专利名称：用于治疗肾细胞癌的化合物的制作方法光神霉素(也称为金霉酸、普卡霉素(plicamycin)或光辉霉素(mitramycin))是由链霉菌属的各种土壤细菌产生的一种金霉酸型聚酮抗生素。光神霉素具有化学式 測 QB光神霉素已经用于治疗骨转移患者的闻I丐血症、佩吉特氏(Paget)症、辜丸癌和白血病的靶向治疗(Yuan等，Cancer 2007，110 :2682_2690)。光神霉素还显示出具有作为用于缓和与P-地中海贫血和铼状细胞贫血症相关的症状的神经保护药物的潜力。光神霉素结合到DNA的小沟中富含GC的区域，并抑制了具有富含GC启动子的基因转录。因此光神霉素通过结合到这些位点的转录因子，例如Spl家族，的调节抑制的基因转录。已经证明Spl參与调节血管生成刺激物血管内皮生长因子(VEGF)，且已经有报导光神霉素用于抑制动物的血管增生。肾细胞癌(RCC)占所有癌症的2 3%，且为成人中肾脏癌症的最常见的类型。尽管常规的透明细胞肾细胞癌(ccRCC)占RCC病例的超过75%，但是RCC为具有多种组织病理亚型的异质性障碍。RCC的非透明细胞形式包括乳突(或易染)RCC、难染细胞肿瘤、嗜酸粒细胞瘤、集尿管癌和罕见的髓样癌。外科切除是目前首选的用于局部限制RCC的治疗，且通常在RCC较早阶段可以达到治愈。传统上认为RCC对放射疗法具有很大耐药性，并且体外研究已经显示肾脏癌细胞是人类细胞类型中最不放射敏感的细胞之一。并且，已经证明多数晩期RCC肿瘤对细胞毒素试剂具有耐药性，因此化疗在转移的肾脏癌症治疗中的作用非常有限。RCC的大多数病例为偶发的，且所有病例的仅约3%具有遗传原因。然而，针对RCC的罕见遗传形式的研究已经提供了关于家族性和偶发性RCC的在分子发病机理的有重大影响的观点。希佩尔-林道(VHL)病为显性遗传的多系统家族性癌症综合症，表征为透明细胞肾细胞癌(ccRCC)的生长以及成血管细胞瘤、胰腺损害和嗜铬细胞瘤。VHL为遗传性RCC的最常见原因。对VHL病的基因鉴定已经使人们认识到在偶发性ccRCC的进化中最频发的遗传事件是VHL肿瘤抑制基因(TSG)的体细胞失活。进ー步的工作已经使人们理解了 VHL TSG失活导致了 HIF-I和HIF-2转录因子的调节异常和缺氧-应答基因通路的激活(Latif等，Science 1994,260 1317-20 ；Foster 等，Cancer 1994,69 :230-4 ；Gnarra 等，Nat Genet1994,7 :85-90 ；Clifford 等，Genes Chromosomes Cancer 1998,22 :200-9 ；Maxwell 等，Nature 399 :271-275,1999 ；Banks 等，Cancer Res 2006,66 :2000_7)。目前已知在含氧量正常的条件下，VHL肿瘤抑制基因产物，pVHL，在泛素连接酶复 合体中发挥作用，该泛素连接酶复合体靶向为在蛋白酶体中用于破坏的缺氧-应答的转录因子亚基(HIF-Ia和HIF-2a)。VHL失活导致了 HIF-I和HIF-2的水平提高，引起了关于生长和血管增生的靶基因，例如VEGF和TOGF的过表达。这些发现已经提供了如索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib) (HIF靶基因通路的抑制剂)等药物在转移的RCC治疗中的用途的理论依据(Patel等，Br JCancer. 2006,94:614-9 ;Motzer 等，J Clin Oncol. 2009，27 :3584_90)。Birt-Hogg-Dube (BHD)综合症为与RCC敏感性有关的另一种显性遗传的家族性癌症综合症。BHD还与良性皮肤纤维毛囊瘤(毛囊的错构瘤)、多发肺囊肿和自发气胸相关(Toro等，J. Med. Genet. 2008,45 :321-331 )。BHD-相关的肾脏肿瘤具有各种的组织病理，但通常为难染RCC/嗜酸粒细胞腺瘤。BHD综合症由雌酮(FLCN)基因中失活突变引起(Nickerson等，Cancer Cell2002,2 :157-164 ;Schmidt 等，Am J Hum Genet. 2005,76 :1023-33 ;Lim等，Hum Mutat. 2010Jan 31(1) :E1043-51)，且来自BHD患者的肾脏肿瘤表明了体细胞FLCN的缺失。