专利名称：：一种抗体的高效表达载体及其制备方法技术领域：，具体涉及一种动物细胞用高效表达载体及其构建方法。：抗体是一种由抗原诱导、淋巴细胞(浆细胞)合成与分泌的、具有特殊氨基酸序列的免疫球蛋白分子。抗体可与细菌、病毒或毒素等抗原结合，通过几种不同机制中和或除去有害物质。抗体作为治疗剂的研究已经经历一个世纪(DrewsJ.Drugdiscovery:ahistoryperspective.Science,2000,287(5460):1960-1964)。抗体药物是当前生物技术制药中特别活跃的领域，在某些疾病的治疗中发挥了重要作用。1975年Kohler和Milstein报告用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体(monoclonalantibody，MAb)。单克隆抗体特异性高，性质均一。通过细胞工程可以在体外定向地制备各种各样的单克隆抗体。这在抗体生产中是具有划时代意义的进展。目前抗体真核表达载体构建主要基于两种策略一是将轻链和重链分别克隆到两个真核表达载体上，共转染于哺乳动物细胞中，从而表达出完整抗体；二是将重链和轻链分别连接到一个具有双向启动子的真核表达载体的启动子之后，或顺序性连接在同一真核表达载体的一个启动子上，然后再转染到哺乳动物细胞中表达。在真核表达体系中，载体的构建和宿主细胞的选择对于决定表达量的高低是至关重要的。基于对真核表达调控的认识，一个好的真核表达载体至少要具备以下几个特征①具有一个或多个组成型或诱导型的强启动子.例如cmV5、EFla等；②真核细胞选择性的mRNA翻译及翻译后加工信号，包括Kozak序列、翻译终止密码子、mRNA切割及加尾信号、mRNA剪切信号等；③具有转录终止子；④具有原核启动子和筛选标志(如抗生素等)以便于载体在细菌中扩增；⑤必须具备真核表达筛选标志，这些标志包括稳定转染细胞株的筛选标志如G418、Zeocin等，还有基因扩增标志如DHFR(二氢叶酸还原酶)、GS(谷氨酸合成酶)，两者原理相似，都既可以作为转染阳性细胞的筛选标志，又可扩增目的基因。在CHO细胞表达系统中，高水平表达重组蛋白的细胞株的获得常常比较困难。最主要的因素是表达外源蛋白的细胞比率低和细胞培养过程中外源基因不稳定(Lucas，B.K.,Giere,L.Μ.,DeMarco,R.Α.,Shen,Α.,Chisholm,V.,Crowley,C.W.,1996.High-levelproductionofrecombinantproteinsinCHOcellsusingadicistronicDHFRintronexpressionvector.NucleicAcidsRes.24，1774-1779.)。选择具有扩增目的基因功能的表达系统如DHFR和GS系统会有效提高细胞集落中高表达细胞株的比例。但是，获得高表达的细胞株往往需要经历多个细胞筛选步骤，其中单克隆的重复筛选和MTX加压筛选过程需要需要耗费大量的时间。而且，这一过程有很大的不确定性。按某一MTX加压程序对细胞进行处理绝非可重复地产生某个水平的单克隆抗体产率，或使得产率从前一个阶段提高某个倍数。同时，经过加压处理的细胞株生长速率往往显著降低(BiotechnolBioeng.1998Apr；58(1):73-84.CharacterizationofchimericantibodyproducingCHOcellsinthecourseofdihydrofolatereductase-mediatedgeneamplificationandtheirstabilityintheabsenceofselectivepressure.KimSJ,KimNS,RyuCJ,HongHJ,LeeGM.)。不但从累积细胞数这一方面影响单克隆抗体的产率，而且这样生长能力薄弱的细胞株在工艺放大过程中会面临很多困难，对大生产环境的适应性不高。加压带来的基因扩增同时带来了细胞基因组的不稳定，会导致细胞株的生长、单克隆抗体产率、或其他生物性状在经过一段时间的连续培养后发生不可预测的变化(JBiotechnol.1999Aprl5；69(2-3):215-26.Changesduringsubclonedevelopmentandageingofhumanantibody-producingrecombinantCHOcells.StrutzenbergerK,BorthN,KunertR,SteinfellnerW，KatingerH.)