pitman-More(PM)固定株均从Thomas Jefferson大学病毒库得到。与最近在美国发生的狂犬病毒病例相关的银毛蝙蝠狂犬病毒，属于狗狂犬病毒的山狗狂犬病毒/墨西哥狗狂犬病毒(COSRV)均从文献所述处得到(Morrimoto et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93，p.5653，1996)。病毒的纯化和制备糖蛋白(G)和核蛋白(N)如文献中所述Dietzschold et al.，World HelthOrganization，Geneva，p.175，1996)。
外周血单核细胞可用密度梯度离心法从全血中分离得到(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，具体方法见文献(Plebanski et al.，Immunology Vol.75，p.86，1992)。用单克隆抗CD2抗体包裹的磁性颗粒和磁性颗粒收集器(Dynal)去除T细胞(Dynal Inc.，Lake Success NY)。CD-2阴性细胞，大部分是B细胞，则被收集病保存起来(Swaminathan，1992)。在PRMI1640(Gibco BRL Life Technologies，Grand Island NY)中培养B95-8细胞使之融合供给10％牛胚胎血清(FBS；Gibco)，然后在干冰上裂解以释放EB病毒。1000RPM离心10分钟得到上清并用0.45μm滤器过滤，得到EB病毒。在4℃8000RPM，2小时条件下浓聚病毒，7×106B细胞(悬浮在1ml B95-8培养基中)和用25mlB95-8培养基制备的病毒在37℃孵育2小时。细胞感染后，用培养液洗二遍，置与96孔平底微滴定板上(Nunc，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)，1×104细胞每孔，在潮湿空气中37℃，5％二氧化碳和95％空气条件下培养。
人-鼠不均一杂交瘤的建立在EB病毒转化细胞培养了四周后，取上清并用ELISA检测狂犬病毒特异抗体的存在。阳性的则被先转移到1ml的培养板，然后又转移到2ml的培养板(48或24孔培养板，Nunc)。其上清液用快速荧光聚焦抑制试验(RFFIT)检测狂犬病毒中和抗体，在文献中又详细记载(Hooper，ASM Press，WA p.755，1997)。将生产中和抗体的细胞系和SHM-D33细胞(美国菌种保藏中心，编号CRL1668)用下述方法杂交。等量的SHM-D33细胞和EB病毒转化细胞(大约每种5×106个)放入无菌的聚苯乙烯圆底试管(Falcon，Fisher Scientific)，1000RPM离心10分钟。用无血清的培养液冲洗细胞二次，然后用100μl培养液制备成细胞混悬液。
试管在37℃水浴加热1分钟，再加入0.5ml热的50％(wt/vol)聚乙烯乙二醇(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO，cat.#P-7181)，在45秒内滴入并轻轻摇晃试管。在30秒钟以上慢慢加入3ml无血清培养液，就终止了融合反应，然后再于30秒以上慢慢加入9ml培养液。试管可以被允许在室温下保持8分钟，再放入37℃水浴2分钟。用500g离心3分钟，再将细胞团柔和地在30ml Iscove改良Dulbecco培养液(IMDM；Gibco)中重新制成混悬液。内含10％FBS和0.04μM哇巴因(Sigma)以便将未融合的细胞挑选去除。将细胞混悬液以1×104每孔的浓度分于96孔平底微滴定板，并孵育。
当杂交瘤细胞克隆建立后(大约培养六周后)，就可以用ELISA和RFFIT检测上清液中的狂犬病毒特异抗体产物。生产抗体的细胞用限制性稀释至少被克隆三倍。细胞倍置于96孔滴定板上，2倍稀释，从4个细胞每孔开始。扩增细胞以用于进一步的分析。
用ELISA分析狂犬病毒特异抗体可以用固定相ELISA分析抗体特异性和型。用5*g/ml狂犬病ERA病毒，糖蛋白，或核蛋白稀释于磷酸盐缓冲液(PBS)，在潮湿空间里，室温下过夜，包被平板(PolySorbTM，Nunc)。平板在加上上清样本前用5％奶粉PBS溶液浸泡并用含0.05％吐温20(PBS-Tween)的PBS冲洗。
在室温下孵育2小时后，平板用PBS-Tween冲洗以去除微结合的抗体，加入针对各种人重链同型体的不同的酶结合的或生物素结合的二级抗体，在室温下保留一小时。二级抗体通过在培养液中加入适当的底物生成可溶性终产物(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)加入到磷酸枸橼酸缓冲液中，或p-磷酸氮苯(PNPP)加入到0.1M甘油缓冲液中，Sigma)，或在加入抗生物素蛋白-磷酸碱(室温30分钟)和PNPP底物后。加入2M H2SO4后终止了过氧化物酶-TMB反应。用光度计可以读出平板的光吸收值，TMB产物用450nm波长，PNPP产物用405nm波长。
RFFIT用前述的快速荧光聚焦抑制试验(RFFIT)(Hooper，ASM Press，WA p.1997)可以检测每个转化细胞系的上清样本是否含有狂犬病毒特异性抗体。上清样本被稀释在96孔平底板上(Nunc)。已知能感染80％-90％的指示细胞的狂犬病毒被加到每一个样本中，在37℃下孵育1小时。试验也同时包括阴性培养液和阳性狂犬病免疫血清对照样本。孵育后，30μl 1.8×106细胞每毫升的幼仓鼠肾细胞(BHK)被加入到每个孔中，在37℃下孵育过夜。然后用冰PBS溶液冲洗平底板，再于-20℃用冰乙酮固定20分钟。固定后，去除乙酮，室温干燥。为检测被感染的BHK细胞，在37℃下每个孔中加入40μl FITC抗狂犬病毒核蛋白单克隆球蛋白(Centocor，Malvern PA)。用蒸馏水冲洗滴定板三遍，然后放在荧光显微镜下观察。
