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专利名称
基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂制作方法
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发明者
刘莉, 宋晓玲, 张庆利, 李美霞, 王秀华, 黄倢
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公开日
2012年10月3日
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申请日期
2012年6月12日
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优先权日
2012年6月12日
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申请人
中国水产科学研究院黄海水产研究所
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文档编号
C12N15/10GK102703433SQ20121019252
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关键字
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权利要求
1.一种核酸等温扩增反应试剂的保存方法，其特征在于，是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存2.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶3.如权利要求2所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种4.如权利要求2或3所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶为 DNA聚合酶和/或RNA聚合酶5.如权利要求3所述的保存方法，其特征在于所述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液6.如权利要求I所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 005°/Γ60%7.如权利要求I或6所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料8.如权利要求7所述的保存方法，其特征在于所述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料9.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种10.如权利要求8或9所述的保存方法，其特征在于所述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种11.如权利要求8所述的保存方法，其特征在于所述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种12.如权利要求10所述的保存方法，其特征在于所述的硅藻土在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 01°/Γ10%13.如权利要求10所述的保存方法，其特征在于所述的介孔二氧化硅在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为O. 01°/Γ20%14.如权利要求11所述的保存方法，其特征在于所述的多孔磷酸盐微晶玻璃在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1%飞0%15.一种可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料后制备的16.如权利要求15所述的反应试剂，其特征在于所述的核酸等温扩增反应液为核酸等温扩增的聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种17.一种核酸等温扩增反应试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含有权利要求15所述的核酸等温扩增反应试剂
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技术领域
本发明属于分子生物试剂保存技术领域，具体涉及一种生化试剂组合物的保存方法，确切地说是分子生物学中核酸等温扩增反应试剂及其混合物的常温保存方法，以及采用该方法制作的可以常温保存和运输的反应试剂
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背景技术
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具体实施例方式
在目前的分子实验、检测操作中，若是直接将核酸等温扩增反应试剂(即核酸等温扩增反应液的组分)如引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)或三磷酸核苷酸(NTP)、聚合酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶和内切酶等)、聚合酶的反应缓冲液(不同类型的等温扩增反应需要不同的聚合酶和反应试剂)等的混合物保存在常温或者室温条件下，通常情况下广2天后这些反应试剂混合物就失去了对目的核酸的扩增能力研究发现，在常温或室温的条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中最容易失去反应活性的是聚合酶，而这些聚合酶丧失活性的主要原因是由于长时间保存、温度过高或温度变化导致酶活性中心维持高级结构的氢键、离子键、二硫键等分子作用力受到破坏所致；同时在常温或室温条件下，等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)中的寡聚核苷酸引物、dNTP也会很快降解，无法参与基因扩增核酸等温扩增反应试剂中体积较大的有机活性成分如聚合酶(DNA聚合酶和/或RNA聚合酶)、模板核酸、引物等分子质量在I 100千道尔顿(kDa)之间，直径大约介于I 