。这些不良影响限制了这类方法在构建商业单克隆抗体细胞株中的应用。虽然CH0-DG44细胞经MTX加压而制成的单克隆抗体表达细胞株仍可以实现工业化生产所需要的表达稳定性，但可能产生的细胞株之间的遗传性状的不同会导致细胞生长条件，营养成分的需求，对生长外环境因素的反应有很大的差别。这种差别使得建立一个通用的平台工艺变得非常困难。不同细胞株之间的差异化无疑加大了工艺优化的困难程度，使优化经验的分享变得不可能。另一类方法不使用基因扩增方法，而是在受转染对细胞集落中直接筛选为数较少的高表达细胞株。此方法获得的细胞株往往生长速率较高，并保持遗传性状的高稳定性，满足大规模商业化生产对细胞株的要求。但是，为增加高表达细胞株的比例，很多表达载体中力口入了有助于提高表达量的基因兀件。Ease(expressionaugmentingsequenceelement)(TeriL.Aldrich,Improvedbicistronicmammalianexpressionvectorsusingexpressionaugmentingsequenceelement(EASE)Cytotechnology28:9-17,1998.；TeriL.Aldrich,EASEVectorsforRapidStableExpressionofRecombinantAntibodiesBiotechnol.Prog.2003,19,1433-1438)Rβ-globinMARs(matrixattachmentregion)(TeriL.Aldrich,EASEVectorsforRapidStableExpressionofRecombinantAntibodiesBiotechnol.Prog.2003，19，1433-1438)等基因原件皆为专利保护产品。使用这类原件，抑或其他商业来源的表达质粒原件将导致单克隆抗体生产背负一定程度的专利费用。但无疑这类元件上的使用所代表的方向是有实效的。
有鉴于此，本发明的所解决的技术问题在于提供一种抗体高效表达载体，能够同时表达抗体的重链和轻链，避免现有技术中存在的抗体重链和轻链表达不均衡的问题，同时增加抗体蛋白的表达率，并且能够提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。一方面，本发明提供了一种抗体高效表达载体，该高效表达载体含有抗性基因和两个基因整合用的目的基因结合位点，两个目的基因结合位点能够分别结合抗体分子的重链基因和轻链基因，两个目的基因结合位点分别位于高效表达载体中的两个表达单元中，分别形成抗体的重链表达单元和轻链表达单元，所述表达单元中还包括位于所述目的基因结合位点上游的强表达诱导性启动子。优选地，所述高效表达载体中还包括复制起始位点，所述抗性基因包括位于所述复制起始位点的青霉素抗性基因和位于所述复制起始位点下游的新霉素抗性基因。优选地，所述复制起始位点与所述新霉素抗性基因之间包括新霉素抗性基因的即刻早期启动启动子。优选地，所述即刻早期启动启动子为猿猴病毒40即刻早期启动启动子。优选地，所述重链表达单元和轻链表达单元中均含有位于所述目的基因结合位点上游的巨细胞病毒启动子。优选地，所述重链表达单元和轻链表达单元中均包括16S杂合内含子，16S杂合内含子位于启动子与基因结合位点，其下游还包括16S拼接受体，16S杂合内含子和16S拼接受体能够有助于抗体分子mRNA的成熟剪切。优选地，该高效表达载体还包括引入功能基因和抗体分子编码基因的酶切位点。另一方面，本发明所解决的技术问题还在于提供一种高效表达载体的构建方法，完全避免使用有专利的、或有商业来源的真核细胞表达元件。将该方法构建的高效表达载体用于建立一个非基因扩增的细胞株构建方法，通过创造性使用对蛋白表达有促进和抑制作用的表达控制元件，使得整合而成的表达质粒可以实现在稳定细胞系中单克隆抗体蛋白的高表达。