一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法及其应用的制作方法[0002]目前在组织工程骨构建过程中，种子细胞的使用过程中，在种子细胞与支架材料复合时需进行种子细胞消化收集等破坏其胞外基质的诸多步骤，这将无疑导致所采用种子细胞的活性降低；此外，多采用单一类型的种子细胞-成骨细胞，因其是成骨的主要、直接细胞成分。[0003]造成这一问题的原因在于:用于完成组织工程骨构建的支架材料由于需提供足够的骨功能替代而多为大块形，因此其比 表面积、有效粘附面积等细胞培养相关参数均较低，不利于用于种子细胞的体外培养；而目前用于种子细胞体外培养的支架如微载体等均由于降解性差、生物相容性差及造价高等种种原因而不能用于体内移植，进而导致种子细胞在组织工程骨构建过程中需经历反复的消化分离步骤。此外，在骨组织工程构建中，目前对于种子细胞的选择尚以经培养并成骨诱导的BMSCs (骨髓间充质干细胞)为主，由其产生的成骨细胞可直接完成体内成骨活动，因此成为种子细胞的首选，但是，有相关研究表明，骨组织形成过程中，除成骨细胞等实质细胞外，支持细胞如成纤维细胞、内皮细胞等也发挥着不可替代的作用，另有部分实验也证实了在骨组织工程构建中添加成纤维细胞可明显促进成骨质量及成骨速度，但目前尚缺乏较为可行的联合使用成骨细胞及成纤维细胞的方法，使用较多的即为在移植前分别与支架材料完成复合以进一步体内移植。[0004]目前的组织工程骨构建策略中，由于反复的细胞消化分离，其种子细胞活性及细胞利用率均明显降低，进而导致构建效率低下；此外，单纯使用成骨细胞完成组织工程骨构建而进行的体内骨缺损修复效果局限较大，可被大范围的提高，而联合使用成纤维细胞则是得到此效果的可选途径之一。
[0005]本发明的目的在于提供一种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法及其应用，提高种子细胞利用效率，丰富骨修复种子细胞类型，大范围提高骨缺损修复效果。[0006]为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案:[0007]—种具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法包括以下步骤:
[0008]I)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨进行冷冻粉碎，然后筛选出粒径小于200 μ m的颗粒，再将筛选出的颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；
[0009]2)脱细胞真皮基质微颗粒制备:取全厚皮肤，灭菌后用NaCl溶液浸泡，剥离表皮层后用十二烷基苯磺酸钠溶液浸泡，然后用PBS缓冲液漂洗，用胰蛋白酶溶液浸泡消化后，再用PBS漂洗，然后经冷冻粉碎后筛选出粒径小于200 μ m的颗粒，将筛选出的颗粒进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒；
[0010]3)利用脱钙骨基质微颗粒进行BMSCs培养细胞7-21天，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养；
[0011]在37°C、C02体积浓度为5%、饱和湿度的条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞7-21天，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养；
[0012]按质量比(1-3):1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物。
[0013]所述步骤I)中将牛皮质骨进行冷冻粉碎前在-80°C保存至少24-36h。
[0014]所述步骤I)中脱脂处理的具体条件为:将筛选出的颗粒放入混合液中，搅拌2_6h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比(1-3):1混合得到的，且每3mL的混合液中加入Ig颗粒；脱钙处理的具体条件为将脱脂后的颗粒，加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌36-72h ;其中，向每3mL浓度为0.5mol/L的盐酸中加入Ig脱脂后的颗粒。
[0015]所述步骤2)中NaCl溶液的浓度为lmol/L，用NaCl溶液浸泡的时间为12_24h ；十二烷基苯磺酸钠溶液的质量分数为0.5%，用十二烷基苯磺酸钠溶液浸泡的时间为
12-24h ;胰蛋白酶溶液的质量分数为0.25%，用胰蛋白酶溶液浸泡消化的时间为24-36h。
[0016]所述步骤3)中成骨诱导液由DMEM培养液、β -甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成，成骨诱导液中DMEM培养液为含FBS的DMEM培养液，并且DMEM培养液中FBS的体积分数为10%; β-甘油磷酸钠的浓度为lOmmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为100mmol/L。
