专利名称：T－细胞受体r可变阅读框架蛋白(TARP)及其应用的制作方法相关申请的引用本申请要求1999年7月13日申请的US临时申请No.60/143,560，以及1999年10月1日申请的US临时申请No.60/157,471的优先权。此两个申请的内容通过引用在此引入本文。关于联邦资助研究和发展的发明的权利的声明是不适用的。发明背景本发明涉及分子生物学以及医学诊断学和治疗学领域。前列腺癌是人类最普遍的一种癌症，是导致人的因癌症死亡的第三大原因。此种疾病的早期检测和治疗的方法将降低前列腺癌患者的死亡率。由恶性肿瘤细胞表达而其它细胞很少表达的肿瘤相关蛋白，可被用作靶来用于检测和干预。几种与前列腺癌相关的蛋白已被鉴定，包括前列腺特异性抗原(PSA)。免疫疗法是一种用于抵抗癌症的有效的新武器。免疫疗法包括基于其靶抗原的产生来激发抵抗癌细胞的免疫应答。当使用人抵抗癌细胞的免疫应答时，优选用于激发细胞介导的抵抗癌细胞的免疫应答。基于细胞介导的免疫应答的免疫疗法包括对产生特定的表位的细胞产生细胞介导的应答。癌细胞产生不同的可成为免疫治疗的靶的蛋白。某些癌产生新的蛋白，例如作为突变的结果，它们是免疫原性的。然而，研究者们也发现肿瘤浸润淋巴细胞可特异性地识别癌细胞的未突变蛋白。例如，Rosenberg等人已发现肿瘤浸润淋巴细胞靶向和识别正常黑素瘤细胞和恶性黑素瘤细胞均产生的蛋白MART-1的抗原决定基。此外，抗MART-1或其与MHC I类分子(具体的，HLA A2的抗原决定基)结合的肽的主动或被动免疫治疗导致产生MART-1的黑素瘤细胞以及正常细胞的破坏。Y.Kawakami等人，J.Immunol.21237(1998)。新的癌抗原被期望能激发免疫反应，因为免疫系统将识别其为异己蛋白。然而，因为免疫系统对自身蛋白具有耐受性，其激发抵抗非突变的自身蛋白的免疫应答的能力是令人吃惊的。人们确信这种免疫应答直接抵抗通常不以足够的量暴露于免疫系统的来激发耐受性或免疫应答的表位。然而在癌中，这些决定簇不再避开免疫系统的检测。这点可能由通过MHC I类分子对表位增加的提呈产生的。细胞介导的免疫应答涉及主要组织相容性复合物分子的活性。在人体中，复合物被称为“HLA”(“人白细胞抗原”)复合物。在小鼠中，其是指“H-2”复合物。主要组织相容性复合物包括3类蛋白，MHC I类、MHC II类和MHC III类。MHC I类分子几乎在所有有核细胞的表面上表达。其提呈抗原肽到Tc细胞(CD8+)。在人体中有3个MHC I类基因位点，HLA A，HLA B和HLA C。每一位点为高度多态的。因此，一个人在其细胞的表面可能有六种不同类型的HLA分子。MHC II类蛋白主要在抗原提呈细胞例如巨噬细胞、树突状细胞和B细胞上表达，其提呈被加工过的抗原肽到TH细胞。在人体中有3个MHC II类基因位点，HLA DP，HLA DQ和HLA DR。MHC III类蛋白与各种的免疫过程相关，包括可溶性血清蛋白，以及补体系统的组分和肿瘤坏死因子。J.Kuby，Chapter 9，IMMUNOLOGY，第三版W.H.Freeman and Company，New York(1997)。在癌细胞和正常细胞中，MHC I类分子将自身蛋白的表位提呈到Tc细胞。HLA A，HLA B和HLA C分子结合大约长为8到10氨基酸的具有特殊锚定残基的肽。HLA I类分子识别的锚定残基依赖于HLA分子的特定等位形式。CD8+T细胞带有能识别当被在细胞上的特定HLA分子提呈时细胞上的特异性表位的T细胞受体。当能被抗原提呈细胞刺激变为细胞毒性T淋巴细胞的Tc细胞接触带有HLA-肽复合物的细胞时，CTL与此细胞形成结合物并将其破坏。肽通过MHC I类分子的提呈包括内源产生的蛋白通过蛋白酶体裂解为肽，通过ER和高尔基体进行加工，通过肽的锚定残基结合到MHC I类分子的裂口以及最终提呈到细胞的表面。除其它因素外，依据特定的锚定残基，某些肽可更紧密的结合于特定的HLA分子。