本发明的提供的一种高效表达载体的构建方法包括如下步骤一、pExplOl的构建，pExplOl全序列是经由DNA合成产生的SEQIDNO:1，此质粒的骨架部分来自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因、复制起始位点，质粒功能区有猿猴病毒40启动子，巨细胞病毒启动子，SV40多聚腺嘌呤信号序列，SV40内含子；二、pExpl02的构建，在pExplOl的基础上，加入新霉素抗性基因而构建；三、pExpl03的构建，将具有SEQIDNO5序列的兔β_球蛋白聚腺苷酸化信号序列插入pExplOl中，作为蛋白高表达质粒的中间体；四、pExpl04的构建，将一个完整的CMV表达单元装入pExpl02；五、pExpl05的构建，将抗CD20抗体gamma链cDNA序列SEQIDNO:11插入pExpl03中CMV表达单元，即获得pExpl05，此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体；六、pExpl06的制备，将抗CD20抗体kappa链cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表达单元，即获得pExpl06，此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体；七、pExpllO的构建，通过整合pExpl05和pExpl06，将两个分别表达单克隆抗体gamma链和kappa链基因的表达盒整合到一个质粒中生成。优选地，所述新霉素抗性基因具有SEQIDNO:2的序列，其由PCR法从pSV2_Ne0质粒中获取。优选地，步骤四中CMV表达单元是从pExplOl由PCR扩增得到。本发明中的质粒可同时表达单克隆抗体的重链和轻链。为达到这一目的，此表达质粒含有两个表达单元(业界也常将表达单元称作表达盒)，分别表达单克隆抗体的重链和轻链基因，表达载体同时含有抗体重链和轻链表达盒的目的是避免细胞中轻链和重链的表达水平因为两者基因拷贝数的不同而产生不平衡。其中，在本发明的一个具体实施例中，单克隆抗体重链表达盒包括人巨细胞病毒主要立即早期抗原启动子(CMVpromoter)，16S杂合内含子(CMV-SV4016Shybridintron)，和兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号(RBGpoly-A)序列。在内含子和poly-A序列之间是单克隆抗体重链cDNA。其中，由于设计了独特的限制性内切酶位点，重链cDNA的可变区序列即可以和不变区序列一起切入/切出，也可以独立切入/切出。单克隆抗体轻链表达盒包括人巨细胞病毒主要立即早期抗原启动子(CMVpromoter)，16S杂合内含子(CMV-SV4016Shybridintron)，和猿猴病毒SV40晚聚腺苷酸化信号(SV40polyA)序列。在内含子和poly-A序列之间是单克隆抗体轻链cDNA。其中，由于设计了独特的限制性内切酶位点，轻链cDNA的可变区序列即可以和不变区序列一起切入/切出，也可以独立切入/切出。单克隆抗体轻链和重链表达盒中的16S杂合内含子(hybridintron)将有助于单克隆抗体分子的mRNA成熟剪切，增加蛋白表达率。本发明中的质粒还含有表达新霉素抗性基因的表达盒。获得此质粒的细胞将会产生对新霉素(Neomycin，ΝΕ0)的抗药性，用于对转染阳性细胞的筛选。新霉素抗性基因即新霉素磷酸转移酶，其表达盒位于单克隆抗体重链表达盒下游，且与单克隆抗体重链表达方向相反。新霉素抗性基因表达盒从上游到下游依次为SV40即刻早期启动子(SV40promoter)，新霉素磷酸转移酶cDNA，SV40“Small-t〃抗原内含子，和SV40早聚腺苷酸化信号(SV40polyA)序列。其中，SV40早聚腺苷酸化信号序列与上述单克隆抗体轻链表达盒中的SV40晚聚腺苷酸化信号(SV40polyA)序列是一致的，但从基因表达方向上看序列是互补的。以上对新霉素抗性基因表达盒的设计使得新霉素的表达受到多方面的限制。这一限制的目的为提高筛选的有效性，确保获得新霉素抗药性的细胞都可以有较高水平的单克隆抗体分子的表达。与单克隆抗体重链和轻链表达盒相比，首先，表达新霉素基因的启动子为SV40即刻早期启动子。相较CMV启动子，SV40启动子的强度在CHO细胞中仅有前者的15.6%。其二，新霉素表达盒中的SV40"small-t"内含子据报道对新霉素表达有抑制作用。其三，新霉素表达盒所用多聚腺嘌呤信号(poly-Α)序列为SV40早polyA。相对于反方向读取的晚polyA，其活性有6倍的差距。