专利名称：杂环化合物及造血干细胞的扩增剂的制作方法血液中存在作为承担身体机能的血细胞的下述各细胞系列与氧运输相关的红细胞系，产生血小板的巨核细胞系，与感染防御相关的粒细胞、单核细胞和/或巨噬细胞等骨髓白细胞系，负责免疫的τ细胞和B细胞等淋巴细胞系。这些血细胞都通过由共同的起源、 即造血干细胞分化并成熟，从而在个体的一生中始终维持、产生。在这里，造血干细胞定义为兼具可分化为淋巴细胞、红细胞、血小板等功能细胞的多能性和在维持这样的多能性的状态下自我增殖的能力(自我复制能力)的细胞。根据至今为止的研究，已知造血干细胞首先定向为骨髓白细胞系和淋巴细胞系这2个系列，分别分化为骨髓系祖细胞(混合集落形成细胞，CFU-GEMM)和淋巴细胞系祖细胞，进而骨髓系祖细胞经过成红细胞爆式集落形成细胞(BFU-E)、红细胞集落形成细胞 (CFU-E)而形成红细胞，经巨核细胞集落形成细胞(CFU-MEG)而形成血小板，经粒细胞-巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)而形成单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞，经嗜酸性粒细胞集落形成细胞(CFU-EO)而形成嗜酸性粒细胞；而淋巴细胞系祖细胞经前T细胞而形成T细胞，经前B细胞而形成B细胞。还有，这些细胞中，形成直径Imm以上的高分化能力集落的细胞被称为HPP-CFU集落形成细胞，已知与混合集落形成细胞(CFU-GEMM)同为分化程度最低的造血祖细胞。这些骨髓系祖细胞及由其衍生的各种造血祖细胞可以根据在各种细胞因子的存在下于软琼脂或甲基纤维素等的半固体培养基中形成的各种集落的性状来确定(参照非专利文献1)。近年来，作为源自造血或免疫的功能障碍的各种血液疾病、癌症、免疫缺陷症、自身免疫疾病、先天性代谢异常症等多种治疗困难的疾病的根治性治疗方法，采用自体或同种的造血干细胞移植。此外，最近报道了包括造血干细胞移植在内的CD34阳性细胞移植作为脑梗塞或心肌梗塞及闭塞性动脉硬化症等的治疗方法的有效性(参照非专利文献2、3、 4、5)。另外，还尝试采用造血干细胞移植来进行神经和肌肉的再生。作为其例子，可例举将来源于脐带血的⑶34阳性细胞移植入小鼠脑梗塞模型来借由血管新生使神经再生的报道 (非专利文献幻和可通过⑶34阳性细胞实现肌肉损伤的修复的报道(非专利文献5、专利文献1)。其中，骨髓移植的治疗实际案例多，被最多地确立为标准的造血干细胞移植治疗法。但是，为了骨髓移植，提供骨髓的供者和接受移植的受者的人白细胞抗原(HLA)的一致率必须高，来自供者的骨髓的供给不足成为问题。此外，供者必须入院4天左右，还有伴随大量采集骨髓的疼痛、发热和出血，对供者的负担大。作为替代骨髓的造血干细胞源，现在也使用外周血。如果对人给予粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，则造血干细胞被从骨髓动员至外周血，因此将该动员的造血干细胞用血液成分分离装置浓缩后，用于移植。但是，外周血干细胞移植必须连续4 6天对供者给予 G-CSF，还可能会伴随给药而产生的副作用(血液凝固、脾脏肥大)，对供者的负担大。另外， 虽然造血干细胞通过给予G-CSF而被从骨髓动员至外周血，但其效率因供者而异，也有时无法获得足够的造血干细胞。另外，最近明确了脐带血含有与骨髓同等程度的造血干细胞，对造血干细胞移植是有效的(参照非专利文献6)。脐带血即使HLA型不完全一致也可移植，重度的急性移植物抗宿主病(GVHD)的发病率比骨髓和外周血低，其使用价值得到确认，因此使用频率不断增加。但是，平均从一名提供者所采集的脐带血的量少，脐带血所含的造血干细胞数也少， 因此其应用主要局限于儿童。此外，在对于目前没有有效的治疗法的致死性遗传疾病或HIV感染症、慢性肉芽肿病、生殖细胞肿瘤的基因治疗中，造血干细胞也被认为是有效的细胞。但是，为了使插入有目标基因的逆转录病毒载体高效地转染到造血干细胞中，通常要求使处于静止期的造血干细胞进入细胞周期，人为地促进自我增殖。另外，对于经转导的造血干细胞，为了使其后的移植成功并长期维持基因的表达，需要在体外的培养体系中维持未分化的状态。因此，为了更高效地导入基因而使其后的移植成功，期待导入基因时的细胞培养方法的改善(例如参照非专利文献7)。另一方面，造血祖细胞被认为在移植骨髓或脐带血后的初期血细胞恢复中非常重要，是在防止移植后的初期感染症方面特别有效的细胞。因此，移植时的造血祖细胞的数量少的情况下，初期的血细胞恢复变慢，也可能会导致移植后的存活率下降(例如参照非专利文献8)。为了解决以上的使用造血干细胞和/或造血祖细胞的移植和基因治疗的课题，需要在体外(ex vivo)扩增造血干细胞和/或造血祖细胞的技术，至今为止已尝试了各种培养方法。