FLCN基因产物的精确功能仍然正在被阐明，但已经将雌酮(和雌酮相互作用蛋白FNIPl和FNIP2)与 mTOR 和 AMPK 信号通路相联系(Baba 等，Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A. 2006，103 15552-15557 ；Hasumi 等，Gene 2008，415 :60-7 ；Takagi 等，0ncogene2008, 27 :5339_47)。在具有肾脏-靶向的Flcn基因纯合性失活的小鼠中，肾脏肿瘤和囊肿随着mTOR的激活而发展，并且mTOR抑制剂钠巴霉素(rapamycin)减少了肾脏病变，并提高了存活率(Baba等，J. Natl. Cancer Inst. 2008，100 :140-154 ;Chen 等，PloS ONE 2008，33 :e3581 )。mTOR 抑制剂药物(例如Temsirolimus、Everolimus等)已经显示了治疗转移RCC的希望(Molina和Motzer Clin Genitourin Cancer 2008Dec,6Suppl I :S7_13)。通常提供BHD综合症的患者的肾脏影像以便进行RCC的早期检测。然而，ー些患者可能仅在患有晩期RCC之后才得到诊断。对于家族性的和偶发性的病例来说转移的RCC的治疗都具有挑战性。尽管偶有患者可以对用细胞因子干扰素和白细胞介素-2的免疫疗法有反应，但是最近以针对HIF下游祀点(例如舒尼替尼(Sunitinib)、索拉非尼(Sorafenib)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)等)，和mTOR通路(例如Temsirolimus、依维莫司(Eveix)Iimus))的靶向治疗已经成为最频繁的处理对策。然而，这些制剂，尽管延长了生命，但不是细胞毒性的，因此靶向细胞毒性制剂的鉴定将会是重大的进展。色霉素A3(ChA3)(—种金霉酸化合物)已经被鉴定为HIF-依赖的细胞毒素。ChA3显示了区别地杀死ccRCC细胞系中的VHL-缺陷细胞(Sutphin等，Cancer Res2007，67 (12)，5896-5902)。已经显示在VHL-阳性透明细胞RCC细胞系中HIF_2a的过表达表型模拟了VHL失活对于ChA3毒性敏感性的影响。然而，ChA3在FLCN-缺陷的和FLCN-野生型的细胞系中没有显示出差别生长抑制活性，暗示了其不可能对BHD综合症的药物治疗有用。因此，有需要克服以上讨论的缺陷的对肾细胞癌的治疗。而且，有需要以FLCN基因缺陷的细胞和与该缺陷相关的缺陷为靶点的治疗。
根据本发明，提供了一种用于治疗肾细胞癌的组合物，所述组合物包括光神霉素 或其药学上可接受的盐或溶剂化物。具体地，所述组合物适于在治疗透明细胞肾细胞癌中使用。所述组合物在与希佩尔-林道病或Birt-Hogg_Dub6综合症相关的肾细胞癌的治疗中特别有用。 本发明还提供了ー种用作抗FLCN无效(FLCN-nulI)或VHL无效(VHL-nulI)的肾细胞癌的细胞的细胞毒剂的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。细胞毒剂为对细胞有毒，且可导致细胞各种结果的制剂。细胞可能会停止活性生长和分裂，或可能经历坏死，或者细胞可能经历程序性细胞死亡(细胞凋亡)。经历坏死的细胞失去了细胞膜完整性，表现出快速膨胀，停止新陈代谢井向其周围释放细胞内含物。细胞凋亡的过程为ー种有序的事件，表征为折射率的变化、细胞质收缩、细胞核凝结和DNA裂解。凋亡的细胞停止新陈代谢，失去细胞膜完整性并裂解。本发明还提供了一种用于抑制FLCN无效的肾细胞癌细胞的生长的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了一种用于抑制VHL无效的肾细胞癌细胞的生长的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。术语“抑制”意味着減少、减缓或阻止。因此，本发明的化合物可以减少、减缓或阻止肿瘤细胞的生长。如此处所使用的，“生长”意味着尺寸増加或増殖或两者皆有。因此本发明的化合物可以抑制肿瘤细胞变得更大和/或可以防止肿瘤细胞分裂和复制，并防止肿瘤细胞的数量増加。