专利名称：人皮肤表皮细胞增殖促进剂、包含该促进剂的皮肤外用组合物及化妆品的制作方法肌肤粗糙、皱纹、肌肤的松弛、张力的降低等肌肤问题特别对于女性而言是重大关 心事情。可以认为这些肌肤问题通常是由环境因素、与老化等年龄增长相伴随的因素、以及压力等心理因素等引起的。特别是，可以说与近年来的紫外线的增大、空调的大量使用等相伴随的生活环境的干燥化等所造成的对肌肤带来不良影响的环境因素不断增大。皮肤组织包含表皮、真皮、皮下组织。已知表皮为形成皮肤的最外层的构成要素，而且基本由角质层、颗粒层、棘层、基底层构成。在表皮中，在作为最下层的基底层分裂产生新的角质形成细胞(表皮细胞)，细胞逐渐向上方改变功能和形态，同时上升，形成角质层的角质细胞后，最后从皮肤的表面剥落。在人的健康皮肤中，在基底层表皮细胞分裂，它们上升而形成角质细胞，从皮肤表面剥落，可以说需要28天左右。将这样的从表皮细胞的分裂开始到细胞在细胞表面剥离为止的一连串流程称为更新(turnover)，通过在表皮反复进行这样的更新，从而在皮肤中进行新陈代谢而形成正常健康的皮肤。然而，已知随着年龄增长，该更新的周期变慢，由于更新周期慢，因而皮肤表面残留老的角质等，导致肌肤的暗淡、肌肤粗糙的状态等。因此，通过推进皮肤表皮细胞增殖促进，使皮肤的新陈代谢活化，维持更新的周期，形成正常健康的皮肤表面，这会使肌肤的湿润提高，调理肌肤的纹理，可以说带来生活质量(QOL)的提闻。表皮(上皮)细胞生长因子(Epidermal growth factor (EGF))为已知存在于包括人的动物的体内的上皮细胞再生因子，是从小鼠的腭下腺的提取物中作为蛋白质的一种首次发现的(mEGF (小鼠EGF))。EGF在每种动物种类中分别不同，小鼠EGF直接在人中不显示细胞增殖促进效果。关于人EGF也已经被发现，已知EGF对位于皮肤表面的细胞起作用，促进细胞的增殖。另一方面，例如，日本特开2009 - 234980号公报中记载了，人随着年龄增大，EGF的分泌量减少(Life Sciences vol. 31，pp679_683，1982)，这是肌肤的老化现象的一个原因。因此，认为通过对肌肤补给EGF，可以促进人表皮中的细胞的新生(增殖)，可以使肌肤的状态良好。已知燕窝是穴燕使自己的唾液成为丝状而作成的巢，作为其成分，大量包含糖蛋白，几乎不含脂质。以往，在中国菜的食用原材料、中药的原料等中使用燕窝。近年来，还开发了将燕窝用作原料的健康食品等，但仍仅仅知道极少数外用剂、化妆品那样的在外用用途中的适用例。日本特开2003- 095961号公报中公开了使用了燕窝的酶解物的经口用的美肤促进剂。然而，这里，只不过仅示出了经口用途，对于在外用用途中的利用可能性没有任何记载和暗示。此外这里的效果为提高皮肤的保水性，形成湿润的纹理细的肌肤，而关于通过促进表皮中的细胞增殖来维持更新周期，实现肌肤的纹理细等肌肤的状态的维持、提高，没有任何记载。W099/022709中公开了包含燕窝的含水溶剂提取物、特别是热水提取物的化妆品。该化妆品可以用于皮肤护理用途，在外用用途中使用。然而，这里所使用的提取物为将燕窝进行热水提取，除去固体成分而得的提取物，与将燕窝整体进行酶处理而直接使用的燕窝酶解物明显不同。此外关于效果，也与基于促进表皮中的细胞增殖的本发明的效果不同。日本特开2009 - 234980号公报中涉及包含EGF相关物质和神经氨酸类的美容组合物，这里公开了利用燕窝作为神经氨酸类的补给源之一。然而，这里，神经氨酸类是为了 活化EGF相关物质而被使用的，EGF相关物质为必须的成分，另一方面，燕窝不是必须成分，只不过作为鸡蛋、牛乳和神经氨酸类的供给源而被期待。