结合较好的肽指“显性”表位，而结合较差的肽成为“亚显性”或“阴性”表位，自身蛋白或外源蛋白的显性表位激发强烈的耐受性或免疫应答。亚显性或阴性的表位产生弱的或根本不产生免疫应答。假设显性表位与HLA分子的紧密结合导致它们在细胞表面密集提呈，产生更多的与免疫细胞反应的机会以及更多的激发免疫应答或耐受性的可能性。研究表明在自身蛋白MART-1蛋白存在的情况下，免疫系统产生最多的抵抗亚显性或阴性表位的CTL应答。Y.Kawakami等，1997Immunol.Res.16313。可能在癌细胞中亚显性或阴性表位比在正常细胞中提呈得密集或量更大；所以免疫系统遇见这些先前未检测到的表位时，将其识别为外源的并产生抵抗它们的免疫应答。无论什么原因，将免疫系统暴露于自身蛋白的大量的亚显性或阴性表位，作为一种激发免疫应答抵抗产生所述蛋白的细胞的方式是癌症免疫治疗的关键要素。当然，启动抗自身蛋白的免疫应答将对癌性细胞和健康细胞二者均产生破坏。因此，为使免疫治疗获得成功，健康细胞必须是维持生命不必需的或具有通过其它疗法可取代的功能。在前列腺癌和乳房癌中，通常的治疗手段是分别将前列腺或乳房手术切除。在此情况下，大多数或所有显示出前列腺或乳房抗原的组织将成为肿瘤细胞。发明概述我们已发现健康和癌性的上皮来源的前列腺细胞，转录未重排的TCRγ基因的一部分。而在体外，此转录产生两种蛋白，一种为TCRγ的截短形式，令人吃惊的是，我们的研究显示，在体内，表达的蛋白不是TCRγ蛋白，而是可变阅读框架表达的蛋白。相应地，此蛋白被称为TCRγ可变阅读框架蛋白或“TARP”。我们已经发现TARP在上皮来源的前列腺细胞和前列腺癌细胞中表达。令人吃惊的是，我们发现相同的蛋白表达在许多的乳房癌细胞中。TARP因此可作为前列腺癌和表达TARP(表达TARP的乳房癌)的乳房癌细胞的标记，并作为免疫治疗的基础。本发明提供了分离的或重组形式的核酸和蛋白。虽然我们已经发现此种蛋白在许多乳房癌细胞中被表达，因其被首先在前列腺细胞中鉴定，在下面通常被称为前列腺特异性(“PS”)—TCRγ。
在一方面，本发明提供了分离的含有TCRγ可变阅读框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽。本发明进一步提供了TARP的免疫原性片段(此片段可产生能特异性识别和结合于全长TARP的抗体或其激活识别表达TARP的细胞的T细胞)，与TARP至少有90％序列同一性且其被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽，以及，与TARP至少有90％序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复合物分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽。本发明进一步提供了组合物，其含有TARP，其免疫原性片段，或具有至少90％序列同一性且满足上述功能条件的肽，并含有可药用载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了分离的重组核酸分子，其编码具有TCRγ可变阅读框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，编码其免疫原性片段，编码与TARP至少有90％序列同一性且其被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽，或者，编码与TARP至少有90％序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括给药于个体一种组合物，该组合物选自分离的具有TCRγ可变阅读框架蛋白(“TARP”)的氨基酸序列的多肽，其免疫原性片段，与TARP至少有90％序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽，以及，与TARP至少有90％序列同一性且其当被加工并在主要组织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽。
