专利名称：一种增强靶细胞摄取治疗剂的方法和药物组合物的制作方法肿瘤的生长和迁移依赖于新生血管/淋巴管的生成。因此，肿瘤新生血管和淋巴管内皮细胞为癌症治疗提供了新的靶标(Folkman, J. N Engl JMed 1971 ；285 =1182-1186,Witte MH et al. Lymphology. 1987 ；20(4) =257-66) 同时，肥胖症、糖尿病型视网膜病、持续性玻璃体增生、牛皮癣、过敏性皮炎、关节炎、动脉硬化、子宫内膜异位、哮喘、腹水、腹膜粘连等疾病也被证明与新生血管异常生成密切相关(Carmeliet P. , Nature Medicine2003 ；9(6) :653-660)。血管内皮抑制素(endostatin，以下简称ES)是胶原X VDI羧基端的一段分子量为20kDa的酶切产物，是一种内源性血管/淋巴管生成抑制剂，具有抑制血管/淋巴管内皮细胞增殖、迁移，和抑制新生血管/淋巴管生成的活性。进一步实验发现，重组血管内皮抑制素在动物模型中可以抑制多种肿瘤的生长、转移，而且不产生耐药性(Folkman J. etal. Cell 1997 ；88 :277-285,Folkman J. et al. Nature 1997 ；390 :404-407,Zhuo W. et al,Journal of Pathology ;222 :249-260)。目前，有一种通过基因工程手段制备的重组人血管内皮抑制素(商品名恩度，Endu)，与天然血管内皮抑制素相比具有9个额外的N-末端氨基酸((M)GGSHHHHH)，已作为血管抑制剂类抗肿瘤药物，在以非小细胞肺癌为主要适应症的临床应用中得到了广泛的验证。研究显示，ES会被肿瘤部位高度活跃的血管/淋巴管内皮细胞内吞，但是具体机制尚不清楚。表皮生长因子受体(EpithelialGrowth Factor Receptor,以下简称 EGFR)在肿瘤细胞表面异常过量表达，并与癌细胞的增殖和转移密切相关。因此，已有多个靶向EGFR的单克隆抗体成为抗肿瘤药物。抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗是一个抗体类抗肿瘤药物，能够特异性地结合肿瘤细胞表面的EGFR。制霉菌素(nystatin，以下简称NT)是一种多烯类抗生素，具有广谱抗真菌作用，可以安全用于口腔含服或外用，且不与其他药物发生相互作用。NT对念珠菌属的抗菌活性高，新型隐球菌、曲菌、毛霉菌、小孢子菌、荚膜组织浆胞菌、皮炎芽生菌及皮肤癣菌通常对NT也敏感。NT也常用于易患真菌感染病人的预防，如AIDS患者或接受化疗的患者。NT这一类药物抗真菌的作用原理是能够结合真菌细胞膜上的主要成分麦角固醇(ergosterol)，并最终造成真菌细胞膜的穿孔以及钾离子泄露直至真菌死亡。由于麦角固醇是真菌细胞膜特有的脂类物质，因此应用于人体或动物体时NT和AMB不会对真核细胞膜造成误杀伤。 NT可在细胞水平上影响胆固醇相关的内吞作用。在细胞生物学领域，尤其是哺乳类细胞内吞活动的研究中，NT被广泛用来作为脂後(lipid raft)-膜穴(caveolae)依赖型内吞通路的抑制剂。其作用原理是脂筏-膜穴依赖型内吞需要依靠细胞膜上的胆固醇(cholesterol)这一重要物质，NT可以通过与膜上的胆固醇结合从而抑制这条内吞通路。与NT作用原理相似的试剂还有两性霉素B(amphotericin B),甲基化￠-环糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律宾菌素(filipin)等,都会与细胞膜上的胆固醇结合抑制脂筏-膜穴内吞通路。两性霉素B (amphotericin B，以下简称AMB)与NT作用机理相同，是目前临床上治疗隐球菌、曲霉菌等真菌感染的一种有效的多烯类广谱抗真菌药物。Wickstrom et al (2002, 2003)报道了在内皮细胞膜上 ES 与 alpha5betal 型整合素(integrin alpha5betal)以及小窝蛋白(caveolin,是膜穴的组成蛋白)有相互作用，而且ES会与脂筏发生相互作用，揭示出在细胞膜上ES与脂筏-膜穴的相互关联(Wickstromet al, Cancer Res. 2002 ；62 :5580-9, Wickstrom et al, J. Biol. Chem. 2003 ；278 (39)37895-37901)。