细胞可以在体外。或者，细胞可以在体内并可以在受试者中发现。细胞可以来自于任何生物体，包括但不限于细菌。本发明还提供了ー种用于诱导FLCN无效的肾细胞癌的细胞死亡的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了ー种用于诱导VHL无效的肾细胞癌的细胞死亡的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了一种用于治疗与FLCN失活相关的肾细胞癌的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了ー种用于治疗FLCN失活相关的肾细胞癌的组合物，所述组合物包括长春新碱或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了一种用于治疗与FLCN失活相关的肾细胞癌的组合物，所述组合物包括紫杉醇(taxol)或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了一种用于治疗与FLCN失活相关的肾细胞癌的组合物，所述组合物包括叶下珠甙或其药学上可接受的盐或溶剂化物。 基因可能由基因突变而失活。突变可包括点突变(变换或颠换)、插入或缺失。点突变可以为沉默突变(编码相同的氨基酸)、错义突变(编码不同的氨基酸)或无义突变(编码终止子)。插入可以改变mRNA的剪切或引起改变基因产物的移码。缺失也可以改变读码框从而影响基因产物。在更大范围，染色体结构中的突变可以包括扩增或基因复制、染色体区域的缺失、染色体易位、中间缺失和染色体倒位。本发明还提供了一种用于治疗与VHL失活相关的肾细胞癌的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。本发明还提供了ー种超过对FLCN-野生型细胞的对FLCN无效细胞的差别生长抑制的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。优选地，所述组合物包括光神霉素或其治疗上有效的衍生物或代谢物。优选地，所述组合进ー步包括钠巴霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。所述组合还可包括钠巴霉素治疗上有效的衍生物或代谢物。本发明还提供了光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制备治疗肾细胞癌的药物的用途。具体地，本发明提供了光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制备治疗肾细胞癌的药物的用途。本发明还提供了光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物用于制备治疗VonHippel-Lindau病或Birt_Hogg-Dub6综合症的药物的用途。本发明还提供了一种治疗肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物的组合物。本发明还提供了一种治疗肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药包含紫杉醇(taxol )、叶下珠甙或长春新碱的组合物。本发明还提供了一种治疗肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药组合物，所述组合物包含光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物，并且所述组合物进ー步包含钠巴霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。所述“受试者”可以包括家养的动物，例如猫、狗等，家畜类(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)，实验动物(如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠等)和禽类。优选地，所述受试者为哺乳动物，例如灵长类，更优选为人。所述组合物可以进一歩包括药学上可接受的载体。