专利名称：抑制vegf-a受体相互作用的修饰结合蛋白的制作方法图1.所选的经设计锚蛋白重复蛋白的特异性狗VEGF-A164结合。通过粗提取ELISA显示所选克隆与狗VEGF-A164 (VEGF)和阴性对照蛋白(MBP， 大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)的相互作用。用NeutrAvidin固定生物素化的狗VEGF-A164和MBP。数字是指在针对狗VEGF-A164或对应的人VEGF-A165的核糖体展示中所选的单一 DARPin 克隆。A =吸光度。白条表示与狗VEGF-A164的结合，黑条显示与MBP的非特异性背景彡口口 图2.所选DARPin对球状体长出(spheroid outgrowth)的抑制。在各种浓度的(a)DARPin #30 (SEQ ID N0:4 的 I 至 126位氨基酸)(对VEGF-Axxx 具有特异性的DARPin)，或者(b) DARPin NC,对VEGF-Axxx无特异性的阴性对照DARPin的存在下，显示在球状体长出抑制测定中幼芽(sprout)的长度。图3. VEGF-A同种型的特异性识别。关于VEGF-A同种型的结合蛋白的表面等离子体共振(SPR)分析。(a)和(b) : Avastin 的SPR分析。将250 nM Avastin 应用于具有固定的狗 VEGF-A164 (a)或狗VEGF-A164b (b)的流动池达100秒，接着用缓冲液流洗涤。
(c)和(d) : DARPin #27 (SEQ ID NO:1 的 I 至 159 位氨基酸)的 SPR 分析。将 250 nM DARPin #27应用于具有固定的狗VEGF-A164 (c)或狗VEGF-A164b (d)的流动池达 100秒，接着用缓冲液流洗涤。
RU =共振单位·
图4.在兔眼中人VEGF-A165的有效抑制。
血管渗漏兔模型显示与Lucentis 相比DARPin在眼中抑制人VEGF-A165的功效。 在第I天将PBS、DARPin #30或Lucentis 通过玻璃体内注射应用于各兔的一个眼(被处理眼)内。在第4天或第30天通过玻璃体内注射500 ng人VEGF-A165攻击各兔的双眼。 在VEGF-A165注射后48小时，通过测量在静脉内注射荧光素钠后I小时所有眼的玻璃体和视网膜中荧光素含量，来评价所有眼。
R =被处理眼/未处理眼的荧光素测量值的比率。标准差用误差条显示。4-PBS =注射PBS (对照)后4天的比率；4-D =注射DARPin #30后4天的比率；30-D =注射 DARPin #30后30天的比率；4-L =注射Lucentis 后4天的比率；30-L =注射Lucentis 后30天的比率。
发明详述哺乳动物VEGF-A作为两个可变剪接同种型家族存在(i)通过外显子8的近端剪接产生的促血管生成“VEGF-Axxx”同种型和(ii)通过外显子8的远端剪接产生的抗血管生成 “VEGF-Axxxb”同种型。优选本发明的结合域对狗、兔、猴或人来源的促血管生成VEGF-Axxx 具有特异性。更优选本发明的结合域对人来源的促血管生成VEGF-Axxx具有特异性。最优选本发明的结合域对人VEGF-A165具有特异性。
术语“蛋白”指多肽，其中多肽的至少部分具有或者能够在其多肽链内和/或之间通过形成二级、三级或四级结构获得限定的三维排列。如果蛋白包含两条或更多条多肽，则每条多肽链可非共价连接或者例如通过两条多肽之间的二硫键共价连接。各自具有或者能够通过形成二级或三级结构获得限定的三维排列的蛋白部分，称为“蛋白域”。此类蛋白域为本领域技术人员熟知。
如重组蛋白、重组蛋白域等中使用的术语“重组”，意指所述多肽通过使用相关领域技术人员熟知的重组DNA技术制备。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(如通过基因合成制备)克隆入细菌表达质粒(如PQE30, Qiagen)内。当将这样构建的重组表达质粒插入细菌(如大肠杆菌)时，该细菌可产生由这种重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽称为重组多肽。
术语“多肽标签”指连接于多肽/蛋白的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽/蛋白，或者其中所述氨基酸序列改善多肽/蛋白的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具备效应子功能。结合蛋白的各种多肽标签、部分和/或域相互之间可直接或经多肽接头连接。这些多肽标签在本领域众所周知，本领域技术人员完全可获得。多肽标签的实例是允许检测所述多肽/蛋白的小的多肽序列，例如His、myc、FLAG 或者Strep-标签或部分比如酶(例如酶如碱性磷酸酶)，或者可用于祀向(比如免疫球蛋白或其片段)和/或作为效应子分子的部分。
术语“多肽接头”指氨基酸序列，它能够连接例如两个蛋白域，多肽标签和蛋白域， 蛋白域和非多肽部分比如聚乙二醇，或两个序列标签。相关领域技术人员已知此类另外的域、标签、非多肽部分和接头。在专利申请书WO 02/20565的说明书中提供实例的列表。此类接头的特定实例是各种长度的甘氨酸-丝氨酸-接头和脯氨酸-苏氨酸-接头；优选所述接头具有2至24个氨基酸的长度；更优选所述接头具有2至16个氨基酸的长度。
在本发明上下文中，术语“多肽”涉及由经肽键连接的多个(即两个或更多个)氨基酸的一条或多条链组成的分子。优选多肽由超过八个经肽键连接的氨基酸组成。
术语“聚合物部分”指蛋白性聚合物部分或者非蛋白性聚合物部分。“蛋白性聚合物部分”优选是这样的多肽，其在室温以约O.1 mM浓度在PBS中贮存I月时，不形成稳定的三级结构同时不形成超过10% (优选不超过5% ;还优选不超过2% ;甚至更优选不超过1% ； 最优选没有可检测到的量，如通过大小排阻层析(SEC)确定)低聚物或聚集物。当使用球蛋白作为SEC的分子量标准时，此类蛋白性聚合物部分以高于其有效分子量的表观分子量在SEC中运行。优选通过SEC确定的所述蛋白性聚合物部分的表观分子量为用其氨基酸序列计算的其有效分子量的1. 5x、2x或2. 5x。还优选通过SEC确定的所述非蛋白性聚合物部分的表观分子量为用其分子组成计算的其有效分子量的2x、4x或8x。优选所述蛋白性聚合物部分超过50%、70%或甚至90%氨基酸以约O.1 mM浓度在PBS中在室温下不形成稳定的二级结构，如通过圆二色性(CD)测量确定。最优选所述蛋白性聚合物显示无规卷曲构象的典型近UV⑶-谱。本领域技术人员熟知此类⑶分析。还优选由超过50、100、200、 300、400、500、600、700或800个氨基酸组成的蛋白性聚合物部分。蛋白性聚合物部分的实例是XTEN (Amunix注册商标；WO 07/103515)多肽，或者包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽，如描述于WO 08/155134。此类蛋白性聚合物部分可通过用标准DNA克隆技术、 接着其标准表达和纯化而产生基因融合多肽，共价连接于例如本发明的结合域。包含结合 VEGF-Axxx的重复域和此类蛋白性聚合物部分的结合蛋白实例显示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4。SEQ ID NO:1的I至159位氨基酸对应于重复域，SEQ ID NO:1的161至I’ 025 位氨基酸对应于蛋白性聚合物部分。SEQ ID N0:4的I至126位氨基酸对应于重复域，SEQ ID NO:4的131至640位氨基酸对应于蛋白性聚合物部分。