另外，Dixelius et al (2000)，Shi et al (2007) Zhuo et al (2010)分别报道了 ES特异性的被血管和淋巴管内皮细胞内吞的过程(Dixelius et al, Blood 2000，95,3403-3411 ；Shi et al, Blood 2007,110,2899-2906, Zhuo ff. et al, Journal ofPathology ；222 :249-260)。 2002年，Pike et al和Roepstorff et al分别发现抑制胆固醇和脂後，可以增加EGFR的配体(表皮生长因子，以下简称“EGF”)在细胞表面的结合(Pike etal, Biochemistry 2002 ；41 10315-22, Roepstorff et al, J Biol Chem 2002 ；277 18954-60)。Kojic et al (2008)报道了肿瘤细胞通过脂筏-膜穴依赖型内吞来摄取自分泌运动因子/磷酸葡糖异构酶(AMF/PGI)，且这一内吞过程具有细胞种属特异性，脂筏-膜穴内吞可能成为针对特定肿瘤细胞靶向药物的给药途径(Kojic et al, PLoS ONE 2008 ；3 e3597) 0Migalovich et al (2009)报道了 NT通过调节细胞脂筏-膜穴内吞从而增加了卵巢癌细胞对黄豆苷原-牛血清白蛋白(daidzein-BSA)的内吞。黄豆苷原-牛血清白蛋白是一种潜在的肿瘤显影剂，NT增加黄豆苷原-牛血清白蛋白在肿瘤细胞的内吞可能会使这种肿瘤显影剂发挥出更好的实用效果(Migalovich et al, Cancer Res. 2009 ;69 :5610-5617)。由此可见，脂筏-膜穴依赖型内吞可能参与许多重要物质如细胞因子、外源蛋白甚至药物分子的内吞，通过调节和控制此类内吞可能在细胞水平上影响机体对这些物质的摄取，具有应用潜力。发明概述本发明基于以下发现ES可以借助脂後-膜穴(caveola/lipid raft pathway)和笼形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits pathway)这两条途径被内皮细胞内吞,如果用抑制剂NT干扰脂筏-膜穴依赖型内吞通路，可以获得提高药物在血管/淋巴管内皮细胞中内吞摄取水平的意想不到的效果，并进一步促进ES对内皮细胞活性、肿瘤血管生成和肿瘤生长的抑制效果。无意于受任何理论的限制，推测这一发现的原因可能为在脂筏-膜穴依赖型内吞通路受到抑制的情况下，笼形蛋白包被小泡高效内吞途径代偿性的活跃导致了总体内吞摄取的增强。相似地，EGFR配体被报道具有与ES相似的内吞机制。其中，EGFR单抗是一类有效的抗肿瘤药物，通过结合到肿瘤细胞特有的EGFR起到抑制相关信号传导和肿瘤增殖的疗效。本发明人发现，NT还可以通过影响脂筏依赖型内吞，显著增强抗肿瘤药物EGFR单克隆抗体在癌细胞中的内吞和积累，促进EGFR单抗的疗效，具有进一步应用于肿瘤治疗和肿瘤显像等领域的潜力。此外，与ES具有相似内吞机制的还有endothelin receptor type A,cholera toxin, transforming growth factor-3 receptors, B cell antigen receptor,bone morphogenetic protein receptor, HM I. 24 以及 integrins 等，都具备与 NT 联用产生增效作用的条件。因此，在一个方面，本发明提供脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂在制备用于提高对象中靶细胞对治疗剂的摄取的药物组合物中的用途。在另一个方面，本发明提供提高对象中靶细胞对治疗剂的摄取的方法，其包括给所述个体施用脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂。在另一个方面，本发明提供脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂，其用于提高对象中靶细胞对治疗剂的摄取。在另一个方面，本发明提供脂筏-膜穴依赖型内吞通路调节剂与某些药物(如抗 肿瘤药物)组成的药物组合物。在本发明的以上各方面的中，所述脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂是脂筏-膜穴依赖型内吞通路的抑制剂，例如所述抑制剂是多烯类抗真菌药(如制霉菌素或两性霉素B)，或者所述抑制剂例如是甲基化3 -环糊精或菲律宾菌素。根据本发明，所述治疗剂可以通过脂筏-膜穴依赖型内吞通路和笼形蛋白包被小泡内吞通路这两条通路被靶细胞摄取。根据本发明，所述对象患有血管发生相关性疾病或淋巴管发生相关性疾病。根据本发明，所述对象患有肿瘤，例如肺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、食道癌、鼻咽癌、恶性黑色素肿瘤、骨癌、淋巴癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、血管瘤、神经内分泌瘤、口腔癌、肉瘤、肾癌或胆癌。 根据本发明，所述治疗剂是血管或淋巴管生成抑制剂，例如血管内皮抑制素或其衍生物，其中所述血管内皮抑制素例如是天然血管内皮抑制素或重组血管内皮抑制素，例如重组人血管内皮抑制素。根据本发明的一个，所述血管内皮抑制素具有SEQID NO. USEQ IDN0. 2,SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列。根据本发明的一个，所述血管内皮抑制素衍生物是聚乙二醇(PEG)修饰的血管内皮抑制素。优选地，所述聚乙二醇(PEG)是平均分子量为5-40kD的单甲氧基聚乙二醇，例如是单甲氧基聚乙二醇丙醛。在本发明的一个中，所述单甲氧基聚乙二醇丙醛的平均分子量是20kD，且聚乙二醇(PEG)修饰的位点是血管内皮抑制素的N-末端的a -氨基。根据本发明，所述治疗剂是能够抑制肿瘤细胞生长的抗体。根据本发明的一个，所述抗体是表皮生长因子受体(EGFR)的抗体，例如EGFR单克隆抗体，EGFR单克隆抗体的实例是西妥昔单抗。在本发明的以上各方面的中，所述脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂通过选自静脉注射、静脉滴注、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下包埋、透皮吸收、肝动脉注射的胃肠外途径施用。优选地，所述脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂被配制为脂质体包埋的形式。本发明还提供一种药物组合物，其包含前面所述的血管内皮抑制素或者抗体，以及前面所述的脂筏-膜穴依赖型内吞通路的抑制剂。
在另一个方面，本发明还涉及筛选对抗肿瘤药物具有增效作用的脂筏-膜穴依赖型内吞通路调节剂的方法。本发明还涉及与NT作用原理相似的药物或试剂(如两性霉素B)，和与ES或EGFR单抗作用机理或内吞途径相似的药物试剂之间的联合用药方法、联合制剂和药物组合物。


图IA-E NT及其同类试剂(两性霉素B，甲基化@ -环糊精和菲律宾菌素)可以剂量依赖方式促进ES及其衍生物和修饰物在内皮细胞中的内吞摄取。A :使用Western Blotting方法检测出NT促进了 ES在血管内皮细胞中的内吞，且该促进作用与NT的浓度正相关。这种促进作用体现在ES内吞后在细胞质、细胞核组分，以及全细胞中的含量较没有NT时显著增加。