所述组合物以有效地治疗受试者中肾细胞癌的量适当地给药。通常，化合物的“有效量”为需要达到ー个或多个期望结果的量。包括本发明化合物的组合物可以通过数个给药途径的任何ー个向受试者给药,包括，例如ロ服(例如以水性或非水性溶液或悬浮液，片剂、丸剤、粉剂、颗粒剂、糊剂的方式进行灌服而应用于口腔)，舌下给药、肛门给药、直肠给药或阴道给药(例如以阴道环、乳剂或泡沫剂方式)，胃肠外给药(包括例如灭菌溶液或悬浮液的肌肉、静脉、皮下或鞘内给药)，鼻部给药，腹膜内给药，皮下给药，经皮给药(例如以贴剂方式应用于皮肤)，或局部地(例如以霜剂、药膏或喷雾应用于皮肤)。所述化合物还可以配制为吸入剂。具体地，本发明提供了一种治疗透明细胞肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药包括光神霉素的组合物。本发明还提供了一种治疗透明细胞肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药组合物，所述组合物包含光神霉素，并进一歩包括钠巴霉素。本发明还提供了一种治疗与希佩尔-林道病或Birt-Hogg_Dub6综合症相关的肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素的组合物。本发明还提供了ー种治疗与希佩尔-林道病或Birt-Hogg-Dub6综合症相关的肾细胞癌的方法，所述方法包括向受试者给药组合物，所述组合物包含光神霉素，所述组合物进ー步包含钠巴霉素。 本发明还提供了ー种抑制FLCN无效的肾细胞癌细胞的生长的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素的组合物。本发明还提供了ー种抑制VHL无效的肾细胞癌细胞的生长的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素和钠巴霉素的组合物。本发明还提供了ー种抑制VHL无效的肾细胞癌细胞的生长的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素的组合物。本发明还提供了ー种抑制VHL无效的肾细胞癌细胞的生长的方法，所述方法包括向受试者给药包含光神霉素和钠巴霉素的组合物。本发明还提供了ー种超过对FLCN-野生型细胞的对FLCN无效细胞生长的差别抑制的方法，所述方法包括给药包含光神霉素的组合物。本发明还提供了ー种超过对FLCN-野生型细胞的对FLCN无效细胞生长的差别抑制的方法，所述方法包括给药包含光神霉素和钠巴霉素的组合物。尽管ChA3显示了有区别地杀死ccRCC细胞系中的VHL-缺乏细胞，但是我们已经发现ChA3在FLCN-缺乏的和FLCN-野生型的细胞系中没有显示出差别生长抑制活性。我们没有发现色霉素A3 (ChA3)对于FLCN缺乏的细胞和FLCN阳性的细胞的生长抑制活性的任何差别。然而，已经令人惊奇地发现光神霉素证明了其对超过对FLCN-野生型细胞的对FLCN无效的细胞的选择敏感性。光神霉素显示了在FLCN无效的细胞和FLCN-野生型细胞之间GI5tl值大约10倍的差别(即，用于FLCN-野生型细胞的光神霉素的GI5tl是用于FLCN无效的细胞的光神霉素的GI5tl的大约10倍)，优选地，光神霉素以剂量依赖方式诱导了 FLCN无效的细胞中的细胞凋亡蛋白酶3/7 (caSpaSe3/7)的活性。光神霉素对于FLCN无效的细胞的毒性是对野生型FLCN表达细胞的毒性的约10倍。还令人惊奇地发现，根据等基因(isogenic)的VHL无效和VHL-表达RCC细胞系中的VHL状态，光神霉素显示出差别生长抑制活性。光神霉素的活性与ChA3相反，我们没有发现在FLCN缺乏的细胞系和FLCN阳性的细胞系的生长抑制活性之间ChA3的活性的任何差別。我们已经发现光神霉素显示其超过对FLCN-野生型细胞的对于FLCN无效的细胞的选择细胞毒素活性。因此，光神霉素展现出对RCC的治疗，特别是作为对于FLCN-缺乏的RCC和VHL-缺乏的RCC的基因型选择治疗。此外，还令人惊奇地发现紫杉醇(taxol)显示了在U0K257VHL无效的细胞和U0K257FLCN-野生型细胞之间GI5tl值有几乎7倍的差別。叶下珠甙和长春新碱都显示了在U0K257VHL无效的细胞和U0K257FLCN-野生型细胞之间GI5tl值有大约2倍的差别(见表I)。这说明紫杉醇、叶下珠甙和长春新碱都展现出对与FLCN失活相关的肾细胞癌的治疗。

