专利名称：神经干细胞体外扩增和定向诱导分化为多巴胺能神经细胞的方法 神经干细胞(neural stem cell，NSC)的发现是神经生物学领域的最重要进展之一，NSC的存在被证实并分离培养成功，不仅对于中枢神经系统发育成熟后不可能再生的理论提出了挑战，为研究神经发生、神经系统遗传病的发病机制提供了理想的载体，还为神经系统损伤修复和退行性病变的治疗带来了新的希望。NSC作为细胞替代治疗具有巨大的优越性，它能自我更新，在体外可大量扩增富集；具有分化为神经系统多种细胞类型的能力；由于中枢神经系统特殊的血脑屏障的存在，NSC移植几乎无排斥反应；除此之外神经干细胞可作为基因表达的载体，导入需要的外援基因而表达相应功能蛋白成为一种可靠稳定的细胞载体。虽然细胞移植后功能化还需要对供体细胞和受体组织内环境生物学特性的深入理解和控制，但NSC作为神经系统疾病细胞替代治疗的理想细胞已成共识，NSC的研究对推动其临床应用具有重要意义。胚胎脑组织分离培养NSC已成为成熟的方法，而成年机体NSC的培养对细胞应用更有意义，但其方法很不稳定，本申请旨在建立一种稳定的成年大鼠脑NSC的培养扩增方法。NSC定向诱导的实验研究有少数国外研究机构正在进行，而国内未见报道。
本发明涉及一种利用神经干细胞的生物学特性，无血清培养扩增神经干细胞的方法及在这种条件下获得的干细胞体外定向诱导分化、体内定向分化为多巴胺能神经细胞的方法。本发明的目的是提供一种将神经干细胞大量扩增后体外定向诱导分化为多巴胺能神经细胞并移植于脑纹状体并在原位分化为多巴胺能神经细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)利用干细胞的生物学用采用无血清培养的方法富集神经干细胞，利用干细胞的自我更新和增殖特性用促分裂增殖因子对神经干细胞进行扩增，从而达到获得大量神经干细胞的目的。2)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征在于特定培养代数(第3-5代细胞)进行诱导，于以特定的药物，特定浓度进行定向诱导进行定向诱导；3)培养出的细胞在体内进行定向诱导分化的方案，其特征在于利用特定的细胞密度和注射方式使获得的大量神经干细胞在脑部纹状体在原位分化为多巴胺能神经元。本发明提供了神经细胞缺失后的补充来源，为干细胞移植替代临床治疗帕金森疾病奠定了基础，并为与之相关的药物开发和筛选提供了一种新的模型。本发明的内容未公开发表，本领域的技术人员如不花费创造性劳动根本不能根据现有的技术推断得到本发明的分离方法。实施例1、神经干细胞培养wistar孕大鼠(12.5天)，处死，无菌条件下取出胎鼠，分离得到脑半球，眼科剪剪为小组织块，经胰酶消化作用，吹打形成单细胞悬液，以4×105/ml种植于塑料培养瓶中。培养液含DMEM/F12，2％B27，EGF20ng/ml，bFGF20ng/ml，青-链霉素100u/ug.ml-1。37℃5％CO2孵箱培养。待原代克隆出现后(7-10天)离心收集神经球。经胰酶消化，细巴斯德吸管吹打成单细胞悬液后以1×105/ml种植于新培养液中，每7天换液传代一次。原代培养细胞在无血清和增殖因子培养基NSC增殖旺盛，1×106的原代培养细胞经15次传代后扩增约2.4(±0.4)×104倍。实施例2、神经干细胞体外定向诱导分化新鲜传代的P3-5代NSC以5×104/ml接种于放置有包被多聚赖氨酸盖玻片的24孔板内，1ml/孔，贴壁培养3天后更换培养液为DMEM/F12，2％B27，并加入抗坏血酸使其终浓度分别为1nmol，10nmol，100nmol。3天后半量换液，第6天时终止诱导。未经诱导的神经干细胞很少分化为多巴胺能神经细胞(分化率0.7±0.3％)，而一定浓度抗坏血酸AA(10-100nM)诱导能促进NSC向多巴胺能神经元分化。
实施例3、神经干细胞移植传代培养的神经干细胞经胰酶消化成单细胞后悬浮于磷酸盐缓冲液(PBS)中，计数，调整细胞浓度为105/μl，PD模型大鼠经3.5％水合氯醛腹腔内注射麻醉后固定于脑立体定位仪，以前囟为坐标，进行细胞移植。移植点为大鼠右侧纹状体(AP+1.0mm，LR-2.5mm，OV+4.5mm；AP-1.0，LR3.5，OV5.2)，每只大鼠注射两点，2μl/点，实验组共植入4×105个细胞；对照组大鼠注射等量PBS。术后皮下注射青霉素10万单位。术后一周以阿朴吗啡(0.5mg/kg)诱导检测旋转行为，以后每周检测一次，直至杀鼠。
实施例4、移植效果检测细胞移植术后4月杀鼠，经4％多聚甲醛贯注固定后取鼠脑常规石蜡包埋，切片进行TH免疫组化染色。将大鼠断头，迅速取出大脑，在冰台上分离出纹状体，准确称重，加入400μl冰冷的0.4mol/L高氯酸(含0.5mmol/LEDTA和0.01％半胱氨酸)，放入玻璃匀浆器中匀浆，匀浆液高速离心后取20μl注入高效液相色谱(HPLC)电化学检测系统，分析测定各样品组织的多巴胺及其代谢产物的含量。结果，移植NSC的纹状体内出现少量多巴胺能神经细胞，而对照组无。HPLC检测发现细胞移植治疗组多巴胺及其代谢产物含量有所升高，较对照组有明显差异。


本发明的目的是提供一种将神经干细胞大量扩增后体外定向诱导分化为多巴胺能神经细胞并移植于脑纹状体并在原位分化为多巴胺能神经细胞的方法。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案1)利用干细胞的生物学用采用无血清培养的方法富集神经干细胞，利用干细胞的自我更新和增殖特性用促分裂增殖因子对神经干细胞进行扩增，从而达到获得大量神经干细胞的目的。2)分离出的细胞在体外进行定向诱导分化的方案，其特征在于特定培养代数(第3－5代细胞)进行诱导，以特定的药物抗坏血酸，特定浓度(10－100nM)进行定向诱导；3)培养出的细胞在体内进行定向分化的方案，其特征在于利用特定的细胞密度和注射方式使获得的大量神经干细胞在脑部纹状体在原位分化为多巴胺能神经元。本发明提供了神经细胞缺失后的补充来源，为干细胞移植替代临床治疗帕金森疾病奠定了基础，并为与之相关的药物开发和筛选提供了一种新的模型。