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专利名称
用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法
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发明者
李贞淑, 郑孝先, 李正姬, 闰天在, 孙泰植, 金庆植
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公开日
2013年4月10日
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申请日期
2011年5月11日
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优先权日
2010年5月11日
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申请人
医疗集团蓓世体安
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文档编号
A61P17/02GK103037871SQ201180022884
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关键字
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权利要求
1.一种用于缓解或治疗皮肤缺损的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，包括从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤；将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤；以及从上述粉碎而成的组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞的皮肤细胞群的步骤2.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤中，使用组织粉碎器，将上述正常皮肤组织大小的每 Icm2粉碎10 60秒的时间，从而将上述正常皮肤组织粉碎成细胞单位3.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤中，粉碎上述正常皮肤组织使得上述粉碎的细胞浓度为 I 40X IO7 个/cm24.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的角质形成细胞为总获取细胞的60 90%5.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的黑色素细胞为总获取细胞的I 5%6.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的纤维细胞为总获取细胞的10 40%7.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，无需对上述获取的包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群进行培养8.一种细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，用于获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群时，无需进行酶处理9.根据权利要求1所述的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，上述皮肤缺损为从由烧伤、创伤、皮肤疤痕、色素脱失的皮肤伤口构成的群中选择的某一种10.一种细胞治疗剂，其特征在于，通过如权利要求1至9中任一项所述的方法制备而成
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技术领域
本发明涉及一种用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法，更具体地涉及一种不同于现有细胞治疗剂制备方法的因能够排除酶或培养步骤而在短时间内制备细胞治疗剂的方法
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背景技术
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具体实施例方式
以下，将参照附图对本发明的实施例进行详细说明，使得本发明所属技术领域的普通技术人员能够容易实施本发明可以实现各种不同的实施方式，不限于在此说明的实施例图1为本发明的细胞治疗剂的制备方法的流程图如图1所示，本发明的细胞治疗剂的制备方法包括从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤(步骤Sll);将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤(步骤S12);以及从上述粉碎而成的组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中的至少一种细胞的皮肤细胞群的步骤(步骤S13)本发明的细胞治疗剂的制备方法用于制备为了缓解或治疗哺乳动物的皮肤缺损的细胞治疗剂优选地，用于制备用于缓解或治疗人类皮肤缺损的细胞治疗剂在上述正常皮肤组织的获取步骤中，可利用取皮机(Dermatome)从主体获取正常皮肤组织上述主体可包含哺乳动物或人类优选地，从某部分皮肤具有皮肤缺损的人体中获取正常皮肤组织上述正常皮肤组织可按照(I至5mm) X (I至5mm)的大小切割来获取，具有上述大小的组织的个数可通过考虑患部的大小而获取，作为一例，可获取具有上述大小的碎片I至30个，更优选地获取5至25个碎片，进 而优选地获取10至25个碎片上述获取的正常皮肤组织可利用生理盐水或灭菌水清洗后加以利用并且，可利用通常的方法，对上述清洗的组织进行灭菌后加以利用上述正常皮肤组织的粉碎步骤是将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤在上述将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤中，通常利用可粉碎组织的一般组织粉碎器在上述组织粉碎时考虑到上述需要粉碎的组织的量，可少量添加生理盐水或灭菌水进行粉碎，优选地可添加I IOcc的生理盐水或灭菌水进行粉碎，更优选地可添加I 5cc的生理盐水或灭菌水进行粉碎利用上述组织粉碎器粉碎组织时，粉碎时间可考虑上述组织的量而进行设定，优选地，上述组织大小的每Icm2可粉碎I至60秒的时间，更优选地，每Icm2可粉碎10至60秒的速度，以将上述组织粉碎成细胞单位粉碎上述组织使得上述粉碎的细胞浓度为(I至40) X IO7个/cm2上述细胞的浓度可根据上述主体的年龄或组织的状态而不同上述皮肤细胞群的获取步骤表示，完成上述粉碎后，从组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞的皮肤细胞群上述角质形成细胞(keratinocyte)为，生产角质并通过形成物理屏障，以起到从外部进入的有害因子中保护个体的作用的表皮细胞，是一种生成并分泌可调节免疫反应的各种生物反应调节物质来调节免疫反应和炎症反应的重要结构要素上述黑色素细胞(melanocyte)是生成作为存在于动物组织及皮肤中的褐色或黑色色素的黑色素的细胞，持续地将在细胞内生成的黑色素颗粒供应至表皮细胞黑色素量多时，皮肤颜色呈黄褐色甚至黑褐色；量越少，颜色就越浅上述纤维细胞(fibroblast)还称为成纤维细胞，它是构成纤维性结缔组织的重要成分的细胞，通过组织切片进行观察时呈扁平而长条的外形，这些细胞通常具有不规则的突起因此，上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤为，从粉碎上述组织而成的组织碎片中获取包括角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞在内的皮肤细胞群 此时，上述获取的包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群不仅包含存活的细胞，同时还可能包含在粉碎步骤中遭到破坏的细胞在这里，上述获取的角质形成细胞可占总获取细胞的60 90%，上述获取的黑色素细胞可占总获取细胞的I 5 %，上述获取的纤维细胞可占总获取细胞的10 40%因此，如上所述，本申请提供一种不经任何酶处理，也可以从正常皮肤组织中分离出角质形成细胞、黑色素细胞或纤维细胞的方法并且，提供一种无需对上述获取的包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群进行培养，即可用于患部的细胞治疗剂由此，通过本申请的制备方法制备的细胞治疗剂，不仅排除了依据酶处理的细胞分离过程，还排除了培养所分离的细胞的过程，可在非常短的时间内进行制备，完成制备后可立即用于患部，因此非常有效在这里，上述皮肤缺损可以是从由烧伤、创伤、皮肤疤痕、色素脱失的皮肤伤口构成的群中选择的某一种以下，将通过实施例和实验例对本发明进行更详细的说明实验例1.根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂中包含的细胞试验及患部适用例针对47岁女性及36岁女性，利用取皮机，以4X5mm的大小分别切取20个正常皮肤组织，使用生理盐水清洗后进行灭菌往上述灭菌后的组织添加2cc的灭菌水，并使用组织粉碎器粉碎约30秒钟完成上述粉碎后，利用细胞过滤网(cell strainer),从组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群，从而制备出利用47岁女性的自体皮肤细胞的细胞治疗剂和利用36岁女性的自体皮肤细胞的细胞治疗剂1-1.细胞的浓度测定利用血球计数器(Hemocytometer),分别测定上述制备的利用47岁女性的自体皮肤细胞的细胞治疗剂和利用36岁女性的自体皮肤细胞的细胞治疗剂的细胞浓度图3表示血球计数器的一实施例如图2所示，血球计数器是在其表面划着横竖斜线的载物玻璃，具有由规则四边形分划的两个室(Chamber)，可在显微镜下测定在各个室的由规定体积构成的四边形区划内存在的细胞的数量，来测定在所有试料内存在的细胞浓度在完成上述制备的100 U I的细胞治疗剂中添加100 U I的台盼蓝，并均匀混合后，慢慢注入至用盖玻片覆盖的血球计数器中经过约I分钟后，在显微镜下测定已染色的细胞(死亡细胞)和未染色的细胞(存活细胞)的数量