以上表达载体的构建策略皆是为降低新霉素阳性克隆的低表达背景，增加高表达克隆的筛选几率。将单克隆抗体重链表达盒与新霉素抗性基因表达盒在质粒上安排成“头对头”的方向可以进一步拉大两者表达量上的差距。重链基因虽然使用了较SV40多聚腺嘌呤信号(poly-A)序列更有效的兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号(RBGpoly-A)序列，但从重链强启动子的表达未被polyA阻断的部分仍终止于下游晚SV40聚腺苷酸化信号序列。这种情况下，单克隆抗体重链基因和新霉素抗性基因将竞争这一共用的聚腺苷酸化信号序列。因为这一聚腺苷酸化信号序列从单克隆抗体重链一侧读来的强度高于从新霉素抗性基因一侧的强度(晚SV40polyA强于早SV40polyA)，竞争将进一步削弱新霉素抗性基因的表达水平。因为本发明的单克隆抗体表达质粒不是应用基因扩增方法获得单克隆抗体的高表达(如GS系统和DHFR系统)，不能采用将筛选抗性基因(本发明中为新霉素抗性基因)减低至极限值。本发明中的新霉素抗性基因的目的是获得转染阳性的CHO细胞，并使得这些细胞中单克隆抗体表达量高的细胞比例不会太低。微量表达筛选基因产物，并仅仅依赖增加筛选强度获得的阳性克隆往往富集了很多与单克隆抗体表达水平无关的基因突变细胞，对提高高表达细胞株筛选效率没有帮助。相比于现有技术，本发明的技术方案具备如下技术效果本发明的高效表达载体，能够同时表达抗体的重链和轻链，避免现有技术中存在的抗体重链和轻链表达不均衡的问题，同时增加抗体蛋白的表达率，并且能够提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。另外，采用本发明的高效表达载体，即不使用基因扩增而获得的细胞株有较好的生长能力，利用本发明的高效表达载体进行单克隆抗体表达可以获得高表达率，图1质粒pExplOl结构示意图。pExplOl序列为全合成，包含启动子、poly-A序列、内含子等表达控制元素、质粒结构元素、及后续质粒构建所需内切酶位点。图2质粒pExpl02结构示意图。pExpl02是在pExplOl基础上，加入新霉素cDNA制成。图3质粒pExpl03结构示意图。pExpl03是在pExplOl基础上，加入兔b_球蛋白聚腺苷酸化信号序列而成。图4质粒pExpl04结构示意图。pExpl04是在pExpl02中加入一个完整的CMV表达盒。这样pExpl04就可以同时表达抗体的重链和轻链基因。图5质粒pExpl05结构示意图。pExpl05是将抗CD20抗体gamma链cDNA插入pExpl03的CMV表达盒中制成。图6质粒pExpl06结构示意图。pExpl06是将抗CD20抗体kappa链cDNA插入pExpl04的CMV表达盒中制成。图7质粒pExpllO结构示意图。pExpllO是整合pExpl05和pExpl06制成。这样pExpllO可同时表达抗⑶20抗体的重链和轻链。具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实施手册中所述的条件。1、本发明的高表达质粒的构建以下质粒构建过程中，PCR产物均由Qiagen公司试剂盒MinEluteGelExtractionKit(Cat.No.28604)进行纯化后再行酶切。在酶切时需要更换内切酶缓冲液的，则使用Qiagen公司的试剂盒QIAquickPCRPurificationKit(Cat.No.28104)除去内切酶Bstl1071是来自Fermentas公司(Cat.No.ER0701)以外，其他内切酶均来自NewEnglandBiolab公司。在DNA制备中，使用了Eppendorf公司的试剂盒FastPlasmidMiniKit(VffRCat.No.47746-464)进行10微克左右规模的提取，而用了Qiagen公司的试剂盒EndoFreePlasmidMaxiKit(Cat.No.12362)进行DNA500微克规模的提取。所有以上操作均根据产品供应商提供的用户操作手册来完成。每一步质粒构建工作完成后，用内切酶进行诊断酶切，并根据生成的DNA片段大小判断并选出正确的克隆。这些结论后来又通过DNA测序加以验证。1.1、ρΕχρ101的构建为了避免使用任何商业来源的质粒作为构建本发明质粒的材料，pExplOl全序列是经由DNA合成产生的SEQIDNO1。