[0017]所述步骤3)中成纤维细胞诱导液包括EGF-1和TGF-β 1，并且EGF-1的浓度为6~15ng/mL, TGF- β I 的浓度为 0.6-1.3ng/mL。
[0018]一种具有诱导活性微载体-细胞复合物在制备治疗腔隙性骨缺损及节段性骨缺损修复材料中的应用。
[0019]按Ig: (0.5-1) mL将具有诱导活性微载体-细胞复合物与藻酸盐凝胶、PRP凝胶或壳聚糖凝胶混合均匀，制得治疗腔隙性骨缺损的材料。
[0020]具有诱导活性微载体-细胞复合物通过与孔径为500-1000 μ m的大孔径支架材料联合，制备治疗节段性骨缺损修复的材料。
[0021]相对于现有技术，本发明具有的有益效果:本发明通过将牛皮质骨进行脱脂和脱钙处理，制得脱钙骨基质微颗粒；通过全厚皮肤制备脱细胞真皮基质微颗粒，然后对脱钙骨基质微颗粒和脱细胞真皮基质微颗粒进行体外培养并促使BMSCs分化得到成骨细胞及成纤维细胞，最后制得具诱导活性微载体-细胞复合物，其种子细胞活性更高，体内修复效果更好，所以能够应用于制备治疗腔隙性骨缺损及节段性骨缺损修复材料中，并可提高组织工程骨的体内修复效果2倍以上；通过在组织工程骨构建过程中添加支持细胞(成纤维细胞)成分，在体内骨生成中促进成骨实质细胞(成骨细胞)的成骨效果，其新生骨强度、基质成分含量及钙化程度等均可得到1.5-2倍的提高。本发明可明显提高种子细胞利用效率，丰富骨修复种子细胞类型，大范围提高骨缺损修复效果。
[0022]本发明的制备方法简单易行，成本低，是一种有效制备具有诱导活性微载体-细胞复合物的方法。



[0023]图1为本发明制备方法及应用示意图。

[0024]下面结合附图对本发明做详细说明。
[0025]参见图1，本发明具有诱导活性微载体-细胞复合物的制备方法包括以下步骤:
[0026]I)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨冻骨在-80°C保存24_36h后，进行冷冻粉碎；筛选出粒径小于200um的颗粒；将颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；脱脂及脱钙处理的具体条件为，将颗粒放入脱脂混合液中，搅拌2-6h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比(1-3):1混合得到的，且每3mL的混合液中加入Ig颗粒；将脱脂后的颗粒加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌48-72h，得到脱钙骨基质微颗粒，其中，向每3mL的浓度0.5mol/L的盐酸中加入Ig脱脂后的颗粒。
[0027]2)脱细胞真皮基质微颗粒制备:取全厚皮肤，首先进行灭菌处理，用lmol/LNaCl溶液浸泡12_24h，剥离表皮层后以质量分数0.5%的SDS (十二烷基苯磺酸钠)浸泡12_24h后用PBS缓冲液漂洗，然后用质量分数为0.25%的胰蛋白酶进行细胞消化24-36h，直至消化全部细胞，再用PBS缓冲液漂洗，经冷冻粉碎后筛选出<200um的微颗粒，进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒。 [0028]3)利用脱钙骨 基质微颗粒进行BMSCs细胞培养14天，(培养7_21天均可，本实施例中培养14天)，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成骨诱导液由DMEM培养液、β -甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成；其中，成骨诱导液中培养液为体积分数10% FBS的DMEM培养液，β -甘油磷酸钠的浓度为lOmmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为lOOmmol/L ;其中，BMSCs为骨髓间充质干细胞。
[0029]在37°C、CO2体积浓度为5%、饱和湿度条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞14天(培养7-21天均可，本实施例中培养14天)，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成纤维细胞诱导液包括EGF-1 (内皮细胞生长因子-1)和TGF- β I ( β 1-转化生长因子)，并且EGF-1的浓度为6~15ng/mL，TGF-β I 的浓度为 0.6-1.3ng/mL ；
[0030]按质量比(1-3):1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物。
[0031 ] 下面通过具体实施例进行说明。
[0032]实施例1