B :使用Western Blotting方法检测出NT促进了 ES在淋巴管内皮细胞中的内吞，且该促进作用与NT的浓度正相关。C :使用Western Blotting方法检测出两性霉素B,甲基化0 -环糊精和菲律宾菌素也能够促进ES在内皮细胞中的内吞，且该促进作用与NT的浓度正相关。D :使用Western Blotting方法检测出NT也能够促进PEG化ES在内皮细胞中的内吞，且该促进作用与NT的浓度正相关。E :使用Western Blotting方法检测出NT也能够促进N-末端带有附加氨基酸(M)GGSHHHHH的重组人血管内皮抑制素(Endu)及N-末端被PEG单点修饰的Endu(PEG-Endu)在内皮细胞中的内吞，且该促进作用与NT的浓度正相关。图2 :使用Western Blotting方法检测出ES与NT的联合用药通过增加ES在内皮细胞中的内吞，增强了 ES对于内皮细胞ERK与p38MAPK信号通路的抑制效果。图3A-B ES与NT联合应用抑制细胞迁移A :细胞迁移实验证实，ES与NT的联合用药增强了 ES对于内皮细胞活性的抑制效果，使得发生迁移的内皮细胞数目较没有NT时进一步减少。B :细胞迁移实验中迁移细胞数目的统计结果，反映了在不同药物处理下内皮细胞的迁移能力。图4A-E ES与NT联合应用抑制肿瘤生长并改善ES在肿瘤组织中的分布A ES与NT的联合用药在A549肺癌动物模型中能够进一步增强ES对于肿瘤生长的抑制效果。B :使用免疫荧光方法发现ES与NT的联合用药能够增强ES对于A549肺癌动物模型中肿瘤组织新生血管生成的抑制效果。C ES与NT联合用药在H22肝癌动物模型中能够进一步增强ES对于肿瘤生长的抑制效果。D :使用免疫荧光方法发现ES与NT的联合用药能够增强ES对于H22肝癌动物模型中肿瘤组织新生血管生成的抑制效果。E :使用动物荧光成像系统发现ES与NT的联合用药能够增强ES (带有罗丹明荧光标记)在荷瘤动物肿瘤组织中的摄取和分布。图5A-B NT促进EGFR单抗进入肿瘤细胞
A :使用Western Blotting方法检测出NT促进了 EGFR单抗在癌细胞中的内吞。B :使用活体荧光标记示踪方法发现NT与EGFR单抗联合用药能够加强EGFR单抗在小鼠移植肿瘤中的分布和摄取。发明详述本发明的目的是提供多烯类广谱抗生素NT及其同类药物的一种新用途。同时，为ES和EGFR单抗等借助脂後-膜穴依赖型内吞途径(caveola/lipid raft pathway)和笼形蛋白包被小泡内吞途径(clathrin-coated pits pathway)这两条途径发生内吞的蛋白药物提供一种增强疗效的新药物组合物和新用药方法。脂後(lipid raft)是质膜上富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域(microdomain)。鞘磷脂和鞘糖脂的饱和脂肪链紧密聚集，饱和脂肪链之间的空隙填满了作为间隔分子的胆固醇，形成液态有序相(liquid-ordered phase,即脂後)，直径大约在50nm左右。脂後是一 种动态结构，与细胞膜的信号转导、蛋白质分选均有密切关系。膜穴(也称细胞膜穴样内陷，质膜微囊，caveolae)是脂筏的一种结构，具有和脂後一样的膜脂组成，不含笼形蛋白(也称网格蛋白，clathrin),含有caveolin(—种小分子量蛋白，21KD)。大量存在于脂肪细胞、内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞等，与内吞有关。另外，膜穴中还富含某些信号分子，说明它与细胞的信号转导有关。笼形蛋白包被小泡(clathrin-coated pits)是笼形蛋白参与介导的内吞过程中形成的一种膜转运动态结构。依赖于该种结构的内吞方式即称为笼形蛋白包被小泡依赖型内吞途径。血管发生相关性疾病(Angiogenesis related diseases)和淋巴管发生相关性疾病(Lymphangiogenesis related diseases)即与血管和淋巴管异常生成密切相关的疾病，包括肿瘤，关节炎和牛皮癣等多种自身免疫性疾病，糖尿病，肥胖症以及多种眼科疾病。本发明显示，将脂筏-膜穴依赖型内吞通路的抑制剂NT与ES共同加入到血管内皮细胞的液体培养环境中，可以显著增强ES在血管内皮细胞中的内吞，且这种增强效果与NT的浓度正相关。同时，我们在淋巴管内皮细胞中也观察到了同样的结果。基于进一步实验事实，本发明还将NT的增效作用扩展至与NT作用原理相似的其他药物和试剂。如实施例I中所述，与NT作用原理相似的一类物质，如两性霉素B(AMB)、甲基化￠-环糊精(M3-CD)和菲律宾菌素(filipin)，也能够增强ES在内皮细胞中的内吞。