本发明的聚合物部分在分子量上可变化很大(即从约I kDa至约150 kDa)。优选聚合物部分具有至少2、5、10、20、30、50、70或100 kDa的分子量。
优选所述聚合物部分通过多肽接头与结合域连接。此类多肽接头的实例是SEQ IDNO:8和SEQ ID N0:9的I至8位氨基酸。
非蛋白性聚合物部分的实例是羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”意指PEG部分共价连接于例如本发明的多肽。用于结合非蛋白性聚合物部分、在重复域与C-端Cys残基之间含有多肽接头的重复蛋白实例是SEQ ID N0:2、3、5、6 和 7。
在具体实施方案中，PEG部分或任何其它非蛋白性聚合物可以例如经马来酰亚胺接头与半胱氨酸巯基偶联，半胱氨酸经肽接头与本文所述结合域(如SEQ ID N0:3)的N-或 C-端偶联。
术语“结合蛋白”指包含一个或多个结合域和一个或多个聚合物部分的蛋白，如下文进一步解释。优选所述结合蛋白包含至多四个结合域。更优选所述结合蛋白包含至多两个结合域。最优选所述结合蛋白只包含一个结合域。而且，任何此类结合蛋白可包含非结合域的另外的蛋白域、多聚化部分、多肽标签、多肽接头和/或单个Cys残基。多聚化部分的实例是免疫球蛋白重链恒定区(它们配对以提供功能性免疫球蛋白Fe域)，和亮氨酸拉链或者包含在两条此类多肽之间形成分子间二硫键的游离巯基的多肽。单个Cys残基可用于使其它部分与多肽缀合，例如通过使用本领域技术人员熟知的马来酰亚胺化学。
优选所述结合蛋白包含至多四个聚合物部分。更优选所述结合蛋白包含至多两个聚合物部分。最优选所述结合蛋白只包含一个聚合物部分。
还优选当用球蛋白作为分子量标准通过SEC在室温以O.1 mM浓度在PBS中分析时，所述结合蛋白具有至少70、100、200、300、500或800 kDa的表观分子量。
术语“结合域”意指表现与蛋白支架相同的“折叠”(三维排列)且具有如下文限定的预定性质的蛋白域。此类结合域可通过合理的，或者最通常是组合的蛋白工程技术 (本领域已知的技术)获得(Skerra, 2000,在上述引文中；Binz等，2005，在上述引文中)。例如，具有预定性质的结合域可通过包含以下步骤的方法获得(a)提供表现与如下文进一步限定的蛋白支架相同的折叠的不同蛋白域集合；和(b)筛选所述不同的集合和 /或从所述不同集合选择以获得·至少一种具有所述预定性质的蛋白域。不同的蛋白域集合可根据所用筛选和/或选择系统通过几种方法提供，并可包含使用本领域技术人员熟知的方法，比如噬菌体展示或核糖体展示。
术语“蛋白支架”意指具有其中高度耐受氨基酸插入、取代或缺失的暴露表面区域的蛋白。可用于产生本发明结合域的蛋白支架实例是抗体或其片段比如单链Fv或Fab 片段，来自金黄色葡萄球菌{Staphylococcus aureus)的蛋白A,来自大菜粉蝶{Pieris brassicae)的后胆色素结合蛋白或其它脂质运载蛋白，锚蛋白重复蛋白或其它重复蛋白， 和人纤连蛋白。本领域技术人员已知蛋白支架(Binz等，2005，在上述引文中；Binz等， 2004，在上述引文中)。
术语“预定性质”指诸如结合靶标、阻断靶标、激活靶标介导的反应、酶活性和相关其它性质等性质。根据期望的性质类型，普通技术人员将能够鉴定用于进行筛选和/或选择具有期望性质的结合域的格式和必需步骤。优选所述预定性质是结合靶标。
优选本发明的结合蛋白不是抗体或其片段，比如Fab或scFv片段。本领域技术人员熟知抗体及其片段。
还优选本发明的结合域不包含如存在于抗体中的免疫球蛋白折叠和/或III型纤连蛋白域。免疫球蛋白折叠是常见的全β蛋白折叠，由约7个排列在两个β折叠中的反向平行β_链的2层夹心组成。本领域技术人员熟知免疫球蛋白折叠。例如，此类包含免疫球蛋白折叠的结合域描述于WO 07/080392或WO 08/097497。
进一步优选本发明的结合域不包含如见于VEGFR-1或VEGFR-2的免疫球蛋白样域。此类结合域描述于WO 00/075319。
优选的结合域是具有抗血管生成效应的结合域。结合域的抗血管生成效应可通过本领域技术人员熟知的测定确定，比如描述于实施例2的HUVEC球状体发芽测定。
进一步优选包含70至300个氨基酸，特别是100至200个氨基酸的结合域。
进一步优选缺乏游离Cys残基的结合域。游离Cys残基不参与形成二硫键。甚至更优选不含任何Cys残基的结合域。
本发明的优选结合域是重复域或设计的重复域，优选如描述于WO 02/20565。
特别优选的结合域是设计的锚蛋白重复域(Binz，H. K.等，2004，在上述引文中)，优选如描述于WO 02/20565的设计的锚蛋白重复域。设计的锚蛋白重复域的实例显示于实施例。
下文关于重复蛋白的定义基于专利申请书WO 02/20565。专利申请书WO 02/20565进一步含有重复蛋白特征、技术和应用的一般描述。
术语“重复蛋白”指包含一个或多个重复域的蛋白。优选每个所述重复蛋白包含至多四个重复域。更优选每个所述重复蛋白包含至多两个重复域。最优选每个重复蛋白只包含一个重复域。而且，所述重复蛋白可包含另外的非重复蛋白域、多肽标签和/或多肽接头。
术语“重复域”指包含两个或更多个连续重复单元(模块)作为结构单元的蛋白域，其中所述结构单元具有相同的折叠，紧密堆叠以产生例如具有接合疏水核心的超螺旋结构。
术语“设计的重复蛋白”和“设计的重复域”分别指通过专利申请书WO 02/20565 中解释的发明程序获 得的重复蛋白或重复域。设计的重复蛋白和设计的重复域是合成的， 并非天然。它们分别是通过对应设计的核酸的表达所得人造蛋白或域。优选表达是在真核或原核细胞比如细菌细胞中进行，或者通过使用无细胞体外表达系统进行。
术语“结构单元”指局部有序的多肽部分，其通过沿多肽链相互靠近的两个或更多个二级结构区段之间的三维相互作用形成。此类结构单元表现结构基序。术语“结构基序” 指存在于至少一个结构单元中的二级结构元件的三维排列。本领域技术人员熟知结构基序。单独的结构单元不能获得限定的三维排列；但是，它们的连续排列，例如作为重复域的重复模块，导致相邻单元的相互稳定，产生超螺旋结构。
术语“重复单元”指包含一种或多种天然存在的重复蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”以多个拷贝出现，表现所有确定蛋白折叠的所述基序共同的限定的折叠拓扑学。此类重复单元的实例是犰狳重复单元、富亮氨酸重复单元、锚蛋白重复单元、tetratricopeptide重复单元、HEAT重复单元和富亮氨酸变体重复单元。含有两个或更多个此类重复单元的天然存在的蛋白称为“天然存在的重复蛋白”。重复蛋白的各重复单元的氨基酸序列相互之间比较时可具有显著数量的突变、取代、添加和/或缺失，但仍然基本保留重复单元的一般模式或基序。
优选用于推导重复序列基序的重复单元是自在靶标上选择的重复域获得(如实施例I所述)并具有相同靶特异性的同源重复单元。
术语“重复序列基序”指从一种或多种重复单元推导的氨基酸序列。优选所述重复单元来自对相同靶标具有结合特异性的重复域。
术语“折叠拓扑学”指所述重复单元的三级结构。折叠拓扑学通过形成至少部分 α -螺旋或β折叠的氨基酸延伸，或者形成线性多肽或环的氨基酸延伸，或者α -螺旋、β 折叠和/或线性多肽/环的任何组合来确定。