本发明人等此次发现，燕窝的酶解物具有人EGF样的优异的人表皮细胞增殖促进效果。令人预料不到的惊讶的是，来源于与人无关的穴燕的燕窝的酶解物显示人EGF样的细胞增殖促进效果。此外，酶解物中可见的效果与燕窝的水提取物的情况相比是显著的，这点也是令人惊讶的。本发明是基于这些认识而提出的。因此，本发明的目的是提供可以有效率地生产，并且安全性高的优异的人皮肤表皮细胞增殖促进剂，以及包含该人皮肤表皮细胞增殖促进剂的外用剂和化妆品。本发明的人皮肤表皮细胞增殖促进剂以燕窝的酶解物作为有效成分。根据本发明的一个优选方式，上述酶解物为利用蛋白酶得到的分解物。根据本发明的一个更优选方式，上述酶解物的分子量为70 200，000。根据本发明的一个进一步优选方式，上述酶解物的平均分子量为300 50，000。根据本发明的另一方式，提供一种皮肤外用组合物，其包含本发明的人表皮细胞增殖促进剂。该组合物优选用于皮肤护理，更优选用于调理肌肤的纹理，改善肌肤或皮肤的状态。根据本发明的另一更优选方式，本发明的皮肤外用组合物为化妆品。根据本发明的另一进一步优选方式，本发明的皮肤外用组合物为洗剂(lotion)、乳液、皮肤护理用膏(cream)、保湿液、唇膏(lip cream)、美容液面膜、或洗颜料。根据本发明的另一方式，提供燕窝的酶解物在制造人皮肤表皮细胞增殖促进剂中的应用。根据本发明的另一个方式，提供燕窝的酶解物在制造皮肤护理用的皮肤外用组合物中的应用。根据本发明的再另一方式，提供一种人皮肤表皮细胞的增殖促进方法，其包含将有效量的作为本发明的有效性成分的酶解物应用于人的皮肤。根据本发明的再另一个方式，提供一种皮肤护理方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于人的皮肤。同样地，提供一种调理肌肤的纹理、提高或改善肌肤的状态的方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于人的皮肤。根据本发明，通过使用燕窝的酶解物作为有效成分，与以往相比可以显著地促进人皮肤表皮细胞增殖。此外通过基于该人皮肤表皮细胞增殖促进能力，将酶解物用于皮肤外用用途或化妆品用途，可以维持皮肤中的更新周期或恢复周期的延迟，调理肌肤的纹理，维持或改善肌肤或皮肤的状态。这样根据本发明，可以实现消费者的QOL的提高。此外，由于所使用的酶解物使用也作为食用原材料众所周知的燕窝，因此安全性高，消费者也易于接受。此外由于可以将燕窝直接进行酶处理来获得酶解物，因此可以有效率地制造，并且制造成本也可以抑制地低。图I为显示燕窝样品中的唾液酸量的测定结果的图。图2为显示燕窝样品中的蛋白质的量的测定结果的图。图3为显示由GPC - HPLC得到的燕窝酶解物I的测定结果的图。 图4为显示由GPC - HPLC得到的燕窝酶解物2的测定结果的图。图5为显示实施例(3)的结果的图。图6为显示实施例(4)的结果的图。当变更。或者，本发明的皮肤外用组合物中的燕窝酶解物的含量(干物换算)优选以可以以每I日O. OOlmg以上、更优选为O. OOlmg Img应用于每I平方cm的皮肤的方式包含。只要本发明的皮肤外用组合物包含有效成分，并且不损害人皮肤表皮细胞增殖促进效果，则本发明的促进剂可以进一步包含其它任意成分。作为这样的任意成分，可举出例如，皮肤外用剂、化妆品中惯用的各种成 分，例如，保湿剂、低级醇、多元醇、糖类、表面活性齐U、缓冲剂、乳化剂、稳定剂、增稠剂、抗氧化剂、防腐防菌剂、螯合剂、PH调节剂、香料、色素、紫外线吸收剂、紫外线散射剂、维生素类、氨基酸类、抗炎剂、水、肽、糖醇类、酶类、植物提取物类、抗氧化物质类、滑石、粘土、花粉、珍珠等。