此质粒的骨架部分来自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因(Amp(r))、复制起始位点(repori.)。其他质粒功能区有猿猴病毒40(SV40)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，SV40多聚腺嘌呤信号序列(poly-A)，SV40内含子。1.2、pExpl02的构建pExpl02是在pExplOl的基础上，加入新霉素抗性基因(Neo)而构建的。2微克pExplOl质粒加入1微升SalI限制性内切酶(20，000U/mL,NEB公司)进行酶切，然后向酶切反应中加入6XDNA染料，在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，90V电压进行50分钟，将酶切开的DNA条带从胶中切下，用QiagenGelExtraction试剂盒将DNA片段从胶中回收。新霉素抗性基因DNA片段SEQIDNO2由PCR法从pSV2_Neo质粒中得到。PCR引物见SEQIDNO3和SEQIDNO:4。PCR使用Stratagene公司PfuTurbo试剂盒，包括dNTP和10倍PCR缓冲液。将两个IOOuM引物各IuL,10倍PCR缓冲液5uL,2mMdNTP5uL,及5uLpSV40-Neo底物(lOng/uL)，0.5uLPfuTurbo(5U/uL)加入27.5uL无菌蒸馏水中，置于ThermoCyclerPCR仪中进行如下反应95°C加热2分钟，94°C变性30秒，引物退火(55°C)30秒，扩增(72°C)1分钟。之后将变性、退火、扩增三步重复5次，再将退火温度升温至60°C，重复三步25次。随后再72°C进行5分钟，温度降为4°C终止反应。反应产物在琼脂糖凝胶中进行电泳(90V，50分钟)，将810bp条带从胶中切下，用QiageneGelextraction试剂盒回收DNA片段。此纯化的DNA片段经MlI酶切，再一次经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，作为连接的底物。连接反应包括约Iug的上述MlI酶切的新霉素抗性基因片段，少量的(0.lug)pExplOl酶切片段，NEB公司连接酶(luL，400，000U/mL)及10倍缓冲液，于室温一小时进行反应。反应结束后，取IuL反应产物，转化大肠杆菌感受态细胞，并在含青霉素的LB琼脂上得到抗性细菌集落。抗性集落被接种于SuperBroth细菌培养液中，加入50ug/mL青霉素并置于37°C培养箱，每分钟300转摇动培养16-M小时。DNA由SDS-碱法从培养细菌中提取。1.3、pExpl03的制备pExpl03是将兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号(RBGpoly-A)序列SEQIDNO:5插入pExplOl中，作为蛋白高表达质粒的中间体。RBGpoly-A序列PCR底物为pHCMV-G。所用正、反引物序列见SEQIDNO:6和SEQIDNO:7。PCR所得520bp产物经NotI酶切，经琼脂糖电泳纯化，得到连接片段。PExplOl经NotI酶切，再经经琼脂糖电泳纯化，所得线性DNA与纯化的RBGpoly-A片段连接。连接反应经转化大肠杆菌感受态细胞，扩增和DNA纯化，获得pExpl03质粒。1.4、pExpl04的制备pExpl04是将一个完整的CMV表达盒装入pExpl02。因为pExpl02已经有一个CMV表达盒，这样pExpl04就有了表达双基因的能力，适合同时表达单克隆抗体分子的重链和轻链基因。pExpl02由Bstll07I和MluI双酶切以后，经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化、回收，得到6272bp片段，并用于连接反应。CMV表达盒是从pExplOl由PCR扩增得到。PCR正、反引物见SEQIDNO9和SEQIDNO:10。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离、纯化后被Bstll07I和MluI酶切，并再一次进行琼脂糖凝胶电泳分离和纯化。回收的如SEQIDN0:8所示的DNA片段为904bp。