术语“连续”指排列，其中重复单元或重复模块串联排列。在设计的重复蛋白中， 有至少2个，通常为约2至6个，特别是至少约6个，经常是20个或更多个重复单元。在大多数情况下，重复单元将表现高度序列同一性(在对应位置的相同氨基酸残基)或序列相似性(氨基酸残基不同，但具有相似的物理化学性质)，一些氨基酸残基可能是在存在于天然存在蛋白的不同重复单元中非常保守的关键残基。但是，在存在于天然存在蛋白的不同重复单元之间因氨基酸插入和/或缺失和/或取代所致的高度序列变异性将是可能的，只要维持共同的折叠拓扑学。
本领域技术人员熟知通过物理化学方式比如X-射线晶体学、NMR或CD波谱学直接确定重复蛋白的折叠拓扑学方法。在生物信息学领域充分建立了且本领域技术人员熟知鉴定和确定重复单元或重复序列基序或者鉴定包含此类重复单元或基序的相关蛋白家族的方法，比如同源性检索(BLAST等)。精化初始重复序列基序的步骤可包含迭代过程。
术语“重复模块”指设计的重复域的重复氨基酸序列，它们最初来自天然存在重复蛋白的重复单元。包含在重复域中的各重复模块来自天然存在重复蛋白家族或亚家族(如犰狳重复蛋白或锚蛋白重复蛋白的家族)的一种或多种重复单元。
“重复模块”可包含具有存在于对应重复模块所有拷贝中的氨基酸残基的位置 (“固定位置”)和具有不同 或“随机化”氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。
术语“加帽模块”指与重复域的N-端或C-端重复模块融合的多肽，其中所述加帽模块与所述重复模块形成紧密的三级相互作用，从而提供帽，其将所述重复模块的疏水核心在不与连续重复模块接触的侧部与溶剂隔开。所述N-端和/或C-端加帽模块可以是， 或者可来自，靠近重复单元的加帽单元或其它见于天然存在的重复蛋白的域。术语“加帽单元”指天然存在的折叠多肽，其中所述多肽限定在N-端或C-端与重复单元融合的特定结构单元，其中所述多肽与所述重复单元形成紧密的三级相互作用，从而提供帽，其将所述重复单元的疏水核心在一侧与溶剂隔开。此类加帽单元与所述重复序列基序可具有序列相似性。加帽模块和加帽重复描述于WO 02/020565。例如，SEQ ID NO: 2的N-端加帽模块由I 至32位氨基酸编码。还优选在5位具有甘氨酸或天冬氨酸残基的此类N-端加帽模块。
术语“靶标”指个别分子比如核酸分子、多肽或蛋白、碳水化合物，或者任何其它天然存在的分子，包括此类个别分子的任何部分，或者两个或更多个此类分子的复合物。靶标可以是整个细胞或组织样品，或者可以是任何非天然的分子或部分。优选靶标是天然存在或非天然的多肽或者含有化学修饰的多肽，例如通过天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化修饰。在本发明的特定应用中，靶标是VEGF-Axxx或VEGFR-2。
术语“共有序列”指氨基酸序列，其中所述共有序列通过多个重复单元的结构和/ 或序列比对获得。使用两个或更多个经结构和/或序列比对的重复单元并且在比对时允许空位，可以确定各位置最常见的氨基酸残基。共有序列是包含在各位置最常出现的氨基酸的序列。在其中两种或更多种氨基酸超过平均数地出现在单个位置的事件中，共有序列可包括那些氨基酸的子集。所述两个或更多个重复单元可取自包含在单种重复蛋白中的重复单元，或者来自两种或更多种不同的重复蛋白。
本领域技术人员熟知共有序列及其确定方法。
“共有氨基酸残基”是见于共有序列的某个位置的氨基酸。如果两种或更多种，如三、四或五种氨基酸残基以相似概率见于所述两个或更多个重复单元中，共有氨基酸可以是最常见的氨基酸之一或者所述两种或更多种氨基酸残基的组合。
进一步优选非天然存在的结合蛋白或结合域。
术语“非天然存在的”意指合成的或不来自天然，更具体来讲，术语意指用人手制造。术语“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合域”意指所述结合蛋白或所述结合域是合成的(即通过化学合成用氨基酸制备)或重组的且不来自天然。“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合域”分别是通过对应设计的核酸表达获得的人造蛋白或域。优选表达在真核或细菌细胞中进行，或者通过使用无细胞体外表达系统进行。而且，术语意指所述结合蛋白或所述结合域的序列不作为非人造序列条目呈现在序列数据库，例如 GenBank> EMBL-Bank或Swiss-Prot中。本领域技术人员熟知这些数据库及其它相似的序列数据库。
结合域可通过与VEGF-Axxx结合或通过与VEGFR-2结合抑制VEGF-Axxx与 VEGFR-2结合，使得VEGF-Axxx与VEGFR-2之间的表观解离常数(Kd)增加大于IO2倍，优选超过IO3倍，更优选超过IO4倍，更优选超过IO5倍，最优选超过IO6倍。优选结合域与 VEGF-Axxx或VEGFR-2相互作用的Kd低于1(Γ7Μ，优选低于1(Γ8Μ，更优选低于1(Γ9Μ，更优选低于ΙΟ,Μ，最优选低于10_ηΜ。本领域技术人员熟知确定蛋白-蛋白相互作用解离常数的方法，比如基于表面等离子体共振(SPR)的技术。
优选结合域结合VEGF-Axxx。甚至更优选结合人VEGF-A165的结合域。
术语“PBS”意指含有137 mM NaCl、10 mM磷酸盐和2. 7 mM KCl且具有pH 7. 4的磷酸盐缓冲水溶液。
优选在含有100 mM 二硫苏糖醇(DTT)的PBS中在37°C孵育I或10小时后不丧失其自然三维结构的结合蛋白和/或结合域。
在一个特定实施方案中本发明涉及包含结合域的结合蛋白，所述结合域抑制 VEGF-Axxx结合至VEGFR-2并具有指示或优选的中点变性温度和如上文限定的非聚集性质，其中所述结合蛋白以低于100 nM的IC5tl值抑制HUVEC球状体的发芽。
术语“HUVEC”意指人脐静脉内皮细胞，可将其从正常人脐静脉分离，并且其对 VEGF-A刺激起反应。本领域技术人员熟知测量HUVEC球状体发芽的测定，比如描述于实施例2的测定。
IC50值是物质比如结合蛋白或结合域对经实验确定的参数比如HUVEC球状体发芽的50%体外抑制所需的浓度。本领域技术人员可容易确定IC5tl值(KorfT T.和AugustinH.G. , J. Cell Biol. 143(5)，1341—52，1998)。
优选以低于10 nM，优选低于I nM，更优选低于O.1 nM，最优选低于O. 05 nM的IC5tl 值抑制HUVEC球状体发芽的结合蛋白和/或结合域。
进一步优选抑制HUVEC球状体发芽的单体结合蛋白和/或结合域，其IC5tl值低于雷珠单抗(Lucentis , Genentech注册商标)、贝伐珠单抗(Avastin , Genentech注册商标)、阿柏西普(aflibercept) (VEGF Trap , Regeneron注册商标)或培加他尼 (Macugen , Pfizer注册商标)对应的IC50值。
优选结合域与VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF或PDGF相互作用的Kd高于I nM，优选高于10 nM，更优选高于IO2 nM，甚至更优选高于IO3 nM，最优选高于IO4 nM。
优选 VEGF-Axxx 是狗 VEGF-A164 或猿 VEGF-A165 或人 VEGF-A165，VEGF-Axxxb 是狗 VEGF-A164b 或猿 VEGF_A165b 或人 VEGF_A165b。
