一种促进脑梗死患者神经再生的治疗组合物的制作方法【技术领域】，具体而言，尤其涉及一种促进脑梗死患者神经再生的治疗组合物。[0002]据WHO近期调查结果显示:第一、我国脑血管疾病如脑梗塞、脑出血等年新发患者在200万~250万之间，年死亡人数高达150万人，仍以8.7 %的速度在递增，其发病率和死亡率均排名世界第一；第二、我国每年因交通事故死亡超过10万人，伤残人数> 50万，远远超过抗美援朝死伤人数，也是排名世界第一。我国卫生部经济研究所调查结果表明，每年用于治疗脑损伤的经费达1000多亿，给社会和家庭均带来了巨大的经济负担。急性脑血管病除了高致死率外，还具有高致残率和高复发率的特点，严重威胁国民生命健康和生活质量。据调查，全国脑损伤恢复期的幸存者约3/4，超过500万患者伴有不同程度智力障碍、感觉障碍、运动障碍和生活不能自理等严重残疾，随着恢复期幸存者数量逐年增加，已逐渐衍变成为严重的社会问题。因此，充分认识脑损害的严重性和危害性，加大力度研究如何促进缺血后神经功能的恢复，降低病残率，提高恢复期患者的生活质量，目前仍是一个亟待解决的世界性难题。[0003]人体的大多数组织在损伤后具有再生和修复能力，但成年哺乳动物中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤后却存在再生与修复困难,在脑缺血性损伤相关疾病、脊髓损伤、以及许多神经病变的情况下，CNS功能恢复非常有限，并且容易发生肢体运动和感觉障碍等严重影响个人生活质量的病症。因此，CNS再生问题一直是医学界和神经科学界在理论研究和临床 实践中亟待解决的重大难题。近二十年来的研究已有突破性进展，目前认为CNS再生困难的原因除促进再生的营养因子不足外，另一重要的原因是中枢的抑制性再生环境。近几年来，多项研究表明:nogo-A、trk-B、髓磷脂相关糖蛋白(MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(OMgp)等髓磷脂轴突生长抑制因子，在脑缺氧缺血损伤、脊髓损伤、癫痫疾病、阿尔海默氏病、自身免疫性脱髓鞘疾病、以及CNS神经发生过程中扮演着重要的角色。[0004]CN102260256A公开了一类二芳基吡唑并[3，4_b]吡啶杂环化合物及其制备方法，以及公开了该类化合物在制备抗菌药物方面的应用，然而其没有披露该类化合物促进中枢神经系统损伤患者神经再生的生物活性。
[0005]本发明的目的在于提供一种促进中枢神经系统损伤患者神经再生的药物组合物。[0006]本发明的目的是这样实现的:
[0007]—种促进脑梗死患者神经再生的治疗组合物，由活性成分和辅料制备而成，所述的活性成分包括3-羟基-5-苯基-6-(2，4- 二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶。
[0008]优选地，如上所述促进脑梗死患者神经再生的治疗组合物，其中所述的活性成分由3-羟基-5-苯基-6-(2，4- 二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶组成。
[0009]进一步优选地，如上所述促进脑梗死患者神经再生的治疗组合物，其中所述的治疗组合物为口服制剂，所述的口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂。
[0010]中枢神经系统损伤后的神经再生与后期康复效果密切相关，但受内在因素和外部环境的限制。内在因素包括生长相关基因、蛋白，外部环境包括神经营养因子、神经生长抑制因子、胶质瘢痕等。trk-B是脑源性神经生长因子的高亲和力受体，主要集中于中枢神经系统内表达，是脑内分布最为广泛、也是不可缺少的神经营养因子受体。nogo-A是目前发现的最为强烈的神经纤维再生抑制物质，抑制损伤神经再生，尤其是再生神经纤维的长距离生长，它在体内和体外都显示出了抑制神经轴突生长的作用。而拮抗nogo-A后所获得的神经纤维再生是有功能性的，并能形成具有功能的突触联系。Trk-B和nogo-A分别代表了神经再生微环境的神经生长营养因子和抑制因子两个方面。因此，寻找影响此二者表达的药物，比较其活性的强弱，可了解中药对中枢神经再生微环境的作用，对临床治疗中枢神经损伤非常重要。
[0011]本发明通过用电凝法制备大脑中动脉闭塞大鼠模型试验研究了 3-羟基-5-苯基-6-(2，4-二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶对脑梗死模型大鼠运动功能以及脑组织酪氨酸受体激酶B(trk-B)和勿动蛋白A(Nogo-A)表达的影响，结果发现该化合物可显著增强trk-B并抑制Nogo-A的表达，从而改善神经再生微环境，促进脑梗死大鼠运动功能康复。