以上两个酶切片段经连接反应和感受态细胞转化，得到含pExpl04质粒的抗性细菌菌落。后续细菌培养和DNA提取即获得pExpl04。1·5、pExpl05的制备将抗CD20抗体gamma链cDNA序列SEQIDNO11插入pExpl03中CMV表达盒，即获得pExpl05。此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体。抗⑶20抗体gamma链cDNA是PCR法将目标序列从另一表达质粒pS_⑶20-G1中得到。正、反引物分别为SEQIDN0:12和SEQIDN0:13。所获PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和分离、纯化，得到1455bp片段。此片段经BamHI和B10I双酶切，再进一步由琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，即用于连接反应。pExpl03经BamHI和BioI双酶切后，由琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，线性DNA即用于同抗CD20GlcDNA片段进行连接反应。所获抗性克隆经培养和DNA制备，即获得pExpl05。1·6、pExpl06的制备将抗CD20抗体kappa链cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表达盒，即获得pExpioe。此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体。抗CD20抗体kappa链cDNA是PCR法将目标序列从另一表达质粒pS-CD20_K中得到。正、反引物分别为SEQIDN0:15和SEQIDN0:16。所获PCR产物经琼脂糖凝胶电泳和分离、纯化，得到713bp片段。此片段经BglII和MluI双酶切，再进一步由琼脂糖凝胶电泳分离和纯化，即用于连接反应。pExpl03经BglII和MluI双酶切后，由琼脂糖凝胶电泳分离、纯化，线性DNA即用于同抗⑶20kappa链cDNA片段进行连接反应。所获抗性克隆经培养和DNA制备，即获得pExpl06o1·7、pExpllO的制备pExpllO是同时表达单克隆抗体重链基因和轻链基因的高表达质粒。在本发明中选择表达的是抗CD20的单克隆抗体基因。pExpllO是通过整合pExpl05和pExpl06，将两个分别表达单克隆抗体gamma链和kappa链基因的表达盒整合到一个质粒中生成的。ρΕχρΙΟδ和ρΕχρ106分别被RneI和EcoRI双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，分别将3287bp的SEQIDNO17和6552bp两个片段分离、纯化。所获DNA片段经连接反应，感受态细胞转化、DNA制备等步骤，即获得pExpllO。2、CH0_kl宿主细胞转染转染前一天，将宿主细胞(CH0-K1驯化于EXcel302无血清培养基中(SAFC公司)传代。悬浮培养的宿主细胞取1毫升，置于BeckmanCoulter细胞计数仪中进行计数，获得细胞密度和活力数据。将EXcel302无血清培养基在37°C水浴箱中预热，然后将宿主细胞用此新鲜培养基稀释到le6细胞每毫升的密度，置于250毫升摇瓶(Corning或相似品牌产品)中，在CD2培养箱中(Thermo公司3950型)，置于平面摇床上(NewbrunswickScientific公司hnova2100型)以37°C、5%二氧化碳、IOOrpm转速的培养条件下进行摇瓶培养。转染当天，将细胞置于数个50mL离心管内，以900rpm/5分钟的条件进行离心(Beckman台式离心机)。将上清液弃去，细胞沉淀用10毫升经过37°C预热的转染培养基(DMEM/F12+2mML-Gln)打散并进行细胞计数。将细胞用转染培养基稀释到5e5细胞/毫升的密度，置于250毫升摇瓶中用同上的方法进行培养。在生物安全柜中准备转染溶液。根据需转染的细胞体积，按每毫升细胞4μgDNA的量将质粒DNA加入无菌离心管中，并加入转染培养基使得DNA浓度达到40ug每毫升。将PEI粉末用室温的无菌纯水溶解，稀释到1毫克每毫升制成母液，再分装保存在-20°C。