AMB与filipin也是已经成药的抗真菌抗生素，与NT同样具有应用于实际联合用药的潜力。与此相类似的，两性霉素Wamphotericin B)，甲基化￠-环糊精(methyl-0-cyclodextrin)和菲律宾菌素(filipin)可以显著增强ES在血管内皮细胞中的内吞，且这种增强效果与上述多稀类抗生素的浓度正相关。同样的，NT还可以显著促进PEG修饰的ES (PEG-ES)，N-末端带有(M) GGSHHHHH附加氨基酸的ES (Endu)，以及N-末端被PEG单点修饰的Endu (PEG-Endu)在血管内皮细胞中的内吞，且这种增强效果与NT的浓度正相关。在分子细胞生物学水平上，本发明还通过实验证明了通过NT联合用药促进ES在血管内皮细胞中的内吞，并进一步增强ES对血管内皮细胞存活相关信号通路(如ERK和P38MAPK)的抑制效果。在细胞水平上，本发明证明了 NT与ES的联合用药增强了 ES对内皮细胞迁移活性的抑制效果。更进一步地，在A549肺癌和H22肝癌的动物肿瘤模型中，证明了 NT能够增强ES对于肿瘤生长以及肿瘤新生血管生成的抑制效果。更进一步的，NT还能够增强ES在肿瘤组织中的摄取和分布。本发明还发现，EGFR单抗药物作为EGFR的配体，其内吞的机制与ES有一定的相似性，它在肿瘤细胞中的内吞也能够被NT所调节。在分子细胞生物学水平上，本发明通过细胞学实验证明了通过NT联合用药促进EGFR单抗在癌细胞中的内吞。更进一步地，本发明还通过动物实验证明了 NT与EGFR单抗的联合用药促进了 EGFR单抗在小鼠移植肿瘤中的分布和摄取。因此，本发明公开了 NT这个现有的抗真菌抗生素药物的一种新用途，即通过联合用药的方式促进了现有抗肿瘤药物ES或EGFR单抗的摄入和药效，具有进一步应用于肿瘤治疗和肿瘤显像等领域的潜力。用高分子聚合物对蛋白进行修饰，是改变和控制药物的动力学特性如半衰期、免 疫学特征、毒理特性的常用方法。其中聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是应用最为普遍的一种蛋白修饰分子。本实验证明，经PEG(单甲氧基聚乙二醇丙醛)进行N-末端a -氨基定点修饰的ES蛋白及其衍生物Endu在内皮细胞中的内吞也因NT联合用药而显著增加。这一事实为NT与修饰、标记的ES或其衍生物联合用药达到增效目的的用药方法提供了理论依据。基于另一部分实验事实，本发明还将联合用药的适用范围扩展至其他与ES具有相似内吞途径和作用机理的药物，包括EGFR单抗和经过修饰、标记的基于EGFR单抗的分子等能够靶向肿瘤或肿瘤血管并用于治疗或显像用途的物质，也可因为NT等多烯类试剂的联合用药而促进药物摄取和效果。本发明还涉及一种NT (或AMB等)与ES联合用药的新剂型和药物组合物。ES应用于肿瘤治疗中的给药方式为静脉滴注。NT属多烯类广谱抗真菌抗生素，难溶于水，口服后胃肠道不易吸收，直接注射用药毒性较大。不过，有研究表明，NT可通过脂质体包埋方法实现静脉滴注给药，例如Aronex公司的NT脂质体剂型Nyotran已于1999年完成III期临床试验，有望近年上市，这将使NT实现静脉滴注的给药方式。AMB与NT同属于多烯类广谱抗真菌抗生素，作用机理完全相同。迄今为止，已有3种两性霉素B脂质体剂型药物在欧美上市(商品名分别为Abelcet、Amphocil和AmBisome),实现了这一类难溶性抗生素的静脉滴注给药。另一种两性霉素B脂质体静脉滴注液也于2003年上市，商品名为锋克松。因此，结合脂质体剂型和静脉滴注给药来制备ES或EGFR单抗与NT或AMB等联合用药的新剂型或新的药物组合物是完全可行的。
