一种靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法和应用的制作方法【技术领域】[0001]本发明属于纳米材料抗肿瘤药物【技术领域】，特别涉及一种高效低毒、纳米硒负载的靶向抗肝癌纳米粒子及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。[0002]根据世界卫生组织等报告，肝细胞癌(HCC)世界每年发病不少于一百万新患者。肝细胞癌是最常见的人类致死性恶性肿瘤之一。传统抗肿瘤药物的溶解性差、用药剂量大、副作用大以及特别是缺乏选择性而导致正常细胞损伤等问题已成为肿瘤治疗的一大瓶颈，极大地限制了化疗药物的使用。因此，人们迫切希望寻找到高效、低毒和高选择性的抗癌药物，即能靶向性杀伤肿瘤细胞，对正常细胞的细胞毒性较小，从而发挥最有效的抗肿瘤效果O[0003]纳米颗粒可作为药物的输运载体，由于其缓释作用而延长药物作用时间。同时在纳米颗粒上负载某种功能分子使其纳米功能化，以增加药物溶解度和稳定性，促进药物运输和吸收，进而增强药物效应，达到干预某种疾病的病理过程或治疗作用。因此，纳米功能化药物的研究受到广泛关注，具有良好的应用前景(Sunoqrot S，Liu Y, Kim DH, HongSeungpy0.1n Vitro Evaluation of Dendrimer—Polymer Hybrid Nanoparticles on TheirControlled Cellular Targeting Kinetics.Molecular Pharmaceutics，2013，10(6):2157-2166)o [0004]肝癌干细胞的研究已经成为生物医学领域最前沿和最热门的领域之一。肝癌干细胞除具有自我更新和多向分化能力等正常干细胞的基本特性外，还具有肿瘤细胞的特性，能够维持肿瘤的增殖和生长，逃避内源性及外源性调控自身内环境稳定的机制，并通过各种信号转导和调节通路参与肿瘤的发生、发展、转移和复发。新发现CD44是肝癌干细胞表面的标志物，在肝癌组织中的表达量显著高于癌旁组织、正常肝组织及其它组织，而CD44受体分子与透明质酸多糖骨架结构有较高的亲和力(Sackstein R.The biologyof CD44and HCELL in hematopoiesis:the’step2_bypass pathway’and other emergingperspectives.Curr Opin Hematol.2011，I8(4):239_48)。
[0005]为了克服上述现有抗肿瘤药物用药剂量高、对正常细胞的毒副作用大的缺点与对肿瘤细胞缺乏特异性的不足，本发明的首要目的在于提供一种高效低毒、纳米硒负载的祀向抗肝癌纳米粒子。该纳米粒子采用纳米硒负载细菌来源的anisomycin,以增加anosomycin的溶解度、稳定性和吸收率，降低它的使用剂量；同时负载有透明质酸，利用透明质酸的多糖骨架结构具有选择性引导分子靶向运输细菌来源小分子活性药物anisomycin到达肝脏肿瘤，特异性杀伤肝癌细胞，特别是肝癌干细胞，从而实现特异性杀伤肝脏肿瘤细胞，抑制肝癌细胞的活性，同时降低对正常细胞的毒副作用。[0006]本发明另一目的在于提供一种上述高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的靶向抗肝癌纳米粒子的制备方法。
[0007]本发明再一目的在于提供上述高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的靶向抗肝癌纳米粒子在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0008]本发明的目的通过下述方案实现:
[0009]一种高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的靶向抗肝癌纳米粒子，通过利用还原剂还原得到纳米硒，并负载anisomycin和透明质酸。
[0010]具体由以下方法制备得到:
[0011](I)将还原剂溶液滴加到硒源溶液与anisomycin溶液的混合溶液中进行反应,透析；
[0012](2)再与透明质酸钠溶胶混合反应，透析，得到高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的革巴向抗肝癌纳米粒子(HA-SeNPsOAm)。
[0013]步骤(1)反应体系中，还原剂的终浓度为I~8mmol -l-1 ;硒源的终浓度为0.25~2mmo1.L 1 ；anisomycin 的终浓度为 0.2 ~2mmo1 ^L10
[0014]步骤⑵反应体系中，所用透明质酸钠的量为每lX10_3mmol硒源,使用I~2mg透明质酸钠。 [0015]优选地，所述的硒源指二氧化硒和亚硒酸钠中的至少一种。
[0016]优选地，所述硒源溶液的浓度为0.5~15mmol.L-1 ;更优选为5mmol.I71。
[0017]优选地，所述anisomycin溶液中anisomycin的浓度为10~80mmol.L-1 ;更优选为 20mmol.L、
[0018]所述anisomycin溶液的溶剂为乙醇。
[0019]优选地，所述的还原剂溶液指维生素C、半胱氨酸、谷胱甘肽或硼氢化钠的水溶液。
[0020]优选地，所述还原剂溶液的浓度为5~50mmol.L-1 ;更优选为20mmol.I71。
[0021]优选地，所述透明质酸钠溶胶的浓度为50mg/mL。
[0022]步骤⑴中所述反应的条件为室温下搅拌反应6~12h。
[0023]所述透析指在水中室温下透析12~24h。
[0024]步骤⑵中所述反应的条件为室温下搅拌反应6~12h。
[0025]所述透析指在水中室温下透析12~36h。
[0026]上述反应中，所述还原性溶液优选缓慢滴加，滴加速度为5~50 μ L/s,最佳滴加速度为10 μ L/s。
[0027]上述反应优选在转速为400转/分钟的搅拌下进行。
[0028]上述反应的透析过程中优选更换透析外液4~6次。
[0029]上述反应在常温常压下即可进行，所述的水均优选使用超纯水。
[0030]本发明上述方法制得的高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的靶向抗肝癌纳米粒子的保存方式是在2~10°C下以溶胶或粉末形态保存。
[0031]本发明的高效低毒、纳米硒化透明质酸运载的靶向抗肝癌纳米粒子采用纳米硒负载细菌来源的anisomycin,以增加anosomycin的溶解度、稳定性和吸收率，降低它的使用剂量；同时负载有透明质酸，利用透明质酸的多糖骨架结构选择性引导分子靶向运输细菌来源小分子活性药物anisomycin到达肝脏肿瘤，特异性杀伤肝癌细胞，特别是肝癌干细胞，从而实现特异性杀伤肝脏肿瘤细胞，抑制肝癌细胞H印G2的活性，同时降低对正常细胞的毒副作用，可应用于制备抗肿瘤药物中。
[0032]本发明的机理为:
[0033]本发明首次利用纳米硒负载细菌来源的anisomycin,提高anosomycin的溶解度、稳定性和吸收率，降低使用剂量；同时负载有透明质酸，利用透明质酸的多糖骨架结构选择性引导分子靶向运输细菌来源小分子活性药物anisomycin到达肝脏肿瘤，特异性杀伤肝癌细胞，特别是肝癌干细胞，从而实现特异性杀伤肝脏肿瘤细胞，抑制肝癌细胞H印G2细胞的活性，同时降低对正常细胞的毒副作用。
[0034]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果:
[0035](I)本发明首次合成了负载细菌来源抗肿瘤活性分子anisomycin的功能化纳米硒粒子HA-SeNPsOAm，以解决抗肝脏肿瘤药物的选择性。
[0036](2)本发明提供的靶向抗肝癌纳米粒子是以肝癌干细胞中高表达的CD44为靶标，在纳米硒上负载与肝癌干细胞CD44膜受体分子结合的透明质酸，同时负载高效抗肿瘤的细菌源性活性小分子anisomycin,并使其纳米化合成HA-SeNPsOAm,从而实现祀向运输HA-SeNPsiAm到达肝癌细胞的目的，能够特异性抑制肝癌细胞的增殖和迁移。
