专利名称：一种诱导阴道β防御素2分泌的促进剂及其制备方法β -防御素2是阴道最主要的抗菌肽，具有可诱导表达的特点，通常情况下微量表 达，但在受到致病因子刺激时，防御素2表达量迅速提高，进而发挥粘膜保护功能。近 年研究结果表明，妇女阴道分布着大量防御素，参与其天然免疫防御机制，G—和G+、白假丝 酵母菌、TNF-a、IL-I β、雌激素等可促进β -防御素2在生殖系统上皮细胞中的表达。对 于β-防御素2的诱导性表达的研究可能给治疗阴道感染性疾病带来了新的思路，在人工 合成防御素尚存在技术、价格上的种种难题而不能有重大突破时，提取乳杆菌有效成分，研 制无毒、安全的微生物成分制成的免疫制剂以刺激β-防御素2在阴道粘膜局部的高表达， 来达到预防和治疗阴道感染性疾病的目的可能是一个可行的方法。经检索，乳杆菌细胞壁成分的阴道粘膜β防御素2分泌的促进剂应用，目前尚无 报道。
本发明目的是提供一种诱导阴道β防御素2分泌的促进剂，它的主要成分是乳杆 菌细胞壁成分。本发明的另一个目的是提供该阴道β防御素2分泌的促进剂的应用。本方法的具体步骤是从乳杆菌菌体中通过热水提取有生物活性的粗多糖、去蛋 白、除盐、柱层析纯化和冷冻干燥。本发明具体工艺步骤如下1、乳杆菌发酵其菌体浓缩本发明所涉及到的乳杆菌包括嗜酸乳杆菌、保加利亚 乳杆菌、德氏乳杆菌。将乳杆菌种子液接入已经灭菌后的每IOOml培养基中含有大豆蛋 白胨 1-1. 5g，鱼胨 1-1. 5g，葡萄糖 2g，牛肉膏 0. 5-2g，酵母膏 0. 5_2g，K2HPO4 0. 2-0. 6g。经 35-38。C厌氧发酵后，再经离心浓缩即获得乳杆菌菌体浓缩物。2、细胞破壁将该乳杆菌菌体浓缩物加蒸馏水或生理盐水(1 3-1 5)，使用高 压细胞破碎机操作压力IOOMPa左右以高压破碎菌体细胞壁。(3)将经步骤( 破碎菌体细胞壁，PBS洗涤6次后取沉淀物，加入10倍的4% SDS 室温孵育、过夜溶解细菌；(4)将经步骤C3)菌体样品，PBS洗涤10次后去掉细胞碎片和SDS，弃去上清液，依 次用250μ g/ml DNase I、RNase、胰蛋白酶孵育去除乳杆菌上所有连念物(各37°C X4h， PBS洗2次)，弃去上清液；(5)取经步骤(3)的沉淀物湿重约20g加入60ml PBS置于乙醇中超声处理2h (频 率25次/min，超声IOs停5s)，超速低温离心机离心Ih ；(6)纯化将经步骤(5)沉淀物，真空冷冻干燥，得层析纯乳杆菌细胞壁成分。本发明的有益效果传统的β -防御素2表达诱导剂为葡萄球菌、大肠埃希菌和一些厌氧菌以及前炎 症因子如脂多糖、IL-Ιβ和TNF-α，这些诱导因子往往是机体的炎症反应，不具有实际应 用价值，本发明β防御素2分泌的促进剂为乳杆菌细胞壁成分，使用上安全，是一种颇具应 用潜力的防治细菌阴道感染的制剂。4达到最高。4.小鼠阴道组织β -防御素2的蛋白表达结果Western blot结果生理盐水组小鼠阴道组织中未检测到β _防御素2蛋白表达， 而100mg/L浓度LCWE处理组和大肠埃希菌组出现特异性条带，100mg/L浓度LCWE处理组可 以显著诱导小鼠阴道组织防御素2蛋白表达。提示LCffE对小鼠阴道组织β-防御素 2的表达有诱导作用，而且与LCWE的浓度有关。经20mg/L含有乳杆菌细胞壁成分的诱导阴道组织β防御素2分泌的促进剂阴道 处理后，阴道β防御素2活性开始提高，14天时，活性达到最大值，比对照组高出3倍多，之 后开始下降二8天时经处理的阴道β防御素2活性仍然高于对照组。
本发明涉及一种诱导阴道β防御素2分泌的促进剂。本发明所提供的诱导阴道β防御素2分泌促进剂，它的活性成分为乳杆菌细胞壁成分。β-防御素2具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，不受传统抗生素耐药菌株影响。无毒、安全的微生物成分制成的阴道β防御素2分泌的促进剂以刺激β-防御素2在阴道粘膜局部的高表达，来达到预防和治疗阴道感染性疾病的目的可能是一个可行的方法。