使用时，将PEI母液自冰箱中取出融化，按每毫升细胞8微克的量加入无菌离心管中，使得PEI/DNA比例为2:1。然后将PEI用转染培养基稀释至与DNA相同体积。将PEI溶液混入DNA溶液中，使用Vortex混合器使两者混合。将混合的DNA和PEI静置20分钟，然后加到细胞中去。经转染对细胞在37°C/5%二氧化碳培养箱中摇瓶培养4小时后，向摇瓶内加入相同体积的37°C预热的PowerCHO(L0NZA公司，货号12-770Q)生长培养基，继续摇瓶培养。48小时以后，开始稳定胞株筛选。向细胞培养液中加入新霉素anvitrogen公司，50毫克/毫升母液)，使终浓度达到450微克每毫升。继续相同条件培养，并每三天为细胞更换一次培养液(即重复2.1中离心、计数、加培养液的操作)并加入新鲜的新霉素。3、单克隆筛选使用新霉素筛选稳定细胞株7天后，细胞计数并按以下条件将细胞接种于96-孔板配制JRH302培养基并添加FBS(Invitrogen公司)。将细胞稀释为15个细胞每毫升。用多通道移液器，将200uL/孔细胞悬液加入96-孔板，平均每孔3个细胞。共铺200个96-孔板。将这些96孔板置于二氧化碳培养箱中(Sanyo公司)，在37°C/5%二氧化碳的条件下静置培养。第7天，向96孔板中补新鲜培养液每孔100微升。4、单克隆扩增、驯化和筛选4.1待单细胞克隆长大为约50个细胞每集落时，用ELISA法测上清液中单克隆抗体浓度。将羊-抗人IgG-FC单克隆抗体O微克每毫升用0.IM碳酸钙溶液稀释，JacksonImmunoResearchLabs，货号109-005-098)加入ELISA专用96孔板，每孔100微升。用封口膜将96孔板封住，置于2-8°C冰箱中至少8小时。使用前用ELISA洗板机(Biotek405型)将96孔板清洗3次(清洗液为PBS加0.03%Tween-20)。洗板后，加入阻断液(0.5%BSA稀释于PBS+0.03%Tween-20)，每孔200微升，并放置室温至少1小时。然后用4.1.1方法洗板三次。将单克隆抗体标准品(已知浓度的人IgG-kappa单克隆抗体)用阻断液稀释至3微克每毫升，然后12递次稀释成7管。将此标准品梯度样品加入96孔板的第一列，每孔100微升。使用多通道移液器，将100微升的细胞培养上清液从培养单克隆的96-孔板中移至ELISA板中，但跳过第一列(已用于标准品)。将ELISA板置于平板摇床上，在室温下以200-300rpm转速摇动一小时。孵育后同上洗板三次。将鼠抗人kappa单克隆抗体-辣根过氧化物酶(HRP)螯合体(SouthernBiotechnologyAssociates，货号2060-05)用阻断液稀释2000倍，加入上述ELISA板中，每孔100微升。将ELISA板置于平板摇床上，在室温下以200-300rpm转速摇动一小时。孵育后同上洗板六次。洗板后向ELISA板中加入100微升每孔的TMB溶液。在室温孵育约15_30分钟，直到标准品最高浓度的孔中呈现深蓝色。即刻向ELISA板中加入2M的硫酸。每孔50微升，来停止显色反应。将ELISA板摇动混合，然后放入读板机(ABI公司spectrum型)中在450纳米下读取数据，并减去650纳米背景。4.2、根据每板中相对于标准品的读数，选出共48个高表达克隆。将37°C预热的JRH302+1%FBS克隆培养基加入24-孔板(每孔1毫升)。用200微升移液器将上述选出的高表达细胞转移出96-孔板，接种入24-孔板。4.3、将M孔板置于二氧化碳培养箱中静置培养，每3天更换新鲜培养液。待细胞在24-孔板生长起来后，转入6-孔板。首先用真空吸液器吸走旧培养液，每孔加入200微升胰酶溶液。待细胞脱壁后加入1毫升37°C预热的JRH302+1%FBS克隆培养基，转入6孔板。每孔再加入克隆培养基3毫升，置于二氧化碳培养箱中静置培养，每3天更换新鲜培养液。4.4、待细胞在6-孔板中生长起来后，同上方法将细胞转入T-75方瓶瓶。待有足够细胞后，设4-天/14-天产率实验。将T-75方瓶中的培养液用真空吸液器吸走，然后加入2毫升胰酶。待细胞脱壁后，加入10毫升克隆培养液。取1毫升细胞用细胞计数仪计数，按2e5细胞每孔种入6孔板中，并加入克隆培养基至每孔4毫升。6-孔板置于二氧化碳培养箱中，在37°C/5%二氧化碳条件下静置培养。第4天和第14天，各取1毫升细胞培养上清，用HPLC-蛋白A柱法测单克隆抗体浓度(方法见GEHealthcare蛋白A柱使用手册)。