这里作为保湿剂，可举出例如，聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、丙二醇、山梨糖醇、透明质酸、硫酸软骨素等酸性粘多糖类、氨基酸、胶原、胶原肽、弹性蛋白等。作为低级醇，可举出例如，乙醇、丙醇、异丙醇等。作为多元醇，可举出例如，甘油、季戊四醇、二季戊四醇、乙二醇、丙二醇、聚丙二醇、1，3 —丁二醇等。作为糖类，可举出例如，葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、乳糖、木糖、D 一葡糖醛酸、蔗糖、葡糖胺、半乳糖胺、D —山梨糖醇、失水山梨糖醇、纤维素、淀粉等糖类、寡糖类、多糖类和它们的衍生物等。关于本发明的皮肤外用组合物，通过将包含燕窝酶解物的人皮肤表皮细胞增殖促进剂和上述那样的任意成分根据公知的方法适当配合进行调整，可以制成洗剂、乳液、皮肤护理用膏(例如，雪花膏、营养膏、烧伤膏)、保湿液、面膜剂(例如，美容液面膜)、化妆水、洗颜料、爽身水(body lotion)、润体霜(body cream)等各种化妆品中惯用的制品形态。本发明的皮肤外用组合物还可以用作粉底(foundation)类、唇膏(lip cream)、口红(lipstick)、眼影(eye shadow)、腮红等彩妆化妆品、防晒用制品、防臭化妆品等药用化妆品、香波(shampoo)、护发素(hair rinse)、整发料等头发用化妆品、皮肤洗涤剂、浴用制剂的浴用化妆品等。根据本发明的再另一个方式，如上所述，提供人皮肤表皮细胞的增殖促进方法，其包含将有效量的作为本发明的有效成分的酶解物应用于人的皮肤。另外这里所谓“有效量”，是指根据应用，对于在体内的所期望区域中能够发挥人皮肤表皮细胞增殖促进活性而言充分的量。此外，根据本发明的再另一个方式，如上所述，提供皮肤护理方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于人的皮肤。同样地，还提供调理肌肤的纹理、提高或改善肌肤的状态的方法，其包含将有效量的本发明的有效成分应用于人的皮肤。另外这里所谓“有效量”，是指对于获得所期望的效果而言充分的量。另外在本说明书中，使用了“约”和“左右”的值的表达意味着，在达成设定该值的目的的基础上，包含本领域技术人员可以容许的值的变化。意味着例如，可以容许规定的值或范围的20%以内、优选为10%以内、更优选为5%以内的变化。实施例基于以下的例子具体地说明本发明，但本发明不限定于这些例子。
(I)燕窝样品的调制(1-1)燕窝酶解物I将市售的无漂白的燕窝用粉碎机进行粉碎，获得100目通过(粒径150μπι以下)的燕窝粉末，向该燕窝粉末中添加约50倍量(质量)的水，在5°C膨胀20小时，然后在121°C加热杀菌处理15分钟。将所得的处理液冷却，然后调整pH,添加相对于燕窝粉末为2质量％的量的含有蛋白酶的酶(商品名“ ^ ^ > 7 f > F”，天野制药株式会社制)，在45°C反应3小时。将该酶反应液调整至pH7. 0，然后在90°C加热5分钟，使酶失活，过滤，回收滤液(水溶性组分)。浓缩该滤液，然后冷冻干燥，获得“燕窝酶解物I ”。(1-2)燕窝酶解物2 除了使酶反应的时间为24小时以外，与上述(1-1)项的酶解物I同样地进行，获得“燕窝酶解物2”。(1-3)燕窝热水提取物(比较例I将市售的无漂白的燕窝(干燥物)40g用粉碎机进行粉碎，将该粉碎物添加至IOOOml的蒸馏水中，在加热回流下进行提取处理2小时。加热回流后，静置，然后分取上清液并过滤，回收滤液。对于残渣进一步与上述同样地添加至IOOOml的蒸馏水中，在加热回流下进行再提取处理，然后将固体物质残渣通过过滤而除去，回收滤液。