用亲和层析法纯化抗体用蛋白A柱(rProtein A SepharoseTMFast Flow，AmershamPharmacia Biotech)来纯化IgG1抗体。简单地说，上清液通过0.45μm膜过滤，并用1N NaOH将pH调整到8.0。将上清液用100cm/小时的速度通过层析柱，然后在pH8.0用PBS冲洗，用0.1M的醋酸溶液将抗体洗脱，最后用PBS透析。
用蛋白G柱(Protein G SepharoseTMFast Flow，AmershamPharmacia Biotech)来纯化IgG3抗体。含IgG3的上清液通过0.45μm膜过滤，并用1N NaOH将pH调整到7.0。将上清液用11cm/小时的速度通过层析柱。用PBS冲洗后，在pH3.0时用0.1M的甘油缓冲液将抗体洗脱，最后用PBS透析。
用甘露聚糖结合蛋白和前述的改良方法(Nevens et al.，J.Chromatogr，Vol.597，p.247，1992)纯化IgM抗体。简单地说，含IgM抗体的上清液用EDTA处理，用1M NaOH将pH调整到8.0，过滤并降温到4℃。在4℃将甘露聚糖结合蛋白-琼脂(Sigma)和含0.1MNa**CO3/0.5M NaCl的缓冲液一起冲入层析柱，调整pH到8.3，然后加入上清液，并在4℃孵育15分钟。再用结合缓冲液冲洗层析柱，置于室温一小时。再室温用结合抗体将IgM抗体洗脱并用PBS透析。
用如下的蛋白检测试验(Bio-Rad Laboratories，Hercules CA)来检测所制备抗体的蛋白浓度。将100μl的样本加到5ml 1/5稀释的染剂浓缩物中，再室温下孵育10分钟。阴性PBS对照和牛血清白蛋白标准剂也包括在试验中。孵育后，用595nm波长光在分光光度计中读数。对照BSA的吸光度可以计算出受试样本的蛋白浓度。所有抗体制剂的纯度可以用12.5％聚丙烯酰胺凝胶在还原状态下(SDS-PAGE)电泳来测试。纯化的抗体在SDS-PAGE上显示两条区带分别对应游离的免疫球蛋白重链和轻链。
CDNA克隆的制备、分离和测序用RNAzol B(休斯顿Biotecx实验室)从JA杂交瘤细胞中分离出全部的RNA。以鸟粒细胞白血病病毒逆转录酶(Promega)和寡聚脱氧胸腺嘧啶引物在42摄氏度的条件下进行1个小时的逆转录酶反应。其产物的一部分可用来做聚合酶链反应(PCR)扩增，该PCR反应的引物包括重链特异性的IgG-HF1引物(5’-ACCATGGAGTTTGGGCTGAG-3’(SEQ.ID.NO5)，起始密码子；下划线，附加物#Y14737)，还有IgG-HR2引物(5’-ACTCATTTACCCGGGGACAG-3’(SEQ.ID.NO6)，终止密码子；下划线，附加物#Y14737)，还包括轻链特异性的IgG-LF5引物(5’-AGCATGGAAGCCCCAGCTCA-3’(SEQ.ID.NO7)，起始密码子；下划线，附加物#M63438)，及IgG-LR2引物(5’-CTCTAACACTCTCCCCTGTTG-3’(SEQ.ID.NO8)，终止密码子；下划线，附加物#M63438)。扩增首先在94摄氏度60秒内经35次变性，在50摄氏度下退火60秒，在72摄氏度下以TaqDNA聚合酶(Promega)催化聚合90秒。PCR产物(重链1.4kb，轻链0.7kb)用特异性的引物制备的AmpliTaq cycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)来纯化和测序。PCR产物被克隆进TA克隆载体，pCR2.1(Introgen)。克隆的重链和轻链cDNA用特异性的引物制备的AmpliTaq cycle测序试剂盒(Perkin-Elmer)来测序。
单克隆狂犬病毒中和抗体编码序列本项发明提供了单克隆抗体cDNA和与之互补的单克隆抗体核酸序列。具体地说，单克隆抗体cDNA序列提供了来自JA克隆的单克隆抗体的重链(SEQ.ID.NO1)和轻链(SEQ.ID.NO2)，而不包含内含子。
本发明也提供了单链寡聚核苷，它们可充当放大单克隆抗体编码片断的PCR引物，例如单克隆抗体的可变或超可变区就是这样的片断。该寡聚核苷序列具有一个至少包含8个核苷的可与单克隆抗体基因杂交的区域，而另一个寡聚核苷具有与处于同一单克隆抗体基因下游的某一序列反向互补的序列。这样每种寡聚核苷引导合成的方向都彼此朝向对方。上述寡聚核苷链的最适长度是10-35个核苷。
本发明提供了杂交瘤JA克隆(分别为SEQ.ID.NO1和SEQ.ID.NO2)产生的单克隆抗体重链和轻链的全长cDNA序列，以及其编码的重链多肽(SEQ.ID.NO3)#1-474氨基酸和轻链多肽(SEQ.ID.NO4)#1-234氨基酸。
确切地说，本发明涉及与杂交瘤JA克隆产生的单克隆抗体的核酸序列有关。更通俗的讲，杂交瘤JA克隆是制备单克隆抗体cDNA的基础。
单克隆狂犬病毒中和抗体的功能等价物该项发明也包含了本说明中描述的这种抗体的功能等价物。功能等价物具有与抗体类似的结合特性，它们包括了手性单链抗体及其片断。制备这种功能等价物的方法描述于PCT申请WO 93/21319，第239,400号欧洲专利；PCT申请WO 89/09622；欧洲专利338,745；以及欧洲专利EP 332,424。
功能等价物包括其氨基酸序列与该抗体高可变区的氨基酸序列几乎相同的多肽。此处“几乎相同”的氨基酸序列定义为与另一氨基酸序列相比有至少70％，最好80％甚至90％以上的同原性，该同原性由Pearson和Lipman的FASTA方法可以测定(Proc.Natl.Inst.Acad.Sci.USA 85，2444-2448，1988)。手性抗体分子的稳定区几乎只来源于人类抗体分子的稳定区，而可变区则几乎只来源于每种稳定的异体杂交瘤所产生出的单克隆抗体的可变区序列(Champion，J.M.，等，Journal of Immunological Methods，23581-90，2000)。