本发明进一步提供了给药于个体一种组合物的方法，其中的组合物选自编码TARP、其免疫原性片段、与TARP至少有90％序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽、以及与TARP至少有90％序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽的分离的核酸。
本发明进一步提供了将组合物给药于个体的方法，其中的组合物含有用包含TARP表位的多肽刺激的抗原提呈细胞。另外，本发明提供了给药于个体一种组合物的方法，其中的组合物含有在体外被TARP、与TARP至少有90％序列同一性且被特异性识别TARP的抗体特异性识别的多肽、或者与TARP至少有90％序列同一性且当被加工并在主要组织相容性复合体分子体系中被提呈后激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞的多肽致敏的细胞。
上述方法中所述的组合物可被给药于患前列腺癌的个体，患乳房癌的个体，或未进行乳房癌诊断的雌性个体。
该方法还包括在体外致敏CD8+细胞使其对TARP蛋白的表位敏感并将这些致敏细胞给药于个体。CD8+细胞可为Tc细胞。在一些实施方案中，Tc细胞可为肿瘤浸润淋巴细胞。
此外，该方法可包括共同给药于个体免疫佐剂，其选自非特异性的免疫佐剂，亚细胞微生物产物和成分，半抗原，免疫原性蛋白，免疫调节剂，干扰素，胸腺激素和集落刺激因子。
该方法也进一步包括给药一种用含有TARP表位的多肽刺激的抗原提呈细胞，或给药编码含有TARP的表位的多肽的核酸序列，其中的核酸存在于重组病毒中。该方法进一步包括给药编码含有TARP蛋白的表位的多肽的核酸序列。
此外，该方法包括给药一种表达载体，其表达含有TARP蛋白的表位的多肽，其中表达载体存在于在重组细菌细胞中。进一步地，该方法包括用表达含有TARP蛋白表位的多肽的表达载体免疫个体，其中的表达载体包含在自体重组细胞中。
在另一方面，本发明提供了一种检测方法，在雄性中为检测上皮来源的前列腺细胞，雌性中为检测乳房癌细胞，包括检测细胞中的所述雄性或所述雌性的编码TARP的核酸转录本，或检测转录本的翻译所产生的TARP，因此在所述的雄性细胞中检测到所述的转录本或蛋白则该细胞为前列腺上皮细胞，而在所述雌性的细胞中检测到所述的蛋白或转录本则该细胞为乳房癌细胞。该方法可包括将来自所述细胞的RNA与在杂交条件下特异性杂交于转录本的核酸探针接触，并检测杂交。此外，该方法包括破坏细胞并使一部分细胞内容物与含有靶向部分和可检测标记的嵌合分子接触，其中的靶向部分特异性地结合于所述的蛋白，检测结合于蛋白的标记。靶向部分本身也可被标记(例如，抗体如scFv可具有放射性残基)。
被检测的细胞可取自淋巴结，或乳房活组织。
最后，本发明提供了特异性结合于TCRγ可变阅读框架蛋白的表位的抗体。
附图的简要描述附

图1.PS-TCRγ转录本的核苷酸序列(SEQ ID NO13)。在体外翻译系统中，此转录本产生两种多肽。第一种多肽具有推导的氨基酸序列，开始于MQM...(″PS-TCRγ-1″，现在称为″TARP，″SEQ ID NO14)。据估计此多肽的分子量为7.2 kD。其由与自然TCRγ阅读框架不一致的阅读框架翻译。第二种多肽具有开始为MKT…的推导氨基酸序列(″PS-TCRγ-2″，SEQ ID NO15)。据预测，其分子重为13 kD。其由与TCRγ相同的阅读框架翻译且表现为TCRγ的截短形式。图中的单下划线表示转录起始位点和多聚腺苷酸位点。