实施例实施例I :NT促进了 ES在血管及淋巴管内皮细胞中的内吞和摄取。人血管内皮细胞(HMEC) (ATCC保藏号分别为CRL 10636)，应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠形成腹腔淋巴管瘤，消化法分离获得鼠淋巴管内皮细胞mLEC(Zhuo ff. et al, Zhuoff. et al, Journal of Pathology ；222 :249-260), Endu(SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4, BPN末端具有9个额外的氨基酸(M)GGSHHHHH的ES，其中第一个氨基酸M在大肠杆菌中表达时可发生随机删除)(先声麦得津公司)，ES (SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2，其中第一个氨基酸M在大肠杆菌中表达时可发生随机删除)(Protgen),特异性修饰蛋白N-末端a-氨基的PEG试剂采用20kD的单甲氧基聚乙二醇丙醛(mPEG-ALD)(北京键凯科技有限公司)，PEG-ES及PEG-Endu由Protgen公司按照所用PEG试剂说明书提示制备，ES单克隆抗体购自Oncogene公司，NT及其他试剂均购自Sigma Aldrich公司。待血管内皮细胞贴壁生长至密度约90%时，更换为含有NT的DMEM培养基(Hyclone):将NT储液加入到培养基中，至一定终浓度(0 u g/ml, 25 u g/ml, 50 u g/ml)，于37°C ,5%C02培养箱中静置20min进行NT预处理；预处理之后将浓度为5mg/ml的ES储液加入培养基，至终浓度5 u g/ml，于37°C，5% CO2培养箱中静置30min使ES被血管内皮细胞内吞。内吞结束时弃培养基，用冰PBS洗3次，收集内皮细胞。使用Western Blotting方法，检测全细胞裂解液、细胞质及细胞核等组分中ES的摄入水平，与没有NT共同处理的细胞中ES内吞量进行比较。结果表明，在ES剂量相同、内吞时间相同的情况下，全细胞裂解液、细胞质或细胞核组分中ES的含量均因NT的联合使用而显著增加，25 ii g/ml及50 y g/ml的NT分别可使ES内吞摄取量提高约2倍和15倍，且ES内吞增加的幅度与所用NT的浓度正相关(图1A)。 用分别含有NT浓度为0，75，150和300 u g/ml的培养基于37°C对mLEC细胞进行预处理30min，然后在37°C条件下用含有ES浓度为g/ml的培养液孵育15min，用PBS清洗三遍，收细胞。利用Western blotting对不同浓度NT处理的淋巴管内皮细胞进行ES内吞测定，结果显示75，150和300 u g/ml的NT可分别使ES在淋巴管内皮细胞中的内吞量提高约16，32和78倍，且ES内吞增加的幅度与所用NT的浓度正相关(图1B)。在本实施例中，NT还可以被替换为与NT作用机理相同的药物，如两性霉素B (25-50 u g/ml)，甲基化P -环糊精(l_2mM)和菲律宾菌素(2. 5-5 u g/ml)，都能够促进ES在内皮细胞中的内吞(图1C)。在本实施例中，ES还可以被替换为与ES内吞机理相同的药物，如PEG化修饰的 ES。使用分子量为20kDa的特异性修饰蛋白N-末端的聚乙二醇修饰试剂(单甲氧基聚乙二醇并醛，mPEG-ALD)来修饰ES，其产物(简称PEG-ES)为一个聚乙二醇分子与一个重组人内皮抑制素相连，连接位点为蛋白的N-末端a-氨基的蛋白。结果表明，在PEG-ES剂量相同、内吞时间相同的情况下，血管内皮细胞对于PEG-ES的内吞也由于NT的联合使用而显著增加，而且PEG-ES内吞增加的幅度与所用NT的浓度正相关(图1D)。在另一种ES的衍生物Endu的内吞实验中也观察到了类似的结果，即在Endu及其N-末端a -氨基单一定点PEG修饰产物PEG-Endu剂量相同、内吞时间相同的情况下，血管内皮细胞对于Endu及PEG-Endu的内吞也由于NT的联合使用而显著增加，而且Endu及PEG-Endu内吞增加的幅度与所用NT的浓度正相关(图1E)。实施例2 :NT增加了 ES在内皮细胞中的内吞，从而增强了 ES对于内皮细胞信号通路的抑制作用。Kim et al (2002)发现ES在内皮细胞中可以抑制内皮细胞内细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,简称ERK)、p38促分裂素原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases,简称p38MAPK)和 pl25 局部粘着斑激酶(pl25focal adhesion kinase,简称pl25FAK)介导的信号转导通路,从而发挥抑制内皮细胞的活性(Kim et al，J. Biol. Chem. 2002，277，27872—27879)。