[0037](3)本发明的祀向抗肝癌纳米粒子,其粒径低至30~60nm,用药剂量为12.5~50ng/ml,明显低于现有技术制备的其它药物的粒径和用药剂量，且纳米粒径大小与抗肝癌细胞活性密切关联，显著低于现有临床上常用抗肿瘤药物的使用剂量，大大降低了药物在有效用药剂量范围内对正常细胞的细胞毒性。
[0038](4)本发明制 备条件简单，所用原料廉价易得，过程无需添加其它辅助试剂，产品可直接保存和使用。



[0039]图1是HA-SeNPs@Aml#的透射电镜TEM图(A)，高倍透射电镜HR-TEM图⑶，以及能谱仪EDS上的元素分析图(C)。
[0040]图2是HA-SeNPs@Am2#的粒径分布图。
[0041 ] 图3是HA-SeNPs@Am3#的粒径分布图。
[0042]图4 是 HA-SeNPsOAm 对 H印G2、CT26、HeLa 和 HUVEC-12 细胞的吸收图。
[0043]图5是HA-SeNPs@Aml#在不同浓度下对H印G2、CT26、HeLa和HUVEC-12细胞增殖的抑制作用图，其中，*ρ〈0.05，**ρ〈0.01vs.HUVEC-12 组。
[0044]图6是HA-SeNPsOAm对H印G2细胞增殖的抑制作用图，其中，HA-SeNPsiAml#,HA-SeNPsiAm2#, HA-SeNPsiAm3# 分别代表实施例 1，2，3 所制备的 HA-SeNPs@Am，*p〈0.05，**ρ〈0.01vs.control 组。
[0045]图 7 是 HA-SeNPs@Aml# 在 25ng/mL 浓度下对 H印G2、CT26、HeLa 和 HUVEC-12 细胞迁移的抑制作用图。

[0046]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0047]实施例1:新型靶向抗肝癌药物HA-SeNPs@Aml#的制备[0048]配制5mmol.L—1亚硒酸钠水溶液,2OmmoI.L—1维生素C还原性溶液和20mmol.L—1的 anisomycin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)乙醇溶液。取 0.25ml anisomycin 溶液，加入0.25mL亚硒酸钠溶液，磁力搅拌使之充分混合后，向该混合溶液缓慢滴加0.25mL维生素C溶液，边滴加边磁力搅拌，滴加完毕，待红色不再明显加深，加水定容至2.5mL，反应12小时后，将反应液转移到透析袋(截留分子量6000)中透析24小时后，将该透析处理过的反应液与0.05ml的50mg/mL的透明质酸钠凝胶混合均匀，使用37%的浓盐酸调节pH值至5.0，磁力搅拌反应12小时，将该反应液转移至透析袋(截留分子量6000)中透析36小时后，即得到具有靶向作用的纳米硒化透明质酸运载的抗肝癌药物HA-SeNPs@Aml#溶液。所得纳米溶液通过透射电子显微镜(TEM)观察。如图1A所示，其粒径为30~60nm。如图1B所示，在高倍透射电镜(HR-TEM)下进行观察，其表面富含抗肿瘤药物分子，在能谱仪上对该纳米粒子进行元素分析，硒含量为48.5% (图1C)。将该纳米粒子在4°C下以溶胶或冻干成粉末形态保存。
[0049]实施例2:新型靶向抗肝癌药物HA-SeNPs@Am2#的制备
[0050]配制2.5mmol.L—1亚硒酸水溶液，IOmmol.L—1维生素C还原性溶液和20mmol.L—1的anisomycin乙醇溶液。取0.12ml anisomycin溶液,加入0.25mL亚硒酸溶液,磁力搅拌使之充分混合后，向该混合溶液缓慢滴加0.25mL维生素C溶液，边滴加边磁力搅拌，滴加完毕，待红色不再明显加深，加水定容至2.5mL，反应12小时后，将反应液转移到透析袋(截留分子量6000)中透析24小时后，将该透析处理过的反应液与0.025ml的50mg/mL的透明质酸钠凝胶混合均匀，使用37%的浓盐酸调节pH值至5.0,磁力搅拌反应12小时，将该反应液转移至透析袋(截留分子量6000)中透析36小时后，即得到具有靶向作用的纳米硒化透明质酸运载的抗肝癌药物HA-SeNPS@Am2#溶液。所得纳米溶液通过纳米粒度仪测试。其粒径为65~90nm(图2)。将该纳米粒子在4°C下以溶胶或冻干成粉末形态保存。