单链抗体或Fv片断是一种多肽，它由抗体的重链可变区构成，该区依靠或不靠连接物与轻链可变区相连。这样，Fv构成了整个抗体的结合位点。
功能等价物还包括各种抗体片断，这些片断与完整抗体的结合特性相同或几乎相同。这种片断可能包含一个或全部两个F(ab’).sub.2 fragment的Fab亚区。最适的抗体片断包含所有的完整抗体决定区的s*互补区，但是含有较少该区，例如3个、4个或5个互补决定区的抗体片断也同样具有功能。这些功能等价物属于IgG免疫球蛋白家族及其中的亚组，但也可能属于其它任何一种免疫球蛋白及它们的亚组或者与之结合例如IgM、IgA、IgD、或IgE。各种亚组例如IgG的亚组的重链，决定了不同的效应器功能，这样，选择所需的重链稳定区，就能产生具有所需效应器功能的手性抗体分子。最为理想的稳定区有gamma1(IgG1)、gamma3(IgG3)和gamma4(IgG4)。而轻链稳定区可以是卡帕(kappa)或(莱姆达)lambda型。
本发明包括的免疫球蛋白可以是单价、二价或多价。单价免疫球蛋白是由一条手性重链与一条手性轻链通过二硫键结合的二聚体(HL)。二价免疫球蛋白是由两个二聚体通过至少一个二硫键结合而成的四聚体(H2L2)。
标准重组DNA技术标准重组DNA技术可查阅Cold Spring Harbor Laboratory出版社(1987)出版的《分子克隆》第二版，著者为Sambrook等，以及Green Publishing Associates/Wiley-Interscience，New York(1990)的《现代分子生物学规范》，著者为Ausubel等。
简言之，选择合适的含有所需DNA的核酸分子的细胞作为原料，例如可表达某种抗体或抗体等价物者。以标准程序从原料制备出全部的RNA。这些RNA用于指导cDNA的合成。分离RNA与合成cDNA的标准方法可见于以上列举的分子生物学手册。
可通过已知的方法来扩增cDNA。例如，以cDNA作为模板并通过PCR反应来扩增；参见Saiki et al.，Science，239，487，1998或Mullis et.al.，US Pat.No.*83195。作为PCR扩增引物的核苷序列是从已知的待扩增序列衍生出的。这种寡聚核苷可通过已知的方法合成。这些方法可参见Caruthers in science 230，281-285，1985。
上游和下游的寡聚核苷可用于做PCR扩增。针对每一特定引物对均按标准方案优化反应条件。以电泳等方法分析PCR产物，来确保cDNA的大小与两个引物之间的序列相符。
或者，编码区可被扩增为2个或多个重叠片断。重叠片断应包括一个保守位点，以便使完整的cDNA组装于此。
例如，为分离出每种异体杂交瘤细胞系产生的每种单克隆抗体的重链和轻链蛋白编码区，上游的寡聚核苷PCR引物就要与5’端的序列互补，后者包含了ATG起始密码子和其上游的至少5-10个核苷。下游的寡聚核苷引物与所需DNA的3’端序列互补。产物cDNA编码了每种单克隆抗体的全部重链与轻链，包括终止密码子。
待扩增的cDNA，例如编码抗体或抗体等价物者，可在很多种宿主细胞中通过多种克隆载体来复制。宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。
结合单克隆抗体cDNA的载体可由染色体、非染色体和合成的DNA序列构成。有些合适的原核细胞克隆载体包括但不仅仅限于大肠杆菌质粒，例如colE1、pCR1、pBR322、pMB9、pUC、pKSM和RP4。原核细胞载体还包括，但亦不仅限于噬菌体DNA的衍生物，例如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。
携带拟表达单克隆抗体的cDNA的载体转染宿主细胞，如下文所述。宿主细胞以合适的培养基保存，在适宜的条件下细胞与载体得以不断复制。
手性抗体分子一般情况下，针对手性免疫球蛋白的每一种重链和轻链成分，制备的手性抗体分子的融合基因首先包括一个DNA片断，该片断至少编码了人狂犬病毒特异性中和抗体的功能区，该功能区多为糖蛋白。可变区连接于(例如，因加入片断而使可变区的功能重排)下一个DNA片断，后者至少编码稳定区的一部分。每一融合基因都组装或插入一个表达载体当中。在适宜的条件下培养转染宿主细胞，以使融合基因得以表达，并使表达产物免疫球蛋白或其多肽链易于收获。
编码免疫球蛋白重链和轻链可变区的基因可从淋巴细胞中获得，后者能产生单克隆狂犬病毒中和抗体。例如，产生抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体的异体杂交瘤细胞系就可提供这种手性抗体分子可变区。通过标准克隆技术可从人类抗体分泌细胞中获得所需的稳定区。另外，由于基因代表了两类轻链，并且特定种类的重链已被克隆，人类的稳定区从这些克隆中很容易获得。手性抗体分子的结合片断比如F(ab’).sub.2和Fab等可通过设计出的手性重链基因截取。例如，编码F(ab’).sub.2重链部分的手性基因应包括编码重链CH1区和铰链区的DNA序列。此外，这些片断还可通过对某种手性免疫球蛋白分子的酶切获得。比如，以木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶切可分别获得Fab和F(ab’).sub.2片断。