本实施例选用 ERK 和 p38 MAPK 这两条信号通路作为检测指标，NT的联合使用进一步增强了 ES对于这些信号通路的抑制作用。本实施例中，内皮细胞被分成四组加以不同处理。第一组阴性对照组，无NT处理，也无ES处理；第二组，NT处理组，只有NT(50ii g/ml，20min)处理，无ES处理；第三组，ES处理组，无NT处理，只有ES(5ii g/ml，30min)处理；第四组，NT与ES联合用药组，NT (50 y g/ml，先于ES 20min加入)和ES (5 y g/ml，30min)联合处理。按实施例I中的方法对细胞进行NT或ES相应处理，收集细胞，检测ERK和p38MAPK信号通路。结果显示，与对照组相t匕，第二组仅用NT处理不会影响ERK和p38MAPK信号的水平；第三组ES处理抑制了 ERK和P38MAPK信号通路，与Kim et al的报道相符；第四组NT和ES联合用药增加了 ES的内吞，并进一步增强了 ES对ERK和p38MAPK信号通路的抑制作用。这证明了 NT的联合用药进一 步增强了 ES对细胞活化信号通路的抑制作用(图2)。实施例3 NT增强了 ES对于内皮细胞迁移的抑制效果。细胞迁移的测定方法内皮细胞(HMEC，每孔2父104个细胞)接种到TranswellTM板(8 u m孔径,Costar)的上层含 0. 5%胎牛血清(Hyclone)以及 10ng/ml VEGF(PeproTechEC)的DMEM(Hyclone)培养基中。同时在板的上层和下层加入一定浓度的ES(40 y g/ml)或NT (50 u g/ml)，在37°C和5% CO2中继续培养6小时使细胞迁移。用戊二醛固定和结晶紫染色后，每个孔随机选取5个高倍放大(400倍)视野(Olympus 1X71),计算其中完全穿过膜迁移到板下层的细胞数并取平均值，每一组平行三个孔，实验重复两次。本实施例中，内皮细胞也被分成四组加以不同处理。第一组阴性对照组，无NT处理，也无ES处理；第二组，NT处理组，只有NT (50 ii g/ml)处理，无ES处理；第三组，ES处理组，无NT处理，只有ES (40 u g/ml)处理；第四组，NT与ES联合用药组，NT (50 u g/ml)和ES(40 u g/ml)联合处理。结果显示，与对照组相比较，第二组仅用NT处理，基本不影响内皮细胞的迁移能力；第三组ES处理能抑制内皮细胞迁移，减少了内皮细胞迁移到下层膜的数量，抑制率为61%;第四组NT和ES联合用药，增强了 ES对内皮细胞迁移的抑制作用，发生迁移的细胞很少，抑制率为87% (相对于ES组结果，P < 0.001)。上述结果说明，NT增强了 ES对于内皮细胞迁移的抑制作用。各处理组迁移细胞代表性视野(图3A)，各处理组迁移细胞计数平均值比较(图3B)。实施例4 NT能够在动物模型中增强ES对于肿瘤生长和新生血管生成的抑制作用，并促进ES在肿瘤组织中的摄取和分布。培养处于旺盛增殖状态的人源肺腺癌A549细胞(ATCC保藏号为CCL-185)接种至6 8周龄的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下。当肿瘤体积达到IOOmm3左右时，将荷瘤裸鼠分为四组进行不同的给药处理。第一组阴性对照，生理盐水处理组；第二组，NT给药组,只有NT (6mg/kg,腹腔注射,每天一次)给药处理，无ES给药处理；第三组，ES给药组，无NT给药处理，只有ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)给药处理；第四组，NT与ES联合用药组，NT (6mg/kg,腹腔注射，每天一次)和ES (12mg/kg,腹腔注射，每天一次)联合给药。给药两周后，裸鼠被处死，称肿瘤并比较肿瘤体积。结果显示，与对照组相比较，第二组仅用NT给药处理对肿瘤生长没有抑制作用；第三组ES处理能抑制肿瘤生长，抑瘤率约40% ;第四组NT和ES联合用药，增强了 ES对肿瘤生长的抑制作用，抑瘤率提高到60%左右。