4.5、根据4.4条件下单克隆抗体的表达水平(见下表)，将克隆排序，取前10位进行悬浮驯化和无血清驯化，使用EXcel302培养基。权利要求1.一种抗体的高效表达载体，其特征在于该高效表达载体含有抗性基因和两个基因整合用的目的基因结合位点，两个目的基因结合位点能够分别结合抗体分子的重链基因和轻链基因，两个目的基因结合位点分别位于高效表达载体中的两个表达单元中，分别形成抗体的重链表达单元和轻链表达单元，所述表达单元中还包括位于所述目的基因结合位点上游的强表达诱导性启动子。2.如权利要求1的所述的高效表达载体，其特征在于所述高效表达载体中还包括复制起始位点，所述抗性基因包括位于所述复制起始位点的青霉素抗性基因和位于所述复制起始位点下游的新霉素抗性基因。3.如权利要求2的所述的高效表达载体，其特征在于所述复制起始位点与所述新霉素抗性基因之间包括新霉素抗性基因的即刻早期启动启动子。4.如权利要求3的所述的高效表达载体，其特征在于所述即刻早期启动启动子为猿猴病毒40即刻早期启动启动子。5.如权利要求1的所述的高效表达载体，其特征在于所述重链表达单元和轻链表达单元中均含有位于所述目的基因结合位点上游的巨细胞病毒启动子。6.如权利要求1的所述的高效表达载体，其特征在于所述重链表达单元和轻链表达单元中均包括16S杂合内含子，16S杂合内含子位于启动子与基因结合位点，其下游还包括16S拼接受体，16S杂合内含子和16S拼接受体能够有助于抗体分子mRNA的成熟剪切。7.如权利要求1的所述的高效表达载体，其特征在于该高效表达载体还包括引入功能基因和抗体分子编码基因的酶切位点。8.一种抗体的高效表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤一、pExplOl的构建，pExplOl全序列是经由DNA合成产生的SEQIDNO:1，此质粒的骨架部分来自于pCI-Neo，包含青霉素抗性基因、复制起始位点，质粒功能区有猿猴病毒40启动子，巨细胞病毒启动子，SV40多聚腺嘌呤信号序列，SV40内含子；二、pExpl02的构建，在pExplOl的基础上，加入新霉素抗性基因而构建；三、pExpl03的构建，将具有SEQIDNO:5序列的兔β-球蛋白聚腺苷酸化信号序列插入pExplOl中，作为蛋白高表达质粒的中间体；四、pExpl04的构建，将一个完整的CMV表达单元装入pExpl02；五、pExpl05的构建，将抗CD20抗体gamma链cDNA序列SEQIDNO:11插入pExpl03中CMV表达单元，即获得pExpl05，此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体；六、pExpl06的制备，将抗CD20抗体kappa链cDNA序列SEQIDNO14插入pExpl04中CMV表达单元，即获得pExpl06，此质粒为构建双基因表达单克隆抗体的表达质粒的前体；七、pExpllO的构建，通过整合pExpl05和pExpl06，将两个分别表达单克隆抗体gamma链和kappa链基因的表达盒整合到一个质粒中生成。9.如权利要求8所述高效表达载体的制备方法，其特征在于所述新霉素抗性基因具有SEQIDNO2的序列，其由PCR法从pSV2_Neo质粒中获取。10.如权利要求8所述高效表达载体的制备方法，其特征在于步骤四中CMV表达单元是从pExplOl由PCR扩增得到的具有如SEQIDNO8所示序列。全文摘要本发明公开了一种抗体的高效表达载体，该高效表达载体含有抗性基因和两个基因整合用的目的基因结合位点，两个目的基因结合位点能够分别结合抗体分子的重链基因和轻链基因，两个目的基因结合位点分别位于高效表达载体中的两个表达单元中，分别形成抗体的重链表达单元和轻链表达单元，所述表达单元中还包括位于所述目的基因结合位点上游的强表达诱导性启动子。本发明的高效表达载体能够同时表达抗体的重链和轻链，避免现有技术中存在的抗体重链和轻链表达不均衡的问题，同时增加抗体蛋白的表达率，并且能够提高后续单克隆抗体细胞株筛选的有效性。文档编号C12N15/66GK102559750SQ201110380100公开日2012年7月11日申请日期2011年11月25日优先权日2011年11月25日发明者王笑非,陈倩怡申请人:佛山安普泽生物医药有限公司