另一个优选实施方案是包含结合域的重组结合蛋白，其中所述结合域抑制 VEGF-Axxx结合至VEGFR-2，其中所述结合域是重复域或设计的重复域。此类重复域可包含1、2、3个或多个参与结合VEGF-Axxx的内部重复模块。优选此类重复域包含N-端加帽模块、2至4个内部重复模块和C-端加帽模块。优选所述结合域是锚蛋白重复域或设计的锚蛋白重复域。
优选重组结合蛋白包含与聚乙二醇(PEG)部分缀合的如本文所述结合域，优选其中所述PEG部分与所述结合域的单个Cys残基偶联。优选所述Cys残基以遗传法在所述结合域的C-末端引入。然后PEG部分可通过化学方式(例如通过使用本领域技术人员熟知的马来酰亚胺化学)偶联。此类包含与单个Cys残基缀合的PEG部分的结合蛋白实例在实施例中给出。
本发明的优选实施方案包括包含如本文所述结合域的重组结合蛋白，其中所述结合域在其C-端经由肽键与SEQ ID NO: 8缀合，SEQ ID NO: 8进而在C-端半胱氨酸巯基处与马来酰亚胺偶联的PEG (比如a-[3-(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯(NOF, Sunbright ΜΕ-200ΜΑ (20kD)或 Sunbright ME-400MA (40kD))) 缀合。在一个实施方案中α-[3_(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯具有至少约2、5、10、20、30、40、50、70或100 kD的分子量。在某些实施方案中a-[3-(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯具有至少约20或至少约40 kD的分子量。
另一个优选实施方案是包含至少一个对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复域的如上文限定的重组结合蛋白，其中所述重复域与选自SEQ ID N0:1至7的重复域竞争结合 VEGF-Axxx。优选所述重复域与SEQ ID NO:1或3的重复域竞争结合VEGF-Axxx。更优选所述重复域与SEQ ID NO: 3的重复域竞争结合VEGF-Axxx。
术语“竞争结合”意指本发明的两种不同结合域不能同时与相同靶标结合，但两者各自能够与相同靶标结合。因此，这样的两种结合域竞争结合所述靶。本领域技术人员熟知确定两种结合域是否竞争结合靶标的方法，比如竞争性ELISA或竞争性SPR测量(如通过使用BioRad的Proteon仪)。
与所选重复蛋白竞争性结合VEGF-Axxx的重组结合蛋白可通过本领域技术人员熟知的方法确定，比如竞争性酶联免疫吸附测定(ELISA)。
另一个优选实施方案是包含选自SEQ ID NO:1至7重复域、对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复域的重组结合蛋白。优选所述重复域选自SEQ ID N0:2或3的重复域。更优选所述重复域是SEQ ID N0:3的重复域。
一个或多个聚乙二醇部分可在结合蛋白的不同位置连接，此类连接可通过与胺、 巯基或其它合适的反应基团反应来实现。聚乙二醇部分的连接(聚乙二醇化)可为位点定向的，其中合适的反应基团被引入蛋白内以产生其中聚乙二醇化优先发生的位点，或者是原来存在于结合蛋白中的。巯基可存在于半胱氨酸残基中；胺基可以是例如见于多肽N-端的伯胺或者存在于氨基酸比如赖氨酸或精氨酸侧链的胺基。在优选实施方案中，例如通过与携带马来酰亚胺官能团的聚乙二醇衍生物反应，修饰结合蛋白以便在期望的位置具有半胱氨酸残基，允许在半胱氨酸上位点定向聚乙二醇化。聚乙二醇部分的分子量可变化很大 (即从约I kDa至约100 kDa)，聚乙二醇部分可为分枝或线性的。优选聚乙二醇具有约I 至约50 kDa,优选约10至约40 kDa,甚至更优选约15至约30 kDa,最优选约20 kDa的分子量。
在又一个实施方案中，本发明涉及编码特定重组结合蛋白的核酸分子。而且，考虑包含所述核酸分子的载体。
而且，考虑一种药用组合物，它包含一种或多种上述结合蛋白，特别是包含重复域的重组结合蛋白，或者编码特定重组结合蛋白的核酸分子，和任选药学上可接受的载体和/ 或稀释剂。本领域技术人员已知药学上可接受的载体和/或稀释剂，其在下文更详细地解释。甚至进一步地，考虑包含一种或多种上述重组结合蛋白，特别是包含重复域的结合蛋白的诊断组合物。
本发明的结合蛋白阻遏或预防VEGF诱发的病理性血管生成、血管渗漏(水肿)、 肺动脉高压、肿瘤形成和/或炎性病症。将“阻遏”理解为重组蛋白预防所述病理至一定程度，如至10%或20%，更优选50%，特别是70%、80%或90%，或甚至95%。
术语“水肿”意指由血管渗漏引起的病况。炎症期间血管舒张和渗透性增加可能是主要发病机制。例如，水肿促成中风后梗死扩展，在癌症患者中可引起危及生命的颅内高压。而且，血浆蛋白的外渗利于眼部肿瘤的转移性扩散，气道充血可引起致命性哮喘发作。 炎症期间出现的血管渗漏增加可导致呼吸窘迫、腹水、腹膜硬化(在透析患者中)、粘连形成(腹部手术)和转移扩散。
术语“血管生成”意指藉此形成新血管的基本过程。人的主要血管生成期发生在胚胎发育的前三个月，但血 管生成还作为正常生理过程出现在组织生长期间，比如肌肉或脂肪增加和月经周期和妊娠期间。
术语“病理性血管生成”指数种疾病状态的维持和进展期间血管的形成和生长。病理性血管生成的特定实例见于血管(动脉粥样硬化、血管瘤、血管内皮瘤)、骨和关节(类风湿性关节炎、滑膜炎、骨和软骨破坏、骨髓炎、血管翳生长、骨赘形成、新生物和转移)、 皮肤(疣、化脓性肉芽肿、毛发生长、卡波氏肉瘤、瘢痕疙瘩、过敏性水肿、新生物)、肝、肾、 肺、耳及其它上皮(炎性和感染性过程包括肝炎、肾小球肾炎、肺炎；和哮喘、鼻息肉、耳炎、移植病症、肝再生性病症、新生物和转移)、子宫、卵巢和胎盘(因子宫内避孕装置引起的功能障碍性子宫出血、滤泡囊肿形成、卵巢过度刺激综合征、子宫内膜异位症、新生物)、 脑、神经和眼(早产儿视网膜病、糖尿病性视网膜病、脉络膜及其它眼内病症、白质软化 (Ieukomalacia)、新生物和转移)、过劳的心和骨骼肌、脂肪组织(肥胖)、内分泌器官(甲状腺炎、甲状腺肿大、胰腺移植病症)、造血作用(AIDS的卡波氏综合征)、造血系统恶性肿瘤(白血病)和淋巴管(肿瘤转移、淋巴增殖性病症)。
术语“视网膜缺血性疾病”意指视网膜的血液和氧气供应下降，视网膜的周围部分丧失其营养来源和停止正确发挥功能。视网膜缺血性疾病的特定实例是视网膜病。导致视网膜病的常见疾病是糖尿病性视网膜病、中央视网膜静脉闭塞、颈动脉狭窄和镰状红细胞视网膜病。糖尿病性视网膜病是糖尿病患者视力丧失的主要原因。在缺血性视网膜中，发生新血管的生长(新生血管形成)。这些血管经常生长在视网膜表面上，在视神经，或者在眼前面的虹膜上。新生血管不能更换必需营养物流，反而可引起许多问题比如玻璃体出血、 视网膜剥离和失控的青光眼。出现这些问题是因为新生血管脆弱且容易出血。如果在其早期发现，用全视网膜光凝术有时可阻止增殖性糖尿病性视网膜病。但是，有时，玻璃体切割术是唯一的选择。