这说明在动物模型中，NT能够显著增强ES的抑瘤活性(图4A)。各组实验动物的体重、进食和日常活动均未发生异常改变。肿瘤内血管发生水平的检测方法所有四组的裸鼠的肿瘤被取出、固定、切片。使用抗⑶31 (肿瘤血管内皮细胞的标志分子)的一抗以及FITC标记的二抗(Santa Cruz)检测，在Nikon Al激光扫描共聚焦成像系统下观察(Nikon Inc.)。各组肿瘤随机选取高倍放大(400倍)视野，使用显微镜系统自带软件计算各个视野中血管截面积并取平均值进行比较。NT增强ES抑制肿瘤组织新生血管生成活性的作用与其增强ES抑瘤活性的作用相类似。各处理组肿瘤平均重量比较(图4A)，各处理组肿瘤组织平均血管面积(相对单位，arbitrary unit)比较(图 4B)NT显著增强ES抑制肿瘤生长和肿瘤新生血管生成活性的作用在H22肝癌的动物模型中也得到了验证。各处理组肿瘤平均重量比较(图4C)，各处理组肿瘤组织平均血管面 积(相对单位,arbitrary unit)比较(图4D)各组实验动物的体重、进食和日常活动均未发生异常改变。荧光标记ES在荷瘤小鼠的肿瘤组织中摄取和分布的检测方法培养处于增殖状态的人源肺腺癌A549细胞接种至6 8周龄的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下。当肿瘤体积达到300mm3左右时给药。荷瘤裸鼠分为两组进行不同的给药处理(每组四只)。第一组ES给药组，无NT给药处理，只有罗丹明(Pierce)荧光标记ES (剂量20mg/kg)腹腔注射给药；第二组，NT与ES联合用药组，NT (6mg/kg，腹腔注射)和罗丹明荧光标记ES (20mg/kg,腹腔注射)联合给药。给药4小时后，取出肿瘤组织，利用动物荧光成像系统(清华大学生物医学工程系)对肿瘤中荧光标记ES的摄取量进行显像与定量分析。NT增强了 ES在动物肿瘤组织中的摄取和分布，增幅达到4倍(图4E)。实施例5 :NT能够显著增加EGFR单抗(西妥昔单抗)在肿瘤细胞中的内吞和在动物肿瘤组织中的摄取和分布。本实施例中选用表达EGFR的人源肺腺癌A549细胞，待其贴壁生长至密度约90%时，更换为含有NT的DMEM培养基将NT储液加入到培养基中，至一定终浓度(0 u g/ml,25 u g/ml, 50 u g/ml)，于37°C，5% CO2培养箱中静置20min进行NT预处理；预处理之后将浓度为5mg/ml的EGFR单抗(西妥昔单抗，Merck公司)储液加入培养基,至终浓度5 y g/ml，于37°C，5% CO2培养箱中静置30min使EGFR单抗被内皮细胞内吞；内吞结束时弃培养基，用冰PBS洗3次，收集内皮细胞。使用Western Blotting方法，检测细胞组分中EGFR单抗的摄入水平，与没有NT共同处理的细胞中EGFR单抗内吞量进行比较。结果表明，在EGFR单抗剂量相同、内吞时间相同的情况下，细胞中EGFR单抗的内吞量因NT的联合使用而显著增加，即NT能够促进内皮细胞中对EGFR单抗的内吞，而且EGFR单抗内吞量增加的幅度与所用NT的浓度正相关(图5A)。培养处于增殖状态的人源肺腺癌A549细胞接种至6 8周龄的裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下，分两组，每组4只。当肿瘤体积达到500_3左右时，一组小鼠给以荧光(Cy5. 5，GE公司)标记的EGFR单抗，另一组小鼠给以荧光标记的EGFR单抗(与前一组剂量相等)加上NT的联合用药。使用荧光成像系统(清华大学生物医学工程系)对这两组取出的小鼠肿瘤中EGFR单抗的荧光信号进行检测，证明NT可增强EGFR单抗在肿瘤组织中的摄取和分布，有促进药物摄取、提高疗效和用于肿瘤成像研究的作用(图5B)。


本发明提供一种通过促进靶细胞对治疗剂的摄取而提高其疗效的方法和组合物，所述的组合物含有脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂，所述治疗剂例如为抗肿瘤药物。本发明也涉及含有脂筏-膜穴依赖型内吞通路的调节剂和治疗剂的药物组合物。本发明还涉及筛选对抗肿瘤药物具有增效作用的脂筏-膜穴依赖型内吞通路调节剂的方法。