附图2.TCRγ mRNA表达的杂交分析。附图2A)多种组织的点杂交印迹显示人TCRγ的不同的表达。阳性组织为前列腺(C7)，小肠(E3)，脾(E4)，胸腺(E5)，外周白细胞(E6)，淋巴结(E7)，骨髓(E8)以及肺(F2)。附图2B，Northern印迹显示正常组织中TCRγ转录本的大小。在前列腺中表达的TCRγ转录本为1.1kb和2.8kb，而在脾脏、胸腺和外周白细胞中的主要转录本为1.5 kb。底片被曝光20小时。
附图3.TCRγδ表达的Northern印迹分析。附图3A)TCRγ恒定区(TCR Cγ)cDNA探针显示了1.1和2.8kb前列腺特异性转录本(与附图2B比较)。底片被曝光20小时。附图3B)TCRδ恒定区(TCR Cδ)cDNA探针显示TCRδ mRNA不在前列腺中表达，而在脾脏、胸腺和外周白细胞中表达。底片被曝光50小时。附图3C)TCR Cγ cDNA探针表明LNCaP细胞系表达TCRγ而PC-3细胞系不表达。底片被曝光20小时。人β-肌动蛋白mRNA的表达被分析作为对照。
附图4.石蜡包埋的组织通过TCRγ(Cγ1-3′UTR)反义、35S-标记探针进行的原位杂交。左边照片来自暗视野显微镜检查而相应的右边的照片来自明视野显微镜检查。暗视野照片中所示的明亮颗粒是RNA杂交信号。4A)来自67岁男性的前列腺组织显示了阳性的腺泡上皮细胞和阴性基质细胞，(5倍放大)。4B)4A的明视野。4C)高度放大(40x)，显示在右下角的阳性区。4D)4C的明视野。4E)肾组织显示没有RNA杂交，(5倍放大)。4F)4E的明视野。
附图5.LNCaP mRNA的引物延伸。在TCRγ恒定区(从Cγ1的5’末端开始的75个核苷酸)逆转引退火。逆转录本终止于大约128核苷酸处，用箭头表示，其表明转录本在Cγ1的上游大约53核苷酸处启始。含有LNCaP的TCRγ逆转录本的泳道被曝光72小时而标记泳道被曝光8小时。
附图6.前列腺TCRγ转录本。其图示了前列腺是如何被转录和剪接的。转录本包括Jγ1.2片段，Cγ1的3个外显子，接着是非翻译序列。
附图7.前列腺TCRγ的体外转录偶联的翻译分析。两个大约为8和13 kDa的蛋白被获得(泳道1)。使用空载体的阴性对照反应(泳道)没有产生任何的蛋白产物。
附图8.用于PS-TCRγ转录分析的引物(SEQ ID NOs1-12)。
附图9.前列腺特异性TCRγ转录本体外翻译的分析。前列腺特异性TCRγ转录本在体外编码两种蛋白。35S-Met体外标记的翻译蛋白被置于16.5％Tris-Tricene凝胶上进行跑胶并通过放射自显影法进行分析。所用突变构建体的图示分析被显示在右边。空白框代表第一阅读框架且可能的启动密码子用粗体表示，第二阅读框架用阴影框表示且可能的启动密码子用斜体表示，“X”表示一个ATG密码子突变为ATA。以kDa表示的大小标志被显示于顶部。
附图10.TARP为前列腺中表达的核蛋白。获自LNCaP细胞、PC3细胞或前列腺肿瘤样本(癌)的蛋白提取物的Western印迹。20μg的每种蛋白提取物被置于16.5％Tris-Tricene凝胶上电泳且用抗TARP(上图)或TCRγ(下图)的抗体进行探测。作为阳性对照，1μg的His-标记的TARP(上图)或100ng的His-标记的TCRγ(下图)被置于凝胶上电泳(重组)。以kDa表示的大小标志被显示于左边。(B)LNCaP细胞的细胞质部分(细胞质)，膜部分(膜)以及核部分(核)的Western印迹。每一部分40g被置于16.5％Tris-Tricene凝胶上电泳且用抗TARP的抗体进行探测。作为阳性对照，1μg His-标记的TARP被置于凝胶上跑胶(重组)。以kDa表示的分子大小被显示于左边。
