专利名称：一种vegf165类似物的制备的制作方法血管内皮生长因子(vascularendothelium growth factor，VEGF)是血管内皮细胞的特异丝裂原，1989年由!^errara等在牛垂体滤泡星形胶质细胞体外培养液中分离纯化出来的，具有细胞质的钙聚集作用，促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，增加血管通透性，血管保护等生物学作用。人的VEGF基因位于染色体的6p21. 3，编码VEGF的基因长141Λ，由8个外显子和 7个内含子交替组成，分子量35 45kD。VEGF根据VEGFmRNA剪接方式不同分为多个变构体，有 VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF183、VEGF189 和 VEGF206。VEGF165 以同源二聚体的形式存在，糖基化的VEGF165 二聚体相对分子质量约为45000，非糖基化的相对分子质量约为43000。血管内皮生长因子165(VEGF16Q是目前发现的最重要的肿瘤血管形成促进剂之一，具有促血管形成和增加血管通透性的双重功能，在肿瘤的发展和转移中起着重要作用。VEGF165在体内的半衰期比较短，大约为90分钟。容易受到体内纤溶酶和其他蛋白酶的作用而降解。VEGF165在血管内皮细胞培养、相关科学研究有着广泛的应用，并且在伤口愈合及冠心病的治疗上显示了广阔的前景。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血浆中的主要蛋白成分，它除了具有维持血浆渗透压功能以外，还能担当许多内源因子和外源药物的载体，从而调节激素活性，所载物质的毒性，以及药物的利用度。成熟的HSA有585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66. 5KDa，如此大的分子量减小了它在内循环时经肾排泄的量，再正常情况下，不易被肾小球虑过，血浆半衰期在20天左右。同时，HSA在人体内没有酶学和免疫学活性，是一种理想的生物活性蛋白载体。针对VEGF165的缺陷和HSA的优点，我们通过对VEGF165的结构特征分析，设计了高活性且稳定的VEGF165类似物，实现了在毕赤酵母中分泌表达和制备。结合白蛋白融合技术，获得高度稳定的VEGF165类似物。
本发明的一个内容是提供hVEGF165突变体与HSA生理特性于一体的人血管内皮生长因子165与人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在保持了人血管内皮生长因子165 生理特性的基础上，增加了作用位点，延长了体内半衰期，改善了溶解度，具有优良的药学特性。本发明的技术方案在前期的研究中本实验室保藏了重组质粒PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒。我们对VEGF165的纤溶酶位点进行突变，这样使得VEGF165的体内的稳定性大大增加。再利用HSA高度稳定的特性，将突变的VEGF165与白蛋白进行融合，得到的VEGF165与白蛋白的融合分子在保持VEGF165生物学活性的同时具有高度的稳定性。这将使得该产品在细胞培养以及冠心病药物的开发上具有目前市场产品不可比拟的优越性。本发明hVEGF165和HSA之间不加任何连接肽，可以避免因连接肽的加入而带来的融合蛋白稳定性和免疫源性方面的问题。本发明的第二个内容是提供表达该融合蛋白编码区的宿主和携带该融合蛋白编码区的重组表达载体。表达融合蛋白的宿主可以是细菌、酵母、动物细胞或植物细胞。表达出来的融合蛋白可以存在于宿主细胞内，也可以从宿主细胞中分泌出来；分泌所用的信号肽可以是大然的人血清白蛋白的信号肽，也可以是酿酒酵母阿尔法交配因子的信号肽，或者这两种信号肽的类似物；目的基因可以被整合到宿主的染色体中，也可以插入到质粒中。本发明优选的宿主系统是酵母表达系统，优选的酵母表达系统是毕赤酵母表达系统，优选的毕赤酵母表达系统是GS115和X33。这种表达系统除了具备原核表达系统的易操作、生长迅速、营养要求简单、易工业放大的特点外，还具有真核细胞的蛋白后修饰系统，有利于大量生产高质量的重组蛋白。与宿主对应的表达载体大多可以购买商品化的，如毕赤酵母表达系统对应的载体，分泌型的有 PPIC9K、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6，胞内型有 pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、 pGAPZ.pGAPZa等。优选的是毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K，它是酵母整合载体，带有纤氨酸缺陷型的选择性标记基因HIS4、AOXl启动子、MFa分泌信号肽和G418抗性基因等元件。AOXl (醇氧化酶操纵子)5’序列、3’序列用于方便编码基因整合至酵母基因组和控制编码基因的表达。转化带有融合cDNA的表达载体到宿主细胞中，可以用锂盐法、PEG法、原生质体法、电穿孔法或化学转化等方法。