100纳米(nm)申请人在研究中发现，将多孔材料添加到核酸等温扩增反应液的组分中，聚合酶、核酸模板、引物等分子会组装或固定在多孔材料的孔道中或多孔材料颗粒的间隙里，一方面聚合酶分子就会被多孔材料的孔道或间隙所固定，酶分子的空间结构(三维结构或高级结构)得以长期维持，聚合酶的活性即可长期保持；另一方面核酸模板、引物等分子也会组装或固定在酶分子附近，能使酶更易与底物接触反应，这样即使在长期保存后仍能表现出较高的反应效率在较便利的贮存条件下(如常温或室温)和一定的贮存期内，上述添加多孔材料后的等温扩增反应液(即等温扩增反应试剂混合物)进行等温扩增反应所得的结果与用新鲜配制的反应混合物所得到的结果完全相同因不同类型的等温扩增所需的聚合酶不同，所以不同类型的等温扩增反应试剂混合物需要添加不同种类、不同孔径的多孔材料实现常温长期保存实际使用中，可以选用的多孔材料可以是孔道排布规则有序、孔径均一的孔径小于2nm的微孔材料(但不小于lnm)、孔径在2 50nm介孔材料、孔径大于50nm的大孔材料(也称为宏孔材料)，也可以是孔径不规则的无序多孔材料如无定型的微晶玻璃、氧化硅多孔材料和氧化铝多孔材料等以下通过实施例对本发明作进一步说明实施例I 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)反应试剂混合物添加多孔材料后的保存效果分析I. LAMP反应试剂混合物添加不同质量体积百分比和不同种类多孔材料进行保存将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物16. 128mL(包括LAMP引物FIP 和 BIP 各 I. 6iiM，引物 F3 和 B3 各 0. 2iiM，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM,MgCl26mM,甜菜碱 1M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS042mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-1000. 1%, BstDNA聚合酶5376U)按每管288 u L分装于56个I. 5mL的离心管中，按表I第1、2、3列(共56种，包括不添加多孔材料的空白对照)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入多孔材料并混匀(对于添加量较低的多孔材料，可预先配制成200倍最终添加量的高浓度预混液，然后摇匀悬浮后用移液枪吸取)，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24 y L的量分装于12个0. 2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0. 2mL的离心管分别置于200C (常温)与37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个装有混合物的0. 2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0. 2mL的离心管作为重复)2. LAMP反应试剂混合物添加两种及两种以上多孔材料进行保存将除被测样品核酸以外的各种LAMP反应试剂的混合物3168 U L (包括LAMP引物FIP 和 BIP 各 I. 6 ii M，引物 F3 和 B3 各 0. 2 ii M，dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 各 I. 4mM，甜菜碱1M, Tris-HCl 20mM, KCl IOmM, MgS048mM, (NH4)2SO4IOmM, Triton X-1000. 1%, Bst DNA 聚合酶1056U)按每管288 ii L分装于11个I. 5mL的离心管中，按表2第1、2、3列(共11种，包 括不添加多孔材料的空白对照)所示的浓度和种类向每个I. 5mL的离心管中加入多孔材料并混匀，再将每个I. 5mL离心管中的混合物按24ii L的量分装于12个0. 2mL的离心管中，然后将每组12个装有混合物的0. 2mL的离心管分别置于20°C和37°C条件下保存(每个温度条件下保存6个装有混合物的0. 2mL的离心管，分3个保存时间段进行抽检，每个时间段每次抽检2个装有混合物的0. 2mL的离心管作为重复)3. LAMP反应试剂混合物的保存和有效性检验保存于20°C的装有反应试剂混合物的0. 2mL的离心管分别在贮存期满I个月、2个月和3个月时进行抽样检验，保存于37°C的装有反应试剂混合物的0. 2mL的离心管分别在贮存期满10天、20天和30天时进行抽样检验检验方法如下I)依据上述6个贮存时间段，共需进行6批次、每批次130个的LAMP反应试剂混合物的有效性检测，每次检测的时候需将变性后的对虾白班综合征病毒(White spotsyndrome virus, WSSV)的核酸(30ng/ u L) 130 u L等量分装于130个装有混合有多孔材料的LAMP反应试剂混合物的0. 2mL的离心管中同时,按照本实施例步骤I中的试剂比例配制新鲜的LAMP反应液24ii L，添加变性后的WSSV核酸(30ng/ii L) I u L，作为阳性对照2)将上述离心管于63° C保温60min进行LAMP反应LAMP反应终止后，在每个离心管中加入2 ii L 10倍稀释的核酸染料GeneFinder ，然后于90° C保温5min使反应产物染色并终止反应如果离心管中反应液呈现绿色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物具有正常的反应活性；如果离心管中反应液呈现橙黄色，则说明该离心管中的LAMP反应试剂的混合物已失去正常的反应活性检测结果显示，实验设置的阳性对照均显绿色，表明该LAMP反应体系工作正常；实验设置的空白对照组(LAMP反应试剂的混合物中不添加任何多孔材料直接在20°C和37° C条件下保存)均显色橙黄色，表明LAMP反应试剂的混合物不添加任何多孔材料而直接放置在20°C和37° C条件下，经过上述时间的保存后，已丧失反应能力；对上述添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的检测结果见表I和表2对上述部分阳性对照、空白对照和添加多孔材料的反应体系扩增后的产物进行电泳检测，结果显示扩增后染色反应液显示绿色样本的其电泳泳道均出现LAMP产物的典型LADDER带型，扩增后染色反应液显示橙黄色的样本其电泳泳道均未出现LAMP产物的典型LADDER带型添加不同浓度、不同种类多孔材料的LAMP反应试剂混合物的保存效果的后检测结果(见表I和2)表明保存时间为I个月、2个月时，在20°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性；保存时间为10天、20天时，在37°C条件下贮存的混合物绝大部分都具有正常的反应活性表I.不同质量体积百分比、不同种类多孔材料对LAMP反应试剂混合物的保护效果