在这里，对培养的造血干细胞以及造血祖细胞进行说明。对于人类，造血干细胞及由其衍生的各种造血祖细胞已知包含于表达细胞表面抗原CD34分子的CD34阳性细胞群， 因此造血干细胞可作为CD34阳性细胞群浓缩(参照非专利文献9)。作为具体的浓缩方法， 通常采用使以磁珠标记的CD34抗体与要分离的细胞群混合、再通过磁石回收CD34阳性细胞的方法(参照非专利文献10、11)。此外，CD34阳性细胞群中以不到10%的比例存在未表达细胞表面抗原⑶38分子的⑶34阳性⑶38阴性细胞群。这些⑶34阳性⑶38阴性细胞群可认为是与CD34阳性细胞相比造血干细胞被进一步浓缩而得的细胞群(例如参照非专利文献12、1；3)。此外，为了判断细胞群中的未分化的造血祖细胞的比例，一般采用测定所述的HPP-CFU集落形成细胞的方法(例如参照非专利文献14)。近年来，作为通过实验检验人造血干细胞的方法，可以使用使糖尿病小鼠和免疫缺陷小鼠交配而获得的N0D/SCID 小鼠来考察具有骨髓重建能力的人造血干细胞的存在。通过该方法测定的细胞被称为SCID 再植细胞(SCID-r印opulating cells, SRC)，被认为是最接近人造血干细胞的细胞(例如参照非专利文献15)。下面，对造血干细胞和/或造血祖细胞的增殖方法的现有技术进行说明。如上所述，造血干细胞和造血祖细胞大多包含于⑶34阳性细胞，因此扩增时的起始细胞主要采用 ⑶34阳性细胞。作为由⑶34阳性细胞扩增造血干细胞和造血祖细胞的例子，报道了在干细胞因子(SCF)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素6 (IL-6)、白细胞介素6 (IL-6) /可溶性白细胞介素6受体(soluble IL-6 receptor)复合物、白细胞介素11 (IL-11)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、flk2/flt3配体(FL)、血小板生成素(TPO)、Notch配体(Deltal等)等细胞因子或生长因子的存在下进行培养的方法(参照专利文献2、3和非专利文献8、14、16、17)。其中，TPO的造血干细胞的扩增效果特别好， 几乎所有的扩增例中都采用(参照非专利文献18)。通过与所述各种细胞因子和生长因子一起培养，造血干细胞和造血祖细胞可扩增，但造血干细胞的扩增幅度为数倍左右。另外， 所述各种细胞因子和生长因子全都是通过基因重组技术制成的蛋白质，因此有时扩增时稳定、大量、低价且迅速地获得它们成为课题。此外，作为使造血干细胞在体外扩增的方法，报道了在各种细胞因子的存在下将其他种类的细胞用作支持细胞的共培养体系的方法。例如，进行了通过与来源于人骨髓的基质细胞的共培养扩增造血干细胞的尝试(参照非专利文献19)。此外，还有以来源于小鼠骨髓的HESS-5细胞为支持细胞在TPO、FL、SCF的共存下尝试⑶34阳性细胞的扩增的报道 (参照非专利文献20)。但是，这些方法采用使外来的细胞共存的培养体系，所以存在将感染了无法确认存在的未知的病原体的细胞移植给患者的危险。此外，基质细胞采用来源于异种动物的细胞时，存在移植后在受者体内发生免疫反应的危险，因此必须将基质细胞与 ⑶34阳性细胞完全分离。另外，不仅是各种细胞因子，还报道了将低分子化合物与TPO等细胞因子一起添加于培养体系来使造血干细胞在体外扩增的方法。作为该低分子化合物的例子，可以例举铜螯合剂、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂与DNA甲基化抑制剂的并用、全反式视黄酸、醛脱氢酶抑制剂等(参照非专利文献21、22、23和专利文献4)。但是，不论是通过添加哪种化合物， 造血干细胞的扩增幅度都为数倍左右，或者培养时间需要3周左右，不能说十分有效。另一方面，已知用于使实施造血干细胞移植后的造血和免疫恢复加速的处置对排除感染的危险性、缩短入院时间非常有效。作为这样的处置，临床上采用在移植后给予作为造血类细胞因子的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等方法(非专利文献M)。但是，其效果仅限于白细胞，希望能有扩增造血干细胞和/或造血祖细胞而改善所有的血细胞系细胞的恢复的有效的处置方法。此外，伴有造血干细胞/造血祖细胞的减少的疾病和功能障碍需要有效的治疗手段，不应局限于造血干细胞移植。专利文献1 日本专利特开2009-40692专利文献2 日本专利特开2001-161；350专利文献3 日本专利特开2000-23674专利文献4 日本专利特表2002-502617非专利文献1 :Lu, L.等；Exp. 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