[0051]实施例3:新型 靶向抗肝癌药物HA-SeNPs@Am3#的制备
[0052]配制5mmol.L—1亚硒酸钠水溶液,2OmmoI.L—1维生素C还原性溶液和20mmol.L—1的anisomycin乙醇溶液。取0.25ml anisomycin溶液,加入ImL亚硒酸钠溶液,磁力搅拌使之充分混合后，向该混合溶液缓慢滴加ImL维生素C溶液，边滴加边磁力搅拌，滴加完毕，待红色不再明显加深，加水定容至2.5mL，反应6小时后，将反应液转移到透析袋(截留分子量6000)中透析24小时后,将该透析处理过的反应液与0.1ml的50mg/mL的透明质酸钠凝胶混合均匀，使用37%的浓盐酸调节pH值至5.0，磁力搅拌反应6小时，将该反应液转移至透析袋(截留分子量6000)中透析36小时后，即得到具有靶向作用的纳米硒化透明质酸运载的抗肝癌药物HA-SeNPS@Am3#溶液。所得纳米溶液通过纳米粒度仪测试。其粒径为110~190nm(图3)。将该纳米粒子在4°C下以溶胶或冻干成粉末形态保存。
[0053]实施例4:人肝癌细胞对抗肝癌新药HA-SeNPsIgAm的选择性吸收
[0054]配制5mmol.L—1亚硒酸钠水溶液，20mmol.L—1维生素C溶液和20mmol.L—1的anisomycin溶液。取0.25ml anisomycin溶液,加入0.25ml亚硒酸钠溶液,磁力搅拌使之充分混合后，向该混合溶液缓慢滴加0.25ml维生素C溶液，边滴加边磁力搅拌，滴加完毕，待红色不再明显加深，加水定容至2.5ml，反应12小时后，将反应液转移到透析袋(截留分子量6000)中透析24小时后，将该透析后的反应液与0.05ml的50mg/mL的透明质酸钠凝胶混合均匀后，往该混合溶液中滴加100 μ L浓度为0.5mg.mL-1的香豆素6溶液作为HA-SeNPsiAm荧光标记物，调节pH值至5.0,磁力搅拌反应12小时，将该反应液转移至透析袋(截留分子量6000)中透析36小时后，即得到含有香豆素6的纳米功能化抗肿瘤药物HA-SeNPsOAm溶液。测试含有荧光染料香豆素6的HA-SeNPsOAm对人肝癌H印G2细胞、小鼠结肠癌CT26细胞、人子宫颈癌HeLa细胞和人脐静脉内皮细胞HUVEC-12(四株细胞购于American Type Culture Collection公司)吸收的影响。操作如下:取处于对数生长期的H印G2、CT26、HeLa和HUVEC-12细胞，分别调整活细胞浓度为2 X IO4个/mL，5X IO4个/1^，5104个/1^，8104个/1^，加于12孔培养板，每孔ImL培养基，在培养箱中培养12h待贴壁后，吸弃原培养基，每孔重新加入500 μ L新鲜培养基，该培养基中含负载荧光染料HA-SeNPsiAm的浓度为50 μ Μ，置37°C，5% CO2培养箱中培养2小时，PBS洗三次，在荧光显微镜(Nikon EclipseSOi)下观察，采集细胞信息。如图4所示，人肝癌细胞组对本发明所制得纳米硒化透明质酸运载的HA-SeNPsOAm的吸收作用明显高于其它组细胞，这说明本发明所制得的靶向抗肝癌新药HA-SeNPsOAm在体外展示出了良好的肝癌细胞靶向性，能够更加快速、大量的进入肝癌细胞，且随着时间的增加而增加。
[0055]实施例5:抗肝癌新药HA-SeNPsOAml#靶向抑制人肝癌细胞增殖
[0056]取处于对数生长期的H印G2、CT26、HeLa和HUVEC-12细胞，分别调整活细胞浓度为 IXlO5 个 /mL，3X105 个 /mL，2.5X IO5 个 /mL，3X105 个 /mL，加于 96 孔培养板，每孔100 μ L培养基，在培养箱中培养24h待贴壁后，吸弃原培养基，每孔重新加入200 μ L新鲜培养基，再分别加入不同浓度受试样品，阴性对照为未经药物处理组，加样组和对照组均设4个复孔，继续培养48h，然后加入MTT (5mg/mL) 20 μ L/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜150 μ L/孔，振荡IOmin左右，用酶标仪在490nm波长下测定OD值。计算细胞存活率，通过软件计算其半数抑制浓度ic5(1。