专利名称：用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法在皮肤组织出现烧伤、创伤、色素脱失等缺损的情况下，如未进行适当治疗或者采取错误的应急措施，将会给皮肤留下疤痕或导致治疗时间延长，同时还可能伴随其他皮肤疾病。通常，在烧伤或创伤的情况下，以往采用以浸湿有主要成分为凡士林的软膏的绷带包裹皮肤的方式进行治疗，为了防止二次感染，额外服用青霉素、磺酰胺剂等抗生剂。并且，为了减轻痛症，另行服用镇痛剂。但是，伤口治疗所需时间短则2 3周，长则需要3个月左右的长时间的治疗，由此需要的费用也非常高昂。并且，在烧伤的情况下，多采用一种利用自体细胞制成的细胞治疗剂来进行治疗的方法。但根据以往的利用自体细胞制成的细胞治疗剂的制备方法，采用进行酶处理来提取特定细胞，将上述提取的细胞培养数日而生产的方法。因此，以往的细胞治疗剂存在细胞培养所需时间长的问题，不适用于烧伤等皮肤缺损程度严重的情况和需要紧急治疗的患者。`
技术问题因此，本发明的目的在于提供一种利用不通过酶处理进行分离且不进行培养的自体皮肤细胞来制备用于缓解或治疗皮肤缺损的细胞治疗剂的方法和根据上述方法制备的细胞治疗剂以及制备细胞治疗剂的装置。技术方案上述目的可通过如下的本发明的用于缓解或治疗皮肤缺损的细胞治疗剂的制备方法达成，该方法的特征在于，包括从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤；将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤；以及从上述粉碎而成的组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群的步骤。其中，在上述将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤中，可以使用组织粉碎器，将上述正常皮肤组织大小的每Icm2粉碎10 60秒的时间，从而将上述正常皮肤组织粉碎成细胞单位。其中，在上述将上述获取的正常皮肤组织粉碎成细胞单位的步骤中，可以粉碎上述正常皮肤组织使得上述粉碎的细胞浓度为I 40X IO7个/cm2。其中，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的角质形成细胞可以是总获取细胞的60 90%。其中，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的黑色素细胞可以是总获取细胞的I 5%。其中，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，上述获取的纤维细胞可以为总获取细胞的10 40%。其中，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，无需对上述获取的包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞在内的皮肤细胞群进行培养。其中，在上述从源于自体皮肤组织的一个供体部位中获取正常皮肤组织的步骤中，用于获取包含上述角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群时，无需进行任何酶处理。其中，上述皮肤缺损可以是从由烧伤、创伤、皮肤疤痕、色素脱失的皮肤伤口构成的群中选择的某一种。并且，本发明的目的可通过本发明的细胞治疗剂达成，该细胞治疗剂通过上述记载的细胞治疗剂的制备方法制备而成。有益效果如上所述，本发明的利用自体皮肤细胞的用于缓解或治疗皮肤缺损的细胞治疗剂的制备方法，针对自体皮 肤细胞，无需采用以酶处理来进行细胞分离的方式，并且不对分离出的细胞进行培养，也能够制备细胞治疗剂并方便、快速地用于患部的效果。并且，根据本发明，即使从主体获取的正常皮肤组织的量少，也可制备用于较大面积患部的细胞治疗剂。并且，还具有提供可制备上述细胞治疗剂的制备装置的效果。图1为表示本发明的一实施例的细胞治疗剂的制备方法的流程图。图2为表示血球计数器的示例的图。图3a至3b为表示根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂的细胞大小确认结果的图。图4为表示根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂对烧伤部位的临床效果的图。图5为表示根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂对烧伤部位的再一临床效果的图。图6a为表示根据以往的酶处理方式分离出的细胞的电子显微镜确认结果的图。图6b为表示根据本发明的一实施例分离出的细胞的电子显微镜确认结果的图。图7为表示根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂对烧伤部位的动物实验效果的图。图8a为表示上述图7的烧伤部位的H&E染色结果的图。图8b为表示上述图7的烧伤部位的MT染色结果的图。图9为表示根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂对创伤部位的动物实验效果的图。图1Oa为表示对图9的创伤部位适用对照组后的MT染色结果的图。图1Ob为表示对图9的创伤部位适用根据本发明的一实施例制备的细胞治疗剂后的MT染色结果的图。
通过以下公式I测定细胞的浓度。公式I
本发明涉及一种用于缓解或治疗皮肤缺损的自体皮肤细胞治疗剂的制备方法。本发明的利用自体皮肤细胞的用于缓解或治疗皮肤缺损的细胞治疗剂的制备方法，其特征在于，包括从主体获取正常皮肤组织的步骤；将上述获取的组织粉碎成细胞单位的步骤；从上述粉碎而成的组织碎片中获取包含角质形成细胞、黑色素细胞及纤维细胞中至少一种细胞在内的皮肤细胞群的步骤。由此，相比现有细胞治疗剂的制备方法，排除了酶处理和/或培养步骤，相当简便，并且能够在短时间内完成制备，并立即用于患部。