合并所得到的滤液(提取液)，在减压下浓缩，冷冻干燥所得的浓缩物，获得黄白色的“燕窝热水提取物”(比较例)。(2)燕窝样品的分析如下测定所得的各燕窝样品(燕窝酶解物I、燕窝酶解物2和燕窝热水提取物)中的唾液酸量和蛋白质的量。关于唾液酸的量，在将各试样酸水解后，采用高效液相色谱作为游离N —乙酰神经氨酸进行测定。关于蛋白质的量,使用基于Brad ford法的Bio Rad社的蛋白质测定试剂盒进行测定。结果如图I和图2所示。接下来，为了测定燕窝酶解物I和燕窝酶解物2所包含的蛋白质的分子量及其分布，采用下述那样的条件利用GPC进行分析。[HPLC的测定条件]·柱Shodex Asahipak GS320HQ(Φ 7. 6 X 300mm)·柱温度35°C·流动相50mM CH3COONH3 pH6. 7·流速0. 4ml/ 分钟·试样进样量10 μ I·检测器紫外分光检测器(在UV220nm测定)[使用的分子量标准(marker)]· BSA MW 66，000· Gly-gly MW 132. I
· Gly-gly-gly MW 189.17· L-天冬氨酸 MW133. I· DL-天冬氨酸 MW 150. I· N-乙酰神经氨酸MW 309. 3测定结果如图3和图4所示。此外，关于燕窝酶解物所包含的蛋白质的分子量，使用蛋白质印迹法进行评价。具体而言，首先，按照上述的测定法，确认了燕窝酶解物中的蛋白质的量。将来源于燕窝酶解物的蛋白质(100 μ g)，使用SDS - PAGE，通过10 15%的聚丙烯酰胺进行分离。将凝胶中展开的蛋白质转印至免疫印迹PVDF膜(聚1，I-二氟乙烯，由Bio-Lad Lab社获得)。将PVDF膜在包含3%脱脂奶和O. l%Tween-20的PBS中封闭I小时，进行视觉判定。
另夕卜，在蛋白质的分子量的评价时，公知文献(Guo, C. T.，Suzuki Y.，etal. ,Antiviral Res. 70, pp. 140-146(2006)中显示的数据也作为参考。由这些结果可知，燕窝酶解物中所包含的蛋白质分子量在约70 120，000左右(另外根据评价条件，有时上限值为200，000左右)的范围存在。此外，由所得的结果可知，燕窝酶解物I中的蛋白质的平均分子量为约55，000。此外可知，燕窝酶解物2中的蛋白质的平均分子量为约33，000。(3)酶处理燕窝的细胞增殖促进活性使用EGF - R表达皮肤构成细胞来研究酶处理燕窝的EGF样作用，即，细胞增殖促进活性。(i)材料细胞使用由ATCC购入的来源于人表皮(皮肤)的EGF — R表达细胞A431细胞。作为燕窝酶解物，使用按照上述(I)获得的燕窝酶解物I (酶处理3小时)、燕窝酶解物2 (酶处理24小时)以及燕窝热水提取物。(ii)实验方法利用添加了 3%FCS的DME培养基，在调整至5X IO4个细胞/ml的A431细胞中，以下述各种浓度添加燕窝酶解物或燕窝热水提取物，利用96孔平底板以5X IO3个细胞/lml/孔进行培养。最终添加浓度·燕窝热水提取物(heart) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窝酶解物 I (Enzl) :1%、0· 1%、0· 01%·燕窝酶解物 2 (Εηζ2) :1%、0· 1%、0· 01%此外，作为对照，准备既未添加燕窝酶解物也未添加r - EGF的非添加组，进行培养。经时地使用Cell Counting Kit 一 8(同仁化学研究所社制)(氣胸腺卩密唳核苷(tritium thymidine)的摄取试验的代替法)研究细胞的增殖，调查EGF样作用的有无。