编码手性重链与轻链及其亚区的融合基因最好是与两种不同的表达载体组装，后者可协同转染同一种宿主细胞。每种载体包含两个可被筛选的基因，其中一种可被某种细菌系统筛选，另一种被某种真核细胞系统筛选，而每一载体所含的基因对组成不同。这些载体能在细菌环境中生产和扩增所需的融合基因，并随后协同转染真核细胞，然后再筛选这些受到转染的细胞。可在细菌环境中受到筛选的基因包括氨比西林耐药基因和氯霉素耐药基因以及此类的其它各种基因。有两种真核细胞宿主的可筛选基因受到青睐(1)黄嘌呤—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)；(2)Tn5磷酸转移酶基因(又称neo)，但合适的基因亦不仅限于罗列的两种。Gpt的筛选是基于如下原理该基因所编码的酶可以黄嘌呤作为底物来合成嘌呤核苷，而类似的其它内源性的酶却不具此能力。在含有黄嘌呤和霉酚酸的基质中，因后者阻断了一磷酸次黄嘌呤转化为一磷酸黄嘌呤，只有表达gpt基因的细胞能够存活。而neo的产物使抗生素G418及其它类似抗生素对真核细胞蛋白合成的抑制作用受到阻断。在真核细胞中，这两种筛选过程可同时或先后用来筛选出导入两种不同的DNA载体的免疫球蛋白链基因。
表达系统由于基因本身可以退化，本发明的领域还包括了另一些DNA序列，后者编码的重链和轻链氨基酸序列与前述几乎相同或有等价的功能。本发明可能涉及的这些不同的DNA序列是通过在原有序列基础上删除、增加或替换不同的核苷残基来实现的，而基因经上述改变后的产物却与原来的相同或功能等价。基因表达产物本身亦可出现重链或轻链序列中的氨基酸残基的丢失、增加和替换，而其结果导致隐性改变，产生出另一种功能等价的单克隆抗体。
依照本发明，所需的核苷序列被插入适当的表达载体，该核苷序列编码了单克隆狂犬病毒中和抗体的重链和轻链及其片断或类似物。这种载体包含了使插入的蛋白编码序列转录和翻译出来所必需的成分，它们构成重组DNA分子以指导免疫球蛋白重链和轻链的表达，再进一步装配成单克隆狂犬病毒中和抗体。
理想的宿主细胞系是骨髓瘤细胞。这种细胞可以合成、组装及分泌免疫球蛋白，而后者是由转染的免疫球蛋白基因编码。此外，这种细胞还能使分泌的免疫球蛋白糖基化。最为理想的宿主细胞是本身不分泌免疫球蛋白的骨髓瘤细胞系，例如Sp2/0。这种细胞将只分泌转染的免疫球蛋白基因编码的产品。骨髓瘤细胞可在培养基中生长，也可植入小鼠的腹膜，通过腹水收获分泌的免疫球蛋白。其它的淋巴细胞如B细胞或杂交瘤细胞亦可作为合适的宿主细胞。
有数种方法使携带免疫球蛋白编码基因的载体转染淋巴细胞。一种将DNA导入淋巴细胞的理想方法是通过电打孔。按照该方法，在目标DNA存在的环境中，宿主细胞将接受一次电击。另一种导入DNA的方法是通过原生质融合。按照这种办法，含有免疫球蛋白基因重组质粒的细菌被溶解酶剥去细胞壁。产生的原生质球通过聚乙二醇处理与骨髓瘤细胞融合。融合完成后，再筛选并分离出转染成功的细胞。还有一种导入DNA的技术是通过磷酸钙沉淀。
免疫球蛋白基因也可在非淋巴细胞中表达，例如在细菌或酵母菌中。当在细菌中表达时，免疫球蛋白重链和轻链变成包涵体的一部分。所以，重链与轻链都必须先分离和提纯，然后再组装成具有功能的免疫球蛋白分子。还有其它的方法在大肠杆菌中表达出产品(参见Pluckthun，A，BioTechnology 9545-551，1991；Skerra，A.etal.，BioTechnology 9273-278，1991)，包括以融合蛋白的形式由大肠杆菌分泌，该融合蛋白含有一段信号序列。
实施例2
已经知道两种抗狂犬病毒单克隆抗体MAb57和MAb JB.1的全部序列。上述单克隆抗体可与各种狂犬病毒株的糖蛋白特异性结合。与预防性给药一样，以单克隆抗体混合剂进行暴露后治疗，能够在伤口原位中和狂犬病毒并阻止病毒侵入中枢神经系统(CNS)。对于通过破损皮肤或粘膜暴露于狂犬病毒者，应在伤口原位注射特异性单克隆抗体混合剂，同时结合以全身给药。因为病毒复制几乎只局限于神经元细胞，所以有效的暴露后预防措施是在其侵入CNS之前以本发明提供的单克隆抗体中和与清除病毒。
抗狂犬病毒单克隆抗体混合剂可用于治疗已经暴露于病毒或者有高暴露风险的人群。对于各种可逃避中和的狂犬病毒变异株，本发明提供的单克隆抗体混合剂均能有效抑制其复制。因为混合剂中的每种单克隆抗体均特异地针对狂犬病毒不同街毒株的抗原决定基当中的一种。
人抗狂犬病毒抗体MAb JB.1的重链核苷序列为SEQ ID NO9。人抗狂犬病毒抗体MAb JB.1的重链氨基酸序列为SEQ ID NO10。人抗狂犬病毒抗体MAb JB.1的轻链核苷序列为SEQ ID NO11。人抗狂犬病毒抗体MAb JB.1的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO12。人抗狂犬病毒抗体MAb 57的轻链核苷序列为SEQ ID NO13。人抗狂犬病毒抗体MAb 57的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO14。人抗狂犬病毒抗体MAb57的重链核苷序列为SEQ ID NO15。人抗狂犬病毒抗体MAb 57的重链氨基酸序列为SEQ ID NO16。
序列表<110>道格拉斯·C.·胡珀伯恩哈德·迪奇奥德<210>1<211>1430<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>1accatggagt ttgggctgag ctggcttttt cttgtggcta ttttaaaagg tgtccagtgt 60gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc120tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatgcca tgagctgggt ccgccaggct180ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtgcta gtggtcatag cacatatttg240gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat300ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagatcga360gaggttacta