附图11.TARP mRNA在乳房癌细胞中的表达。(A)用TARP(上图)或肌动蛋白(下图)特异的引物对获自下列细胞系的RNA进行RT-PCR前列腺(LNCaP和PC3)，成神经细胞瘤(A172)，结肠(COLO205)，胃(KATO III)以及乳房(MCF7，BT-474，Hs57Bst，SK-BR-3，CRL-1897和MDA-468)。没有模板的RT-PCR反应被显示为dH2O。(B)用TARP(上图)或肌动蛋白(下图)特异的引物对获自12个人乳房癌组织样本的cDNA(1-12泳道)进行PCR。没有模板的PCR反应被显示为dH2O。对于两个图，20％的PCR产物被置于1％琼脂糖凝胶上进行电泳且用溴化乙锭染色进行显影。
附图12.在乳房细胞系中发现的TARP转录本与前列腺特异形式的相同。(A)TCRγ座位的图示以及TARP如何在前列腺细胞中被转录和剪接。用于在图B中RT-PCR分析的引物被显示了出来。(B)TARPmRNA表达的RT-PCR分析。利用获自前列腺细胞系(LNCaP和PC3)和乳房细胞系(MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst)的cDNA，并利用引物1和3(上图)，TARP引物2和3(中图)或肌动蛋白引物(下图)进行PCR反应。进行没有模板的RT-PCR，并显示为dH2O。20％的PCR产物被置于1％的琼脂糖凝胶上进行电泳并用溴化乙锭染色观察。(C)TARP转录本的Northern印迹分析。获自前列腺细胞系(LNCaP和PC3)和乳房细胞系(MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst)的2ugpoly(A)mRNA利用恒定区片段作为探针进行分析。24小时曝光产生放射自显影(上图)。用人β-肌动蛋白RNA探针在同一滤膜上产生条带并进行分析以校验证明相同的上样量。曝光1小时产生放射自显影(下图)。表示核苷酸大小的RNA大小标志被显示左边。
附图13.TARP存在于乳房癌细胞的核中。(A)对获自LNCaP，MCF7，BT-474，SK-BR-3和Hs578Bst细胞的核提取物进行Western印迹分析。40μg的每种核提取物被置于16.5％的Tris-Tricene凝胶上电泳并用抗TARP(上图)或TCRγ(下图)的抗体进行探测。作为阳性对照，1μg的His-标记的TARP(His-TARP)和100ng的His-标记的TCRγ(His-TCRγ)在凝胶上跑电泳。大小标志以kDa为单位显示在左侧。
附图14.TARP的可能的功能区。(A)TARP含有一个可能的亮氨酸拉链基元和磷酸化位点。可能的亮氨酸拉链基元用亮氨酸加框表示，其后的碱性区加下划线。cAMP-和cGMP-依赖的蛋白激酶磷酸化位点(氨基酸46-49和55-58)以及蛋白激酶C磷酸化位点(氨基酸19-21和20-22)用空心轮廓表示。(B)TARP与Tupl的蛋白序列比较。TARP(42-57)，Dictyostelium dicoideum Tupl(dTupl，521-536)以及Saccharomyces cerevisiae Tupl(yTupl，626-660)的氨基酸序列被显示。保守的残基被加框。
本发明的详述I介绍令人惊讶地，人们已发现上皮来源的前列腺细胞以及很多乳房癌细胞表达T细胞受体γ链(″TCRγ″)的mRNA。前列腺中的主要TCRγ转录本与T淋巴细胞中表达的大小不同。前列腺上皮细胞和很多乳房癌高水平表达被认为仅在T淋巴细胞中表达的基因的转录本的发现是出乎意料的。
因为TCRγ阅读框架含有很好的Kozak序列(Kozak，M.Cell 44283-92(1986))，我们最初设想截短的TCRγ蛋白被编码。因此，另一个意外的发现是在上皮前列腺细胞和乳房癌细胞中表达的TCRγ座位编码一个7Kda的核蛋白。因为该蛋白是由不同于TCRγ的阅读框架所编码的，我们将其命名为TCRγ可变阅读框架蛋白，缩写为″TARP″。除了在TCRγ座位的一个内含子中转录本来源的可变的阅读框架被翻译外，TARP具有另外两种独特的特征。首先，意外地在细胞中发现这样的一个小肽，因为大多数是分泌型。另外，TARP缺少很好的Kozak序列。