[0033]I)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨冻骨在-80°C保存24h后，进行冷冻粉碎；筛选出粒径小于200um的颗粒；将颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；脱脂及脱钙处理的具体条件为，将颗粒放入脱脂混合液中，搅拌6h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比1:1混合得到的，且每3mL的混合液中加入Ig颗粒；将脱脂后的颗粒加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌60h，得到脱钙骨基质微颗粒，其中，向每3mL的浓度0.5mol/L的盐酸中加入Ig脱脂后的颗粒。
[0034]2)脱细胞真皮基质微颗粒制备:取全厚皮肤，首先进行灭菌处理，用lmol/LNaCl溶液浸泡16h，剥离表皮层后以质量分数0.5%的SDS (十二烷基苯磺酸钠)浸泡24h后用PBS缓冲液漂洗，然后用质量分数为0.25%的胰蛋白酶进行细胞消化24h，直至消化全部细胞，再用PBS缓冲液漂洗，经冷冻粉碎后筛选出<200um的微颗粒，进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒。
[0035]3)利用脱钙骨基质微颗粒进行BMSCs细胞培养14天，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成骨诱导液由DMEM培养液、β -甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成；其中，成骨诱导液中培养液为体积分数10% FBS的DMEM培养液，β -甘油磷酸钠的浓度为10mmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为IOOmmoI/L ;其中，BMSCs为骨髓间充质干细胞。
[0036]在37V、CO2体积浓度为5%、饱和湿度条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞14天，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成纤维细胞诱导液包括EGF-1 (内皮细胞生长因子-1)和TGF-β 1(β 1-转化生长因子)，并且EGF-1的浓度为6ng/mL，TGF-β I的浓度为Ing/mL。
[0037]按质量比1:1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活 性微载体-细胞复合物。
[0038]实施例2
[0039]I)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨冻骨在-80°C保存36h后，进行冷冻粉碎；筛选出粒径小于200um的颗粒；将颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；脱脂及脱钙处理的具体条件为，将颗粒放入脱脂混合液中，搅拌2h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比2:1混合得到的，且每3mL的混合液中加入Ig颗粒；将脱脂后的颗粒加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌72h，得到脱钙骨基质微颗粒，其中，向每3mL的浓度0.5mol/L的盐酸中加入Ig脱脂后的颗粒。
[0040]2)脱细胞真皮基质微颗粒制备:取全厚皮肤，首先进行灭菌处理，用lmol/LNaCl溶液浸泡12h，剥离表皮层后以质量分数0.5%的SDS (十二烷基苯磺酸钠)浸泡12h后用PBS缓冲液漂洗，然后用质量分数为0.25%的胰蛋白酶进行细胞消化36h，直至消化全部细胞，再用PBS缓冲液漂洗，经冷冻粉碎后筛选出<200um的微颗粒，进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒。
[0041]3)利用脱钙骨基质微颗粒进行BMSCs细胞培养7天，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成骨诱导液由DMEM培养液、β -甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成；其中，成骨诱导液中培养液为体积分数10% FBS的DMEM培养液，β -甘油磷酸钠的浓度为10mmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为IOOmmoI/L ;其中，BMSCs为骨髓间充质干细胞。
[0042]在37V、CO2体积浓度为5%、饱和湿度条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞7天，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成纤维细胞诱导液包括EGF-1 (内皮细胞生长因子-1)和TGF-β 1(β 1-转化生长因子)，并且EGF-1的浓度为15ng/mL，TGF-β I的浓度为0.6ng/mL。