tgatagttgt acttaatgga ggctttgact actggggcca gggaacccgg420gtcaccgtct cctccgcctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc accctcctcc480aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa540ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct600gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc660ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac720aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct780gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg840atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag900gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg960gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1320gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtccccgg gtaaatgagt 1430<210>2<211>708<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>2agcatggaag ccccagctca gcttctcttc ctcctgctac tctggctccc agataccacc 60ggagaaattg tgttgacaca gtctccagcc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc120accctcgcct gcagggccag tcagactgct agcaggtact tagcctggta ccaacagaaa180cctggccagg ctcccagact cctcatctat gatacatcca acagggccac tggcatccca240gccaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tctccatcag cagcctggag300cctgaagatt ttgcagttta ttactgtcag cagcgtttca actggccgtg gacgttcggc360caagggacca aggtggaatt caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg420ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc480tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc540caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg600acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag660
ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708<210>3<211>474<212>PRT<213>人类(Homo sapien)<400>3Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly1 5 10 15Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln20 25 30Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe35 40 45Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Ala Ser Gly His Ser Thr Tyr Leu Ala65 70 75 80Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Arg Glu Val Thr Met Ile Val Val Leu Asn115 120 125Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser130 135 140Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lysl45 150 155 160Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr165 170 175Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser180 185 190Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser195 200 205Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr210 215 220Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys225 230 235 240Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys245 250 255Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro260 265 270Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys275 280 285Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp290 295 300Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu305 310 315 320Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu325 330 335His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn340 345 350Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly355 360 365Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu370 375 380Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr385 390 395 400Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn405 410 415Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn435 440 445Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr450 455 460Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys465 470<210>4<211>234<212>PRT<213>人类(Homo sapien)<400>4Met Glu Ala Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro1 5 10 15Asp Thr Thr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser20 25 30Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ala Cys Arg Ala Ser Gln Thr35 40 45Ala Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro50 55 60Arg Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala65 70 75 80Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser85 90 95Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe100 105 110Asn Trp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe Lys Arg115 120 125Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln130 135 140Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr145 150 155 160Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser165 170 175Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr180 185 190Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys195 200 205His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro210 215 220Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230<210>5<211>20<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>5accatggagt ttgggctgag20<210>6<211>20<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>6actcatttac ccggggacag20
<210>7<211>20<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>7agcatggaag ccccagctca20<210>8<211>21<212>DNA<213>人类(Homo sapien)<400>8ctctaacact ctcccctgtt g 21
SEQ ID NO9ATGGACACACTTTGCTCCACGCTCCTGCTGCTGACCATCCCTTCATGGGTCTTGTCCCAAATTACCTTGAAGGAGACTGGTCCTACGCTGGTGAAACCCACACAGACCCTCACGCTGACCTGCACCTTCTCGGGGTTCTCACTCAGCACTAGTGGAGTGGGTGTGGGCTGGATCCGTCAGCCCCCAGGAAAGGCCCTGGAGTGGGTTACACTCATTTATTGGGATGATGATAAGCGTTACAGTCCATCTCTGGAGAACAGGGTCACCATCAGGAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTGGCTCTTACAATGACGAACATGGACCCTTTGGACACAGGCACATACTACTGTGCGCACAGACAACATATCAGCAGCTTCCCGTGGTTCGATTCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAGCCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCTCAAAACCCCACTTGGTGACACAACTCACACATGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCGTGCCCACGGTGCCCAGAGCCCAAATCTTGTGACACACCTCCCCCATGCCCACGGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGATACCCTTATGATTTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAAGTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGTAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGACAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAGCGGGCAGCCGGAGAACAACTACAACACCACGCCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACATCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGASEQ ID NO10MDTLCSTLLLLTIPSWVLSQITLKETGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGVGVGWIRQPPGKALEWVTLIYWDDDKRYSPSLENRVTIRKDTSKNQVALTMTNMDPLDTGTYYCAHRQHISSFPWFDSWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSISISPGK
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AGTACGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAGSEQ ID NO14MSVPTMAWALLLLSLLTQGTGSWAQSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDIGGYNFVSWYQQHPGKAPKLMIYDATKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGDYTPGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSSEQ ID NO15ATGGACTGGACCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGGTGTCCAGTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAACAGGTATACTGTCAACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGCATCATCCCTATCTTGGTACAGCAAACTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGACTCACCATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGATGACACGGCCGTGTATTTCTGTGCGAGAGAGAATCTCGATAATTCGGGGACTTATTATTATTTCTCAGGCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTCACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCA
CCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGASEQ ID NO16MDWTWRFLFVVAAATGVQSQVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNRYTVNWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQRFQGRLTITADESTSTAYMELSSLRSDDTAVYFCARENLDNSGTYYYFSGWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK


本发明公开了重组抗体。描述了核酸及其编码的氨基酸序列以及他们的用途，这种氨基酸序列构成了人狂犬病毒中和抗体免疫蛋白的重链和轻链。