[0012]因此，本发明还提供一种制药用途，即:3_羟基-5-苯基-6-(2，4-二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶在制备促进中枢神经系统损伤患者神经再生的药物中的应用。优选地，所述的中枢神经系统损伤患者为脑梗死患者。
[0013]本发明通过肢体放置检测观察了 3-羟基-5-苯基-6-(2，4-二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶对脑梗死大鼠运动功能的影响，结果治疗组运动功能评分提高较模型组显著，提示本发明的药物能促进脑梗死后运动功能康复。另外，本发明通过观察trk-B和nogo-A的表达发现，模型组和治疗组trk-B染色平均灰度均较假手术组降低，说明脑梗死后trk-B表达出现反应性增强，但经本发明药物治疗后则trk-B表达增强更为明显，表明该药物可增强MCAO大鼠脑组织中trk-B的活性，增加神经功能重塑的正向因素。总之，本发明的药物组合物可通过增加神经生长正性调控因子的表达，抑制神经生长负性调控因子的表达，充分调动卒中后对神经系统损伤的各种修复机制，促进脑梗死后的神经再生过程，进而促进运动功能康复。

[0014]本发明通过用电凝法制备大脑中动脉闭塞大鼠模型试验研究了 3-羟基-5-苯基-6-(2，4-二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶对脑梗死模型大鼠运动功能以及脑组织酪氨酸受体激酶B (trk-B)和勿动蛋白A(Nogo-A)表达的影响，结果发现该化合物可显著增强trk-B并抑制Nogo-A的表达，从而改善神经再生微环境，促进脑梗死大鼠运动功能康复。试验过程如下:
[0015]成年健康清洁级雄性SD大鼠85只，体重280~320g，随机分为假手术组(25只)、模型对照组(3 0只)、治疗组(30只)。
[0016]模型对照组和治疗组大鼠按下述方法制作大脑中动脉闭塞模型:动物用0.4%戊巴比妥钠10mL/kg腹腔注射麻醉，侧卧位固定于手术台上，沿右外耳道与右眼外眦连线中点，垂直于连线切开皮肤约2cm，然后在手术显微镜下沿颞肌中线，依次切断颞肌和咬肌，并向两侧分开，暴露出颧弓。用咬骨钳除去颧弓并沿颅骨剪开筋膜，暴露出颞前窝，用小牵张器将颧弓和下颌骨的距离撑大，暴露鳞状骨的大部分，然后在颧骨和鳞状骨前联合的前下方约2_处钻孔，开一直径约2_小颅窗，刺破硬脑膜，分离血管周围的软脑膜和蛛网膜组织，使之游离。然后在嗅束与大脑中动脉交界处轻挑起大脑中动脉，将电刀置双极电凝位置，选择3-4档电凝开关，电凝烧灼嗅束内2_至大脑下静脉之间的一段大脑中动脉，血管阻断后于远侧切断以防止再灌流，逐层缝合伤口，术后苏醒送回原笼饲养。以上过程均在室温恒定(24-25°C )情况下进行，以利于评价脑缺血程度。麻醉醒后24h内出现左侧肢体痛刺激收缩现象消失，向左侧倾倒或转圈，提尾时左上肢不能向前伸直为模型复制成功。假手术组大鼠行同样开颅术，但不凝闭大脑中动脉，其余操作同模型对照组。
[0017]以大鼠重量为基准，治疗组灌胃给予3-羟基-5-苯基-6-(2，4- 二羟基苯基)吡唑并[3，4-b]吡啶50mg/kg，其余两组分别灌胃给予同等量生理盐水，每天I次，共2周。于造模成功后6h给药，固体饲料和水自由摄取。实验过程中模型对照组大鼠有2只死亡，治疗组大鼠有I只死亡，进入结果分析的大鼠共82只。
[0018]米用前肢放置检测法(HuaY, Schallert T, Keep R F, el al.Behavioral testsafter intracerebral hemorrhage in the rat [J].Stroke, 2002, 33:2478.)测定大鼠运动功能。检查者手持大鼠背部皮肤使四肢悬空，将一侧胡须刷触桌面角边缘，测试同侧前肢的活动隋况，未受损者可将前肢迅速放到桌面，脑损伤时此动作有不同程度的损害。大鼠每侧受测10次，前肢触及桌面角边缘次数的百分率即为该侧得分。注意:抓握大鼠要轻柔，前肢自由悬垂，试验前轻轻活动大鼠，尽量让其放松，如大鼠挣扎，肌肉紧张或肢体放在试验者手上不计在内。分别于造模成功后24h、3d、l、2周进行评分。另外，采用免疫组织化学法、原位杂交法检测trk-B、nogo-A的表达情况。试验统计结果参见表1、表2。
[0019]表1各组大鼠运动功能评分比较