除这些视网膜病以外，眼的血管疾病还包括眼部新生血管性疾病，比如黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿(DME)。黄斑变性因黄斑下面脉络膜管的新生血管生长引起。有两种黄斑变性类型干性和湿性。虽然湿性黄斑变性只占15%所有黄斑变性，但几乎所有湿性黄斑变性都导致失明。此外，湿性黄斑变性几乎总是因干性黄斑变性引起。一旦一个眼被湿性黄斑变性累及，病况几乎总是影响另一个眼。湿性黄斑变性经常被称为湿性-AMD的年龄相关性湿性黄斑变性，因为它多见于老年人。
糖尿病性视网膜病(DR)和DME是最发达国家的劳动年龄人群中失明的首要原因。 全世界糖尿病个体数量增加提示DR和DME在未来几年将继续是视力丧失和相关功能缺损的主要促成因素。几种生物化学机制，包括蛋白激酶C-β活化、血管内皮生长因子产生增加、氧化应激以及细胞内山梨醇和高级糖基化终产物蓄积，可促成表征DR/DME的血管破坏。抑制这些途径预示对DR和DME的介入。
术语“肺动脉高压”意指其中肺动脉的血压异常高的病症。在不存在其它心肺疾病的情况下，将其称为原发性肺动脉高压。作为病理性动脉生成的结果而发生肺动脉的弥漫性变窄，接着因对血流的阻力增加的反应所致而发生肺动脉高压。发病率是100’000个人中有8个。但是，也可作为慢性阻塞性肺病(COPD)(比如肺气肿、慢性支气管炎或弥漫性间质性纤维化)的并发症和在哮喘样 CCffD患者中的并发症，发生肺动脉高压。CCffD的发病率是10’ 000个人中有5个。
另外，本发明的结合蛋白可用于治疗炎症，更特别是炎性病症。
本文所用术语“炎症”意指对活组织损伤的局部反应，尤其是小血管、其内容物及其相关结构的局部反应。血液组分穿过管壁进入组织内是炎症的标志，这样形成的组织集合称为渗出液或水肿。损害活组织的任何有害过程，如细菌感染，过度的热、冷、机械损伤比如粉碎、酸、碱、照射或者病毒感染都可引起炎症，无论累及的器官或组织。应当清楚分类为 “炎性疾病”的疾病和从烧伤至肺炎、麻风病、结核病和类风湿性关节炎的组织反应全都是 “炎症”。
本发明的结合蛋白可用于治疗肿瘤形成。术语“肿瘤”意指异常组织的团块，它在没有明显原因的情况下自预先存在的体细胞产生，没有有意义的功能，特征在于自主和不受约束生长的倾向。肿瘤与炎性或其它肿胀完全不同，因为肿瘤中细胞的外观及其它特征异常。异常的细胞，即总体组成肿瘤的细胞种类，因已发生以下一项或多项变化而不同于正常细胞(I)肥大，或者个体细胞的大小增加；(2)增生或者给定区域内细胞数目的增加；(3)间变，或者细胞的物理特征向更原始或未分化类型退化。肿瘤可以是良性的，例如脂肪瘤、血管瘤、骨瘤、软骨瘤和腺瘤。恶性肿瘤的实例是癌(比如乳腺肿瘤，呼吸道和胃肠道、 内分泌腺和泌尿生殖系统癌)、肉瘤(在结缔组织，包括纤维组织、脂肪组织、肌肉、血管、骨和软骨)、癌肉瘤(在上皮和结缔组织两者中)、白血病和淋巴瘤、神经组织(包括脑)的肿瘤和黑素瘤(有色皮肤细胞的癌)。本发明结合蛋白针对肿瘤的用途还可与本领域已知的任何其它肿瘤疗法比如放疗、光动力学疗法、化疗或手术组合。
药用组合物包含如上所述结合蛋白和药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂 (Remington’s Pharmaceutical Sciences 第 16 版，Osol, A. Ed. [1980])。技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂是盐水、林格氏液、葡萄糖溶液、Hank溶液、非挥发油、油酸乙酯、5%葡萄糖盐水、提高等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其它合适载体包括本身不引起产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，比如蛋白、多糖、聚乳酸、 聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药用组合物还可以是组合制剂，包含另外的活性剂，比如抗癌剂或抗血管生成剂(例如人VEGF-Axxxb ;优选人VEGF-A165b)。
用于治疗眼病的优选药用组合物包含如上所述结合蛋白和去污剂比如非离子型去污剂，包括但不限于聚山梨酯20 (如约O. 04%)，缓冲剂比如组氨酸、磷酸盐或乳酸和糖比如蔗糖或海藻糖。优选此类组合物包含如上所述结合蛋白和PBS。所述或任何其它本文所述药用组合物可以局部给药，经局部给予眼的一部分或者注入眼内例如注入结膜下、眼球前或眼球间隙或者直接注入眼内。或者，所述或此类其它药用组合物可通过胃肠外给药全身给药。优选将所述或此类其它药用组合物通过玻璃体内注射应用于眼。还优选将所述药用组合物局部应用于眼和作为滴眼剂。可将滴眼剂应用于角膜(眼中央的透明部分)从而让分子渗透入眼内。为了治疗累及眼后部的疾病，可能最期望结合蛋白在注射在结膜下或眼球周围时渗透巩膜。结合蛋白的给予可在调节眼表面以改善分子的渗透的准备步骤后进行。优选通过渗透增强剂调节上皮层比如角膜上皮以允许如例如上文描述的分子充分和快速渗透。本发明结合蛋白针对眼病的用途还可与本领域已知的任何其它疗法比如光动力学疗法组合。
将用于体内给药的制剂必须消毒或无菌。这通过过滤用无菌过滤膜容易完成。·
可制备持续释放制剂。在本发明一个实施方案中，眼内植入物可用于提供本发明的结合蛋白。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明多肽的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质采用成形物品的形式，如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶 (例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或者聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和Y-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物比如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，和聚-D- (-) -3-轻基丁酸。
药用组合物可通过技术人员知识范围内的任何合适方法给药。优选的给药途径是胃肠外。在胃肠外给药，将本发明的药物配制成与如上文限定的药学上可接受的赋形剂组合的单位剂量可注射形式，比如溶液剂、混悬剂或乳剂。给药的剂量和方式将取决于将治疗的个体和特定疾病。一般，给予药用组合物使得以I μ g/kg至20 mg/kg,更优选10 μ g/ kg至5 mg/kg,最优选O.1至2 mg/kg的剂量给予本发明的结合蛋白。优选其以推注剂量给药。连续输注也可使用，包括经渗透性微型泵连续皮下递送。如果这样的话，可将药用组合物以5至20 μ g/kg/分钟，更优选7至15 μ g/kg/分钟的剂量输注。特别是，将药用组合物通过注入眼内给药，使得以每次注射O.1 mg至10 mg,更优选每次注射O. 3至6 mg,最优选每次注射I mg至4 mg的剂量给予本发明的结合蛋白。此外，将药用组合物通过滴眼剂给予眼，使得将含有10至120 mg/ml,更优选20至100 mg/ml,最优选40至80 mg/ml浓度的本发明结合蛋白的单滴溶液应用于眼。