[0043]按质量比2:1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物。
[0044]实施例3
[0045]I)脱钙骨基质微颗粒制备:将牛皮质骨冻骨在-80°C保存30h后，进行冷冻粉碎；筛选出粒径小于200um的颗粒；将颗粒进行脱脂及脱钙处理，得到脱钙骨基质微颗粒；脱脂及脱钙处理的具体条件为，将颗粒放入脱脂混合液中，搅拌4h，得脱脂后的颗粒；其中，混合液为甲醇和氯仿按体积比3:1混合得到的，且每3mL的混合液中加入Ig颗粒；将脱脂后的颗粒加入到0.5mol/L的盐酸溶液中，搅拌48h，得到脱钙骨基质微颗粒，其中，向每3mL的浓度0.5mol/L的盐酸中加入Ig脱脂后的颗粒。
[0046]2)脱细胞真皮基质微颗粒制备:取全厚皮肤，首先进行灭菌处理，用lmol/LNaCl溶液浸泡24h，剥离表皮层后以质量分数0.5%的SDS (十二烷基苯磺酸钠)浸泡18h后用PBS缓冲液漂洗，然后用质量分数为0.25%的胰蛋白酶进行细胞消化30h，直至消化全部细胞，再用PBS缓冲液漂洗，经冷冻粉碎后筛选出<200um的微颗粒，进行冻干处理，得到脱细胞真皮基质微颗粒。
[0047]3)利用脱钙骨基质微颗粒进行BMSCs细胞培养21天，分化为成骨细胞，得到成骨细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成骨诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成骨诱导液由DMEM培养液、β -甘油磷酸钠、维生素C和地塞米松组成；其中，成骨诱导液中培养液为体积分数10% FBS的DMEM培养液，β -甘油磷酸钠的浓度为10mmol/L，维生素C的浓度为0.05mmol/L，地塞米松的浓度为IOOmmoI/L ;其中，BMSCs为骨髓间充质干细胞。
[0048]在37V、CO2体积浓度为5%、饱和湿度条件下，利用脱细胞真皮基质微颗粒进行BMSCs培养细胞21天，分化为成纤维细胞，得到成纤维细胞-微颗粒复合物；其中，在培养过程中添加促进分化确保干细胞分化效果的成纤维诱导液，或直接进行已分化细胞的体外培养，所述成纤维细胞诱导液包括EGF-1 (内皮细胞生长因子-1)和TGF-β 1(β 1-转化生长因子)，并且EGF-1的浓度为10ng/mL，TGF-β I的浓度为1.3ng/mL。
[0049]按质量比3:1将成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物充分混匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物。
[0050]如图1所示，本发明具有诱导活性微载体-细胞复合物在制备治疗腔隙性骨缺损及节段性骨缺损修复材料中的应用。
[0051]体外微载体-细胞复合物构建:分别将脱钙骨基质微颗粒和脱细胞真皮基质微颗粒在动态条件下进行BMSCs培养14天，两组培养独立进行，届时可查见其分别已向成骨、成纤维分化，为确保其分化效果，可在培养过程中，可在培养后期(前期为增长期)添加液体诱导因子等促进其分化；已分化细胞培养:因脱钙骨基质微颗粒和脱细胞真皮基质微颗粒分别具有不同的诱导活性，因此可用于对相应已分化细胞的培养，即成骨细胞及成纤维细胞等，利用脱钙骨基质微颗粒和脱细胞真皮基质微颗粒本身的诱导活性以在体外培养过程中维持其表型，得到成骨细胞-微颗粒复合物和成纤维细胞-微颗粒复合物。
[0052]体内骨缺损修改的应用:
[0053]按(1-3):1的质量比，将成骨细胞-微颗粒复合物及成纤维细胞-微颗粒复合物混合均匀，得到具有诱导活性微载体-细胞复合物，二者质量比可根据需要进一步的实验明确及对不同个体、部位的个体化设计。
[0054]微载体-细胞复合物体内移植的移植方式:按质量比lg:(0.5_l)mL，体积/质量比将具有诱导活性微载体-细胞复合物通过与藻酸盐凝胶、PRP(富血小板血浆)凝胶、壳聚糖凝胶等凝胶混合的方式制备出可注射型组织工程骨材料，此时多为腔隙性骨缺损修复；或者通过与大孔径支架材料(孔径为500-1000Um)联合，应用于体内移植，依靠大孔径支架材料提供的力学保护，可用于节段性(大段、负重区)骨缺损修复。
[0055]本发明中通过制备脱钙骨基质及脱细胞真皮基质微颗粒，并用其进行BMSCs体外培养，在静态或动态条件下进行培养扩增，因其可分别诱导经其培养的BMSCs分化为成骨细胞(OB)及成纤维细胞(FB)，同时结合其良好的生物相容性，作为可植入型骨组织工程支架材料，以培养所得的OB-微颗粒复合物及FB-微颗粒复合物进行混合后植入体内完成骨修复行为。 [0056]本发明中所涉及的两种微颗粒(即脱钙骨基质微颗粒和脱细胞真皮基质微颗粒)一经制备后，即可用于对BMSCs的体外培养，因其本身具有相应的分化诱导活性，可促使BMSCs分别形成OB及FB细胞；随后按照(1_3):1的质量比将二者形成后联合应用与体内完成新骨生成，体内移植方式包括利用凝胶形成可注射型材的细胞-微颗粒复合物进行混合料及联合大孔径材料构建大块型替代物等。