现将通过结合附图的实施例说明本发明，其中图IA显示了由SRB检测测定的6种化合物对于U0K257-FLCN-阴性细胞和U0K257-FLCN-阳性细胞生长的抑制。图IB显示了 U0K257-FLCN阴性细胞和U0K257-FLCN阳性细胞对于15种化合物的GI50的比例。图2A显示了 U0K257-FLCN阴性细胞和U0K257-FLCN阳性细胞对于6种化合物的 细胞凋亡蛋白酶3/7活性的比例。图2B显示了 U0K257-FLCN-阴性细胞和U0K257-FLCN-阳性细胞在响应于药物暴露时的细胞存活比例。图2C显示了具有和不具有FLCN表达的UOK细胞响应于光神霉素暴露时细胞蛋白表达。图3显示了在U0K257-FLCN-阴性细胞和U0K257-FLCN-阳性细胞中由克隆形成检验测量的光神霉素的细胞毒性。图4显示了由光神霉素对786-0细胞和FTC-133细胞生长抑制的GI5tl值。图5显示了通过SRB检验测定的在对单独的光神霉素暴露和光神霉素结合钠巴霉素暴露的响应中U0K257-FLCN-和U0K257-FLCN+细胞的生长抑制。图6显示了具有和不具有FLCN表达的UOK细胞和FTC细胞中细胞蛋白表达的基础水平。图7显示了在单独的光神霉素和在光神霉素结合钠巴霉素中培养的U0K-257细胞和UOK-FLCN细胞比较的不成对t-检验。

U0K-257是源自BHD患者并具有种系FLCN移码突变(c. 1285dupC)的唯一的RCC细胞系(在没有无义介导的mRNA裂解存在下，预料导致了过早的蛋白切断)(p. His429ProfsX27) (Yang 等，Cancer Genet Cytogenet. 2008Jan 15,180(2) :100_9)。检查U0K257-FLCf细胞和U0K257-FLCN+细胞对由选自COMPARE分析的15种化合物诱导的生长抑制的敏感度。接种细胞24h后，将各种浓度的化合物引入到细胞中，培养持续了 72小时，利用磺酰罗丹明B (SRB)检验评定生长抑制。然后计算GI5tl值，GI50定义为抑制50%生长所需的化合物浓度。计算得到U0K257-FLCN—和U0K257-FLCN+的GI5tl值的比例，并将其作对于FLCN突变体细胞敏感度的指示。
图I (A)显示了用SRB测验測定的由氰基吗啉代-ADR、鸦胆丁、甲基吗啉-ADR、长春新碱、紫杉醇和光神霉素对U0K257-FLCN_ (实线)和U0K257-FLCN+ (虚线)细胞的生长抑制。细胞持续暴露于药物的所示浓度下72小吋。点值和GI5tl值为来自于至少三个实验的平均值土SD。图I (B)显示了在所有15种化合物中U0K257-FLCf和U0K257-FLCN+的GI5tl的比例。计算所述比例，并将其用作对于突变FLCN细胞敏感度的指示。 如图I和表I所示，七种化合物相对更抑制U0K257_FLCN_细胞(比例>1 )，并且最具有选择性的生长抑制敏感度是由光神霉素诱导的，其在U0K257-FLCN_细胞(64. 2±7. 9nM ；n=3)和U0K257-FLCN+细胞(3. 79±0. 39nM ；n=3)之间的GI5tl值具有几乎10倍的差別。但是，U0K257_FLCN_细胞对其他八种化合物较不敏感(比例〈I)，且氰基吗啉代-ADR诱导了最少的生长抑制敏感性，氰基吗啉代-ADR在U0K257-FLCN"细胞(0. 62±0. 16nM ；n=3)和 U0K257-FLCK 细胞(3. 79±0. 39nM ;n=3)之间的 GI5tl 值具有 6 倍的差另1J。以上数据显示尽管这些化合物以相同标准选自COMPARE算法，但是不同的药物对具有/不具有FLCN表达的细胞的差别敏感度之间存在很大变化。表I在具有/不具有FLCNa的UOK细胞中化合物-诱导的生长抑制


用于治疗肾细胞癌的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。具体地，所述化合物适用于治疗透明细胞肾细胞癌。所述化合物对治疗与希佩尔-林道病或Birt-Hogg-Dubé综合征相关的肾细胞癌尤其有用。用作抗FLCN无效和VHL无效的透明细胞肾细胞癌的细胞毒素试剂的组合物，所述组合物包括光神霉素或其药学上可接受的盐或溶剂化物。