在本发明另一个实施方案中，如上所述的抑制VEGF-Axxx活性的结合蛋白可与抑制PIGF活性的结合蛋白或小分子(具有与如上文对VEGF-Axxx描述的抑制水平相同的 PIGF抑制水平)组合使用。该实施方案基于发现PIGF在其中VEGF-Axxx水平增高的部位血管生成的事实。此外,如上所述的抑制VEGF-Axxx活性的结合蛋白可与抑制血小板衍生生长因子O3DGF)、VEGF-C或其它VEGF蛋白家族成员、肿瘤坏死因子a (TNF α )、δ -配体样4 (D114)、白介素6 (IL-6)、神经毡蛋白或血管生成素2 (Ang2)活性的结合蛋白或小分子组合使用。
本发明进一步提供治疗方法。一方面，提供治疗视网膜病的方法，该方法包括给予有需要患者治疗有效量的本发明结合蛋白，特别是抑制人VEGF-Axxx与人VEGFR-2之间的相互作用但不抑制人VEGF-Axxxb与人VEGFR-2之间的相互作用的结合蛋白，和抑制 VEGFR-2介导的血管生成的结合蛋白。
本发明进一步涉及使用所述结合蛋白抑制细胞的VEGF-A生物学活性或者抑制由VEGFR-2介导的生物学活性的方法。细胞可位于体内或离体，可以是例如活生物体的细胞、培养的细胞或组织样品的细胞。所述方法可包括使所述细胞与本文公开的任何抑制 VEGF-A/VEGFR-2相互作用的结合蛋白接触，所述结合蛋白的用量和接触时间足以抑制此类生物学活性。
本发明提供治疗患有对抑制VEGF-Axxx或VEGFR-2起反应的病况的受试者的方法。此类方法包括给予所述受试者有效量的本文所述结合蛋白。病况可以不适当的血管生成为特征。病况可能是过度增殖性病况。适合治疗的病况(或病症)实例包括自身免疫性疾病、炎性病症、视网膜病(特别是增殖性视网膜病)和癌症，特别是上文描述疾病中的一种。本文所述任何结合蛋白都可用于制备用于治疗此类病症的药物，所述病症特别是选自下列的病症自身免疫性疾病、炎性病症、视网膜病和癌症。适合治疗的优选病况(或病症) 是一线转移肾细胞癌(first-line metastatic renal cell carcinoma)、复发多形性恶性胶质瘤、辅助结肠癌(adjuvant colon cancer)、辅助HER2-阴性乳腺癌、辅助HER2-阳性乳腺癌、辅助非 小细胞肺癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、一线晚期胃癌、一线HER2-阴性转移乳腺癌、一线HER2-阳性转移乳腺癌、一线转移卵巢癌、胃肠间质肿瘤、高危类癌、激素抵抗性前列腺癌、新诊断的多形性恶性胶质瘤、转移头颈癌、复发钼敏感性卵巢癌、二线转移乳腺癌、广泛的小细胞肺癌、具有先前治疗的CNS转移和复发多发性骨髓瘤的非鳞状非小细胞肺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌和胰腺癌、晚期卵巢癌(AOC)、具有恶性腹水症状的AOC患者和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma)。
本发明的重组结合蛋白可通过几种方法获得和/或进一步进化，比如在噬菌体 (W0 90/02809, WO 07/006665)或细菌细胞(W0 93/10214)表面上展示、核糖体展示(W0 98/48008)、质粒展示(W0 93/08278)或者通过使用共价的RNA-重复蛋白杂合构建体(W0 00/32823)，或者例如通过蛋白互补测定(W0 98/341120)的细胞内表达和选择/筛选。本领域技术人员已知此类方法。
用于选择/筛选本发明重组结合蛋白的锚蛋白重复蛋白库可根据本领域技术人员已知的方案获得(W0 02/020565，Binz, H. K.等，JMB, 332，489-503，2003,和 Binz 等，2004，在上述引文中)。在实施例1给出了用此类库选择VEGF-Axxx特异性DARPin。 类似地，如上文提出的锚蛋白重复序列基序可用于建立可用于选择或筛选VEGF-Axxx特异性DARPin的锚蛋白重复蛋白库。此外，本发明的重复域可用标准重组DNA技术(如WO 02/020565, Binz等，2003，在上述引文中和Binz等，2004，在上述引文中)自本发明的重复模块和适当的加帽模块(Forrer，P.等，FEBS letters 539，2-6, 2003)模块地组装。
本发明不限于在实施例描述的特定实施方案。按照下文描述的概要可使用和处理其它来源。实施例
下文公开的所有原料和试剂已为本领域技术人员所知，可从商业上获得或者可用众所周知的技术制备。
材料化学品购自 Fluka (Switzerland)。寡核苷酸来自 Microsynth (Switzerland)。除非另外说明，DNA聚合酶、限制酶和缓冲液来自New England Biolabs (USA)或Fermentas (Lithuania)。克隆和蛋白制备株是大肠杆菌XLl-blue (Stratagene, USA) JEGF变体来自 R&D Systems (Minneapolis, USA),或者在中国仓鼠卵巢细胞或巴斯德毕赤酵母O0ZcAia pastor is)中制备并根据标准方案纯化(Rennel, E. S.等，European J. Cancer 44, 1883-94，2008; Invitrogen的毕赤酵母(Pichia)表达系统)。生物素化VEGF变体以化学法通过将生物素部分与纯化VEGF变体的伯胺用标准生物素化试剂和方法(Pierce, USA) 偶联而获得。
分子生物学除非另外说明，根据所述方案实施方法(Sambrook J.，Fritsch E. F.和Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York)。
设计的锚蛋白重复蛋白库描述N2C和N3C设计的锚蛋白重复蛋白库(W0 02/20565; Binz等2003，在上述引文中；Binz等2004，在上述引文中)。在N2C和N3C中的数字描述存在于N-端和C-端加帽模块之间的随机化重复模块数。用于定义重复单元和模块内的位置的命名法基于Binz 等2004，在上述引文中，修改在于重复模块和重复单元的边缘移动一个氨基酸位置。例如， Binz等2004 (在上述引文中)重复模块的I位对应于本公开重复模块的2位，因此Binz 等2004 (在上述引文中)重复模块的33位对应于本公开下一重复模块的I位。
所有DNA序列都通过测序确认，所有所述蛋白的计算分子量都通过质谱确认。
实施例1:选择包含对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复域的结合蛋白使用核糖体展示(Hanes, J.和PlUckthun, A. , PNAS 94，4937-42，1997)，从由 Binz 等2004 (在上述引文中)描述的N2C或N3C DARPin库选择出许多对VEGF-Axxx具有结合特异性的设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。通过粗提取ELISA评估了所选克隆对特异性(VEGF-Axxx)和非特异性(MBP，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白)靶标的结合，提示成功选择 VEGF-Axxx结合蛋白(图1)。SEQ ID NO:1至7的重复域构成所选结合蛋白的氨基酸序列， 所述结合蛋白包含对VEGF-Axxx具有结合特异性的重复域。所选结合剂的序列分析揭示某些所选结合剂家族固有的特异性锚蛋白重复序列基序。