转化之后，可以用多种方法鉴定是否成功，如提取基因组 DNA进行PCR鉴定，或者对细胞培养上清中的蛋白进行HSA抗体和hVEGF165多抗检测。生产本发明的融合蛋白可以通过培养带有本发明构件的DNA的宿主系统来进行， 具体的培养方法可以用摇瓶或生物反应器。培养分为两个阶段宿主系统生长阶段和融合蛋白合成阶段。之后可以用各种蛋白分离的方法自含有本发明DNA构建体的细胞培养物中分离纯化融合蛋白，包括盐析、沉淀、超滤、层析、制备电泳等技术及这些技术的组合。图1 重组质粒pPIC9K-HSA-hVEGF165物理图谱图2 重叠PCR获得VEGF165的突变体1 重叠PCR获得的VEGF165突变片段图3 :融合蛋白的SDS-PAGE分析M 为低分子量蛋白质标准；1-12为GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165的发酵液上清具体实施方法一、实验材料JM109 空菌、DH5a/pPIC9K、毕赤酵母 GS115(his4Mut+)、PIC9K_hVEGF165 以及pBluescript-HSA质粒为本实验室保藏；质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；pyrobest DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA Ladder Marker等购自宝生物工程(大连)有限公司；所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司代为合成；所有测序服务由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。二、实验方法实施例1 :pPIC9K-HSA-VEGF165mut毕赤酵母表达质粒的构建。以PIC9K-hVEGF165为模板，通过重叠PCR扩增出hVEGF165突变体基因(图2)，用 2.0%的琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，回收500bp左右的片断，用Bsu361I、NotI对回收片断和pBluescript-HSA质粒进行双酶切，连接再转化到新鲜制作的JM109感受态细胞。挑选阳性转化子进行酶切验证。阳性重组子提取质粒再通过EcoRI/NotI双酶切获得片断插入到pPIC9K对应的酶切位点，获得正确的pPIC9K-HSA-VEGF165mut毕赤酵母表达质粒(图 1)，并通过EcoRI/NotI双酶切及测序进行验证。实施例2 重组酵母表达系统构建及融合蛋白的表达；活化并过夜培养JM109/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut，提取的质粒，经Mil线性化， 电击转化毕赤酵母GSl 15，转化物涂布与含0. 25mg/ml G418的MD平板上，30°C培养72小时，挑取所有的长出的菌落到含0. 5mg/ml G418的YPD平板上，30°C培养2_3大。挑取长势好的菌落到20ml液体YPD培养基中，30°C过夜培养，提取GSl 15全基因组DNA，PCR 鉴定出阳性重组子，并把它保存在含20%甘油的YPD中，冻存于-80°C，命名为GS115/ pPIC9K-HSA-hVEGF165。将GS115/pPIC9K-HSA-hVEGF165mut 接种到装有 30ml BMGY (IOOmM 磷酸钾，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4Χ1(Γ5%生物素；3%甘油)的 250ml 三角瓶中，215rpm，30C培养 24-36 小时，冷冻沉降菌体，弃去上清，加入25ml BMMY(1 OOmM磷酸钾，PH 6. 0 ；1. 34% YNB ；4X10_5% 生物素；2. 5%甲醇)。每M小时补加一次甲醇，诱导3天。SDS-PAGE检测重组融合蛋白的表达情况采用5%浓缩胶及12%分离胶的不连续垂直平板电泳，考马斯亮蓝R-250染色 (图幻。挑选表达量较高的菌株扩大培养，收集离心得上清，上清液经IOkDa分子截留量的膜超滤浓缩，再经Blue-S印harose层析分离，IM精氨酸洗脱获得较纯的HSA_hVEGF165融合蛋白。
人血管内皮生长因子165(hVEGF165)突变体与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白及其制备技术的发明属于长效重组融合蛋白技术领域。本发明的融合蛋白包括与人血管内皮生长因子165至少85％序列同源的第一区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区。利用重叠PCR的方法获得VEGF165的突变体，利用限制性酶切连接的方法将hVEGF165与HSA拼接，中间不加入任何连接肽。该融合蛋白可以在不改变融合蛋白特性的前提下，进行个别氨基酸残基的取代、缺失或加入，它们在保留了hVEGF165活性的基础上，可望显著延长在体内的半衰期，是药学领域中，能够替代hVEGF165的，有良好前景的药用融合蛋白。