[0057]细胞存活率)=加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；
[0058]细胞抑制率(％ ) = 100% -细胞存活率；
[0059]由图5可见，本发明提供的纳米硒化透明质酸运载的HA-SeNPsOAm在体外实验中对人肝癌0fepG2)细胞具有很强的抑制作用，其IC5tl值为18.5ng/mL。而对HeLa和CT26细胞的增殖抑制作用明显低于H印G2细胞，且对人正常细胞HUVEC-12的细胞毒性较小，这说明本发明所制得的靶向抗肝癌新药HA-SeNPslgAm能够特异性抑制人的肝癌H印G2细胞的增殖。
[0060]实施例6:抗肝癌新药HA-SeNPsOAm的粒径与人肝癌细胞增殖抑制的关系
[0061]取处于对数生长期的!fepG2细胞，调整活细胞浓度为I X IO5个/mL，加于96孔培养板，每孔100 μ L培养基，在培养箱中培养24h待贴壁后，吸弃原培养基，每孔重新加入200 μ L新鲜培养基，再分别加入不同浓度受试样品(实施例1~3制备得到的HA-SeNPslgAmi#, HA-SeNPsiAm2#, HA-SeNPs@Am3#)，对照组为未经药物处理组，加样组和对照组均设4个复孔，继续培养48h，然后加入MTT (5mg/mL) 20 μ L/孔，4h后弃上清液，加入二甲基亚砜150 μ L/孔，振荡IOmin左右，用酶标仪在490nm波长下测定OD值。计算细胞存活率，通过软件计算其半数抑制浓度ic5(1。
[0062]细胞存活率)=加药孔的实际OD值/阴性对照孔的OD值；
[0063]细胞抑制率(％ ) = 100% -细胞存活率；
[0064] 由图6可见，本发明实施例1制备的HA-SeNPs@Aml#在体外实验中对人肝癌(HepG2)细胞的抑制作用最强，其IC5tl值为20ng/mL左右。随着纳米粒径的增大，HA-SeNPsOAm对HepG2细胞的抑制作用逐渐降低，这说明本发明所制得的靶向抗肝癌新药HA-SeNPslgAm在粒径低于60nm时能够发挥更强的抗肝癌细胞的活性。
[0065]实施例7:抗肝癌新药HA-SeNPsOAml#靶向抑制人肝癌细胞迁移
[0066]于24孔培养板中放入Transwell小室(装有聚碳酸酯微孔膜，孔径8 μ m),Transwell下室内加入0.5mL5%血清RPMI1640培养液后，取处于对数生长期的H印G2、CT26、HeLa和HUVEC-12细胞，用无血清RPMI1640培养液调整活细胞浓度为8 X IO4个/mL，
1.2 X IO5个/mL，1.0X IO5 个/mL，1.0X IO5 个/mL，分别加入 0.3mL 细胞悬液至 Transwel I 上室内，在37°C，5% CO2条件下培养6小时后，分别加入实施例1制备的HA-SeNPs@Aml#25ng/mL,同时设置未添加纳米粒子的正常对照组。继续培养24小时后，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，将已经侵入并贴附于微孔膜下层的细胞固定于4%多聚甲醛中15min，然后用尹红染色。随机计数8个视野，以确定迁移细胞数量，对比分析评价HA-SeNPsiAml#选择性抑制H印G2细胞迁移能力。从图7中可以看出，没有加入药物干预的对照组中，IfepG2、CT26、HeLa和HUVEC-12细胞迁移数目较多。加入纳米硒化透明质酸运载的HA-SeNPslgAm的实验组中，上述四株细胞的迁移受到不同程度的抑制，在H印G2细胞中表现最为明显。同时设置anisomycin (Am)对照组,加入25ng/mL anisomycin后，细胞被抑制的程度明显低于HA-SeNPs@Aml#组，这说明本发明所述靶向抗肝癌新药HA-SeNPs@Aml#特异性抑制人的肝癌HepG2细胞迁移的能力明显强于anisomycin。
[0067]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式 ，都包含在本发明的保护范围之内。