通过核糖体展示选择VEGF-Axxx特异性锚蛋白重复蛋白用狗VEGF-A164或人VEGF-A165作为靶蛋白，如描述的设计的锚蛋白重复蛋白库(W0 02/020565, Binz等，2003，在上述引文中和Binz等，2004，在上述引文中)和建立的方案(Zahnd, C·，Amstutz, P.和 Pliickthun, A. , Nat. Methods 4, 69-79，2007),通过核糖体展示(Hanes和Pliickthun,在上述引文中)进行了 VEGF-Axxx特异性锚蛋白重复蛋白的选择。使用建立的方案(Binz等2004，在上述引文中)，用N2C和N3C DARPin库两者对狗或人VEGF变体(包括用neutravidin或链霉抗生物素固定的生物素化变体)进行核糖体展示选择周期。每个选择周期后逆转录(RT)-PCR循环数不变地从40减至30，因富含结合剂而调节收率。对狗VEGF的最初4个选择周期得到了如通过对单一克隆的ELISA和 SPR测量所揭示的纳摩尔亲和力DARPin合并物(pool)。为了发现具有进一步改善亲和力的DARPin，对用neutravidin或链霉抗生物素固定的生物素化人或狗VEGF进行了另外的解离速率(off-rate)选择，在第二和第三个初始核糖体展示选择周期后获取合并物，接着对人VEGF进行结合速率(on-rate)选择周期。
如通过粗提取ELISA所示，经选择的克隆特异性结合VEGF-Axxx利用标准方案，用DARPin表达细胞的粗大肠杆菌提取物通过酶联免疫吸附测定 (ELISA)鉴定各种所选特异性结合VEGF-Axxx的DARPin。将所选克隆克隆入pQE30 (Qiagen)表达载体内，转化入大肠杆菌XLl-Blue (Stratagene)内，然后在装有I ml生长培养基(2YT，含 有1%葡萄糖和100 μδ/πι1氨苄青霉素)的96深孔板(每个克隆在单个孔内)中，在37°C生长过夜。在新鲜的96深孔板中，将I ml含有50 gg/ml氨苄青霉素的新鲜 2YT用100 μ 过夜培养物接种。在37°C孵育2小时后，用IPTG (I mM终浓度)诱导表达， 继续3小时。将细胞收集，再悬浮于100 μ B-PERII (Pierce)中，在室温下振荡孵育15分钟。然后加入900 μ PBS-TB (补充0.2% BSA, 0.1% Tween 20，pH 7. 4 的PBS)，离心除去细胞碎片。将100 μ 各溶胞克隆应用于装有通过其生物素部分固定的VEGF-Axxx变体或不相关MBP的NeutrAvidin包被MaxiSorp板的孔内，在室温下孵育I小时。用PBS-T (补充 0.1% Tween 20，pH 7. 4的PBS)充分洗涤后，用标准ELISA程序使板显影，所述程序使用单克隆抗-RGS(His)4抗体(34650，Qiagen)作为第一抗体和与碱性磷酸酶缀合的多克隆山羊抗小鼠抗体(A3562，Sigma)作为第二试剂。然后用4-硝基苯基磷酸二钠(4NPP，Fluka) 作为碱性磷酸酶的底物检测结合。在405 nm测量颜色显影。用于鉴定结合VEGF-Axxx的 DARPin的样品粗提取ELISA结果显示于图1。通过此类粗细胞提取ELISA筛选几百个克隆揭示超过一百种对VEGF-Axxx具有特异性的不同DARPin。选择这些结合蛋白用于进一步分析。特异性结合VEGF-Axxx的所选锚蛋白重复域的氨基酸序列实例提供于SEQ ID NO:1至 7。
从对VEGF-Axxx具有结合特异性的所选重复域推断重复序列基序将对VEGF-Axxx具有结合特异性的所选重复域的氨基酸序列通过本领域技术人员已知的序列分析工具进一步分析(W0 02/020565; Forrer等，2003，在上述引文中;Forrer, P. , Binz, H. K. , Stumpp, Μ. Τ.和 Pliickthun, A. , ChemBioChem, 5(2)，183-189，2004)。但是，与其中天然存在的重复基序用于推断重复序列基序的WO 02/020565相反，这里从对VEGF-Axxx具有结合特异性的所选重复域的重复单元推断重复序列基序。从而确定了包含共同重复序列基序的所选重复域家族。
DARPin的高水平和可溶性表达为了进一步分析，将如上所述在粗细胞提取ELISA中显示特异性VEGF-Axxx结合的所选克隆在大肠杆菌XLl-blue细胞中表达，并用标准方案利用其His-标签纯化。用25 ml静止过夜的培养物(LB，1%葡萄糖，100 mg/1氨苄青霉素；37°C )接种I I培养物(相同培养基)。在A (600) = O. 7时，用0.5 mM IPTG诱导培养物，并在37°C孵育4小时。将培养物离心，使所得沉淀再悬浮于40 ml TBS500 (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, pH 8)中并声处理。将溶胞物再离心，将甘油(10% (v/v)终浓度)和咪唑(20 mM终浓度)加入所得上清液中。将蛋白用N1-次氮基三乙酸柱(2.5 ml柱体积)根据制造商说明书(QIAgen， Germany)纯化。从I升大肠杆菌培养基中可纯化至多200 mg对VEGF-Axxx具有结合特异性的高度可溶性DARPin，如根据SDS-15% PAGE估计的纯度> 95%。这样纯化的DARPin用于进一步表征。
实施例2:在球状体长出测定中确定对VEGF-Axxx具有结合特异件的所诜DARPin mcsoii将VEGF-Axxx加至包埋在胶原基质的HUVEC球状体导致球状体发芽。加入VEGF-Axxx 抑制剂将阻断幼芽形成，这可通过幼芽的数量和长度在统计学上定量。通过加入不同浓度的抑制剂和定量VEGF，可确定IC5Q。
VEGF-Axxx特异性DARPin对球状体发芽的抑制 球状体长出测定根据标准方案进行(Korff等，在上述引文中)。如实施例1描述选择对VEGF-Axxx具有特异性的DARPin并纯化至> 96%纯度。使人脐静脉细胞在单层培养物中生长至汇合。在胰蛋白酶化后，将细胞混悬液呈悬滴放置以形成球状体，即约500个有组织聚集的HUVEC。将球状体包埋在胶原基质中，用VEGF-A165刺激以引发幼芽长出。另外加入发芽抑制剂以观察其对发芽抑制的效应。用绘图软件量化每个球状体的幼芽数和幼芽长度。
两种实例球状体发芽测定的结果显示于图2a (对VEGF-Axxx具有结合特异性的 DARPin #30)和图2b (DARPin NC,对VEGF-Axxx没有结合特异性的阴性对照DARPin;如 DARPin E3_5 (Binz等，2005，在上述引文中)。在本测定中表现最好的DARPin显示10 至50 pM的IC5tl值，而在平行实验中Avastin 、Lucentis 和Macugen 显不150至500 PM 的 IC50 值。
实施列3:通过表面等离子体共振分析确定与Avastin 比较的DARPin #27的革巴特异性将狗VEGF-A164或狗VEGF_A164b固定在流动池中，分析DARPin #27 (SEQ ID NO:1的重复域，对应于I至159位氨基酸)和Avastin 与固定祀标的相互作用。
表面等离子体共振(SPR)分析用 ProteOn 仪(BioRad)测量 SPR。工作缓冲液是 20 mM HEPES, pH 7.4，150 mM NaCl 和 O. 005% Tween 20。将约 1200 RU狗 VEGF-A164 或狗 VEGF_A164b 固定在 GLC 芯片(BioRad)上。测量相互作用缓冲液流以60 μ 1/min流动5分钟，用250 nM浓度的Avastin 或 DARPin #27注射100秒，用缓冲液流进行数分钟的解离速率测量。从测量值减去未包被参考池的信号。