体外和体内应用在前列腺上皮细胞、前列腺癌细胞以及很多乳房癌的细胞中该种蛋白的存在为体内和体外的应用创造了大量的机会。首先抗该种蛋白的抗体能被用于体外测试来检测样品中表达TARP细胞的存在。例如下面描述的实施例中，在正常的乳房细胞中不存在TARP和TARP转录本，或者低水平存在，但是，在表达TARP的乳房癌细胞很容易被检测到。在从个体取出的乳房细胞中检测到高水平的TARP转录本或TARP，将表明个体存在表达TARP的乳房癌。鉴于前列腺细胞中TARP的表达，本领域的技术人员意识到在进行性前列腺癌中去除前列腺是一种常见的手术干预。从一个已去除前列腺的个体的细胞中检测到TARP则表明存在前列腺癌。(本领域的技术人员将意识到每年大约有1,000男人被诊断出患有乳房癌。因此，病人单一的患有乳房癌不是不可能的。假定事实上男性的前列腺癌患者超过正常人的200倍，且所关注的患者已被发现患有前列腺癌，则病人单独患乳房癌的可能性很小。诊断可通过取样位点的一些信息被证实，其中样品被进行组织学和细胞形态学以及其它常规诊断标准的研究。在任一情况中，由于任一病征的存在需要进一步的鉴定和监测，检测到TARP表达细胞存在于前列腺已被切除的男性中是非常有用的，不管该个体是否已患上前列腺癌，乳房癌，或二者。在没有前列腺癌的男性中检测到TARP表达细胞是乳房癌的一个指标。)TARP本身，TARP的免疫原性片段，以及编码TARP或其免疫原性片段的核酸也可被用于在体外激活来自个体的细胞毒性T淋巴细胞(″CTL″)，在灌输给所述个体后用以攻击前列腺癌和表达TARP的乳房癌。
可将TARP本身、TARP的免疫原性片段、编码TARP或其免疫原性片段的核酸分子通常与可药用载体一起对个体给药，以刺激产生或加强对前列腺癌或表达TARP的乳房癌的免疫应答。对已被确诊患有前列腺癌或表达TARP的乳房癌的个体可治疗性地给药这一类的组合物。
如下所讨论的，TARP是一种具有调控转录的蛋白结构特征的核蛋白。人们预料细胞中TARP水平的调节将影响细胞的生长，细胞的复制，或二者。因此，TARP水平的调节在控制癌细胞的入侵方面可能是很重要的。细胞中的TARP的水平可以通过不同的减少RNA转录本被翻译为蛋白例如核酶和反义分子的形式来降低。细胞中TARP的水平也可被增加。例如，含有编码TARP的核酸的表达载体，由强组成型启动子驱动，其可被导入到细胞中。核酸的组成型转录导致蛋白在细胞中高水平的表达。
此部分的余下内容描述了TARP的不同结构特征。接下来描述的是本文所用术语的定义，然后是有关TARP的免疫原性片段的选择、TARP对个体的给药、抗TARP抗体的形成、TARP转录本和蛋白的检测以及药物组合物的讨论。TARP的结构特征TARP在七体重复中含有五个亮氨酸，此表明TARP含有亮氨酸拉链二聚基元(附图7A)。所以TARP必定含有一个两亲螺旋。一种表明TARP可含有一个两性螺旋的迹象是丝氨酸和脯氨酸残基(这些残基被认为是螺旋启始位置的残基)被发现紧挨在第一个亮氨酸重复的前面。第二，很多的带电氨基酸被发现在七体重复中，因此螺旋有两性特性且可能充当与其它螺旋的盐桥。尽管亮氨酸在七体重复中的存在是亮氨酸拉链基元的指示，有些被鉴定在七体重复中含有5个亮氨酸的蛋白并没被认为是亮氨酸拉链蛋白。例如，亲核素(karyopherin)的晶体结构(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999))，B.sterarothermophilus嘧啶核苷酸磷酸化酶(Pugmire，M.J.等，Structure 61467-1479(1998))以及T.thermophilus苯丙氨酰tRNA合成酶(Mosyak，L.等，Nat.Struct.Biol.2537-547(1995))表明这些蛋白在含有五个亮氨酸的七体重复序列中不含有α-螺旋结构。需要用相互作用和结构研究来测定在TARP中发现的亮