结果是，作为在460nm附近具有极大吸收的水溶性甲臜的色素量，以ABS (吸光度，absorbance)显不。结果如图5所示。由结果可知，明确划分成与非添加对照组(A431/3%FCS)相比细胞的增殖被抑制的组和被增殖的组。燕窝酶解物I和燕窝酶解物2的添加组(特别是O. 1%和O. 01%的浓度)中都确认了明确的增殖促进效果。另一方面，对于燕窝热水提取物的1%添加组，即使与非添加对照组相比，细胞增殖也被极端地抑制。即使在燕窝热水提取物的O. 1%添加组和O. 01添加组中，细胞增殖与非添加对照组相比也低。因此，燕窝酶解物促进细胞增殖，另一方面，关于燕窝热水提取物，反而确认了抑制或阻害细胞增殖的倾向。(4)燕窝酶解物的EGF样作用的验证^GF — R磷酸化的研讨)将EGF - R表达皮肤构成细胞的EGF受体磷酸化作为指标研讨燕窝酶解物的EGF样作用。 ⑴材料细胞使用由ATCC购入的来源于人表皮(皮肤)的EGF — R表达细胞A431细胞。作为燕窝酶解物，使用按照上述(I)获得的燕窝酶解物I (酶处理3小时)和燕窝酶解物2 (酶处理24小时)。作为阳性对照，使用人重组型EGF(r 一 EGF)(由Protein Express获得)。EGF — R的磷酸化使用Active EGF receptor EIA试剂盒(Takara社)进行测定。(ii)细胞培养利用添加了 3%FCS的DME培养基，分别在调整至5X IO4个细胞/ml的A431细胞中，以下述各种浓度添加燕窝酶解物和作为阳性对照的r 一 EGF，利用24孔平底板以5X IO4个细胞/lml/孔进行培养。最终添加浓度·燕窝酶解物 I (Enzl) 0. 1%、0· 01%·燕窝酶解物 2 (Εηζ2) :0· 1%、0· 01%· r — EGF 0. 15ng/ml此外，作为对照，准备既未添加燕窝酶解物也未添加r - EGF的非添加组，进行培养。(iv)检体的调整和测定在从培养10小时至50小时(数据为10 34小时)期间，经时地回收细胞，使用附属于测定试剂盒的受体提取用缓冲液，调整检体。除去培养上清液，然后以50 μ I/孔添加受体提取用缓冲液，使用细胞刮刀(Cell Scraper)刮取细胞，将2孔份的细胞提取液集中在I. 5ml用的微量离心管中。在4°C、IOOOOrpm的条件下离心5分钟，使细胞不溶物沉淀，将提取上清液在一 80°C冷冻保存直至测定。将冷冻保存的提取上清液溶解，使用检体稀释液分别稀释至10倍，按照ActiveEGF receptor EIA试剂盒的测定法进行测定。结果利用由磷酸化EGF受体标准液得到的标准曲线算出，以EGF受体中的磷酸化酪氨酸数(fmol/L)表示。结果如图6所示。在直至培养34小时的研讨中，与非添加对照组(Cont)相比，EGF — R的磷酸化都增强了。燕窝酶解物2的O. 1%和O. 01%添加浓度组(分别为Enz20. 1%，Enz20. 01%)的EGF - R的磷酸化数与作为阳性对照的r - EGF的O. 15ng/ml添加组(r 一 EGFO. 15ng)相比，都显示高的值。在燕窝酶解物I的O. 1%添加组(EnzlO. 1%)中，非常早地(10小时)确认了 EGF - R的磷酸化的增强。 由结果暗示了，燕窝酶解物I和燕窝酶解物2都以O. 1%和O. 01%的添加浓度促进EGF - R的磷酸化，对于表皮细胞(A431细胞)的增殖带来影响。


本发明的人皮肤表皮细胞增殖促进剂以燕窝的酶解物作为有效成分。根据本发明，提供可以有效率地生产，并且安全性高的优异的人皮肤表皮细胞增殖促进剂，以及包含该人皮肤表皮细胞增殖促进剂的外用剂和化妆品。