结果显示于图3a (Avastin与狗VEGF-A164的相互作用)、图3b (Avastin与狗 VEGF-A164b的相互作用)、图3c (DARPin #27与狗VEGF-A164的相互作用)和图3d (DARPin #27与狗VEGF-A164b的相互作用)。虽然Avastin明显与两种固定的VEGF同种型相互作用，但DARPin #27显示只与VEGF-A164相互作用并不与VEGF_A164b相互作用。
实施例4:在血管渗漏兔樽型中DARPin #30抑制VEGF-A165的体内功效。
将聚乙二醇化DARPin #30 (对应于I至126位氨基酸的SEQ ID N0:4的重复域) 或Lucentis 通过玻璃体内注射应用于兔眼内，以试验它们抑制通过随后玻璃体内注射人 VEGF-A165诱发的血管渗漏的功效。
在兔中的血管渗漏抑制测量在第I天将PBS、聚乙二醇化DARPin #30 (125 μ g)或等摩尔量的Lucentis (162 Ug)通过玻璃体内注射应用于各兔的一个眼(被处理眼)内。在第4天或第30天通过玻璃体内注射500 ng人VEGF-A165攻击各兔的被处理眼。在VEGF-A165注射后48小时，通过在静脉内注射荧光素钠(50 mg/kg动物体重，10% ( 八)在0.9% (w/v)盐水溶液中) 后I小时测量所有眼的荧光素含量来评价所有动物的双眼。计算每只动物的被处理眼与未处理眼中荧光量的比率。比率为I相当于在被处理眼中不存在另外的荧光渗漏，比率大于 I提示在被处理眼的荧光渗漏多于未处理对照眼。
聚乙二醇化DARPin的制备通过使用单个Cys残基和马来酰亚胺化学使蛋白聚乙二醇化为本领域技术人员熟知，可根据建立的方案(如来自Pierce)进行。用标准层析方法将包含附加C-端接头 (GGGSGGGSC, SEQ ID NO:8)的DARPin #30纯化至接近均一。将蛋白用DTT完全还原，通过凝胶过滤纯化以除 去DTT，并用PBS更换缓冲液。将溶于PBS的PEG-马来酰亚胺(甲氧基-聚(乙二醇)_氧代丙基氨基-丙基马来酰亚胺；NOF，no. Sunbright ME-200MA)与 DARPin在PBS中，以约15%摩尔过量的PEG-马来酰亚胺在室温混合2_4小时。然后将聚乙二醇化DARPin通过用标准阴离子交换层析与非反应性DARPin和非反应性PEG部分分离。
结果显示于图4。聚乙二醇化DARPin #30和Lucentis 两者都能够在将它们通过玻璃体内注射施用后4天，保护兔眼免受VEGF-A165诱发的血管渗漏。但是，只有聚乙二醇化DARPin #30，而非Lucentis ，能够在玻璃体内注射后至多30天保护兔眼免受VEGF-A165 诱发的血管渗漏。
在其它实验中在玻璃体内注入兔眼后测量本发明不同结合蛋白的玻璃体内终末半衰期。使包含附加C-端接头(GGGSGGGSC, SEQ ID NO:8)的DARPin #30用各自来自NOF 的马来酰亚胺PEG (见实施例5)缀合至20 kDa和40 kDa非蛋白性PEG部分。确定了 DARPin #30、与 20 kDa PEG 部分缀合的 DARPin #30 和与 40 kDA PEG 部分缀合的 DARPin #30的终末半衰期为3. 5天(+/- O. 3天)、6.1天(+/-1. O天)和5. 4天(+/-0. 8天)。令人惊奇地是，非蛋白性PEG部分的分子量从20 kDa增加至40 kDa不导致终末半衰期增加。 在对应的实验中观察到相同趋势，所述实验中使用包含代替SEQ ID N0:4重复域的SEQ ID NO:1 (I至159位氨基酸)或SEQ ID NO:3 (I至126位氨基酸)重复域的结合蛋白。
实施例5:重组结合蛋白包含结合VEGF-Axxx的重复域和蛋白性聚合物部分的重组结合蛋白实例是SEQ ID NO:1和4。SEQ ID NO:1的重复域对应于I至159位氨基酸，SEQ ID NO:1的蛋白性聚合物部分对应于160至1’024位氨基酸。SEQ ID NO: 4的重复域对应于I至126位氨基酸，SEQ ID NO:4的蛋白性聚合物部分对应于127至536位氨基酸。
将SEQ ID NO:1和4的结合蛋白用本领域技术人员已知的标准技术在大肠杆菌细胞质中表达(见例如Qiagen (Germany))的pQE表达系统。将由表达载体额外编码的Met 残基有效地在大肠杆菌细胞质中从表达的多肽中切离，因为起始Met后接着小的Gly残基 (即SEQ ID NO:1和4的I位氨基酸)。溶解细胞(如通过使用弗氏细胞压碎器(French press))，将结合蛋白用本领域技术人员已知的标准层析技术从粗细胞提取物纯化至接近均一。
用SEQ ID No:2、3、5、6和7的重复蛋白制备了包含一个结合VEGF-Axxx的重复域和一个非蛋白性聚合物部分的重组结合蛋白实例。这些重复蛋白包含N-端重复域，接着是多肽接头和C-端Cys。各自的重复域对应于SEQ ID N0:2和7的I至159位氨基酸， 和SEQ ID N0:3至6的I至126位氨基酸。将SEQ ID NO:2、3、5、6和7的重复蛋白用本领域技术人员已知的标准技术在大肠杆菌的细胞质中表达(见例如Qiagen (Germany)的 Expressionist)。将由表达载体额外编码的Met残基有效地在大肠杆菌细胞质中从表达的多肽中切离，因为起始Met后接着小的Gly残基(即SEQ ID NO: 2、3、5、6和7的I位氨基酸)。溶解细胞(如通过使用弗氏细胞压碎器)，将结合蛋白用本领域技术人员已知的标准层析技术从粗细胞提取物纯化至接近均一。
然后将包含单个Cys残基的纯化重复蛋白用标准马来酰亚胺化学缀合至非蛋白性聚合物部分，如实施例4概述。由此，制备了本发明的结合蛋白，它包含SEQ ID N0:2重复蛋白和40 kDa非蛋白性PEG部分(如NOF的40 kDa马来酰亚胺-PEG ( a-[3-(3-马来酰亚氛基-1-氧代丙基)氛基]丙基-ω -甲氧基-聚氧乙稀)，广品号Sunbright ΜΕ-400ΜΑ), SEQ ID NO:3重复蛋白和20 kDa非蛋白性PEG部分(如NOF的20 kDa马来酰亚胺-PEG (α -[3- (3-马来酸亚氨基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω -甲氧基-聚氧乙烯)，广品号 Sunbright ΜΕ-200ΜΑ)，SEQ ID NO:5 重复蛋白和 12 kDa 非蛋白性 PEG 部分(如 NOF 的 12 kDa马来酰亚胺-PEG (α - [3-(3-马来酰亚氨基-1-氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯)，产品号Sunbright ME-120MA),SEQ ID N0:6重复蛋白和5 kDa非蛋白性PEG部分(如NOF的5 kDa马来酰亚胺-PEG ( α - [3_ (3_马来酰亚氨基_1_氧代丙基)氨基]丙基-ω-甲氧基-聚氧乙烯)，产品号Sunbright ΜΕ-050ΜΑ)，以及SEQ ID Ν0:7重复蛋白和2 kDa非蛋白性PEG部分(如NOF的2 kDa马来酰亚胺-PEG ( α - [3- (3-马来酰亚氨基_1_氧代丙基)氣基]丙基-ω -甲氧基-聚氧乙稀)，广品号Sunbright Μ