专利名称：基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂的制作方法在过去的20年里，以多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)为代表的核酸扩增技术得到了迅猛的发展和应用。最近几年，产生了一系列新型的核酸等温扩增技术，这些技术或基于DNA/RNA生物合成机制研究的新发现，或者利用具有特殊功能的核酸酶来实现恒温条件下对目标核酸的扩增；无论在实际操作还是在仪器要求方面，这些等温扩增技术都比PCR技术更简单和廉价，从而更容易被开发和利用，尤其是在核酸检测及诊 断领域，等温扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。利用等温扩增技术开发的各类检测及诊断产品在特异性、易用性、成本和方便性等方面具有PCR技术产品无可比拟的优势，市场前景极为广阔。虽然等温扩增技术本身优势明显，但基于等温扩增技术的产品在大规模应用过程中却面临一些问题的困扰，其中最为突出的是产品需要低温冷冻保存和运输。作为核酸扩增技术的一种，等温扩增也需要由具有生物活性的酶的参与，而酶生物活性的长期保持需要低温冷冻条件，同时等温扩增反应所需的寡聚核苷酸引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和反应缓冲液等均需在冷冻条件下贮存，并且反复冻融会使这些成份失效，所以基于等温扩增技术的产品要求在低温冷冻条件进行运输和保存，这一方面增加了运输成本，另一方面也限制了这些产品在不具备低温保存条件的环境或地区的应用。对于大规模生产、商品化的基于等温扩增技术的产品，为了保证产品的一致性、稳定性和可靠性，也要求尽可能把各种反应试剂一次性添加和分装，并使产品在贮存和运输过程中具备尽可能长的保质期限。因此，发明一种能够方便有效保存等温扩增反应试剂混合物的方法具有重要的价值。申请号为200810159414. 3的发明专利“环介导等温扩增反应试剂混合物的保存方法”公开了一种在环介导等温扩增反应试剂混合物中添加干燥保护剂 然后进行真空干燥或快速风干实现环介导等温扩增反应试剂混合物常温长期保存的方法，但这种方法需要专门的真空冷冻干燥仪或快速风干机等复杂的设备，还需要消耗大量的能源，并不是一种十分经济的方法。所以，有必要开发新的、更加简便、经济、高效的核酸等温扩增试剂常温长期保存方法。
本发明的目的是提供一种基于多孔材料的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂，以弥补现有技术的不足。本发明的一个方面是提供一种在核酸等温扩增反应试剂中添加多孔材料从而使核酸等温扩增试剂或其混合物在常温或室温长期保存的方法。本发明的另一个方面是提供一种采用上述方法制作的核酸等温扩增试剂，以及包含有该反应试剂的试剂盒。本发明的保存方法，其特征是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。上述的核酸等温扩增反应液的组分为核酸等温扩增的聚合酶。上述核酸等温扩增反应液的组分还包括有引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)和/或三磷酸核苷酸(NTP)、核酸等温扩增聚合酶的反应缓冲液的任一种或几种。上述的核酸等温扩增的聚合酶为DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。上述的核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液为核酸序列依赖性扩增的反应缓冲 液、链替代扩增反应缓冲液或环介导等温扩增反应缓冲液。上述的多孔材料在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 005% 60%。上述的多孔材料为孔径不小于I纳米的多孔材料。上述的多孔材料为有序多孔材料和/或无序多孔材料。上述的有序多孔材料为微孔材料、介孔材料、大孔材料中的任一种或几种。上述的有序多孔材料为硅藻土、活性炭、氧化铝多孔陶瓷、氧化硅多孔陶瓷、介孔二氧化硅、SBA-15中的一种或几种。上述的无序多孔材料为多孔磷酸盐微晶玻璃、氧化硅凝胶、有机硅聚苯乙烯多孔材料中的一种或几种。上述的硅藻土在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 01% 10%，优选为 0. 02% 5%。上述的活性炭在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为0. 01% 35%，优选为 0. 02% 35%。上述的介孔二氧化硅在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml 为 0. 01% 20%，优选为 0. 02% 20%。上述的多孔磷酸盐微晶玻璃在核酸等温扩增反应液的组分中的添加质量体积百分比g/ml为1%飞0%，优选为5% 50%。本发明还涉及一种可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂，其特征在于，所述的反应试剂是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料制备的。上述的核酸等温扩增反应液为核酸等温扩增的聚合酶、引物、三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)、核酸等温扩增的聚合酶的反应缓冲液中的任一种或几种。本发明还包括一种核酸等温扩增反应试剂盒，该试剂盒包含有上述可在常温下长期保存的核酸等温扩增反应试剂。本发明方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分(等温扩增反应试剂的单独组分或其混合物)，可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下(常温或室温等温度条件)具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。说明书附I :固定化的LAMP反应体系在4°C储存下的活性衰减特征图；图2 :固定化的LAMP反应体系在25°C储存下的活性衰减特征图； 图3 :固定化的LAMP反应体系在37°C储存下的活性衰减特征图。
本发明涉及一种基于多孔材料的核酸等温扩增试剂的保存方法及试剂，所述的保存方法是在一种或几种核酸等温扩增反应液的组分中添加多孔材料进行保存。本发明方法处理后的核酸等温扩增反应液的组分可常温贮存和运输，使用时无需特殊处理，直接使用即可。本发明的方法具有工艺简单、成本低廉的特点，采用本发明方法处理后的等温扩增反应试剂混合物在便利的贮存条件下具有活性稳定持久的优点，这在大大降低等温扩增反应试剂的贮运成本的同时，还为等温扩增反应的实际操作带来极大的便利。该发明必将有力促进等温扩增技术的在科研、医疗、检验和检疫等领域的运用和基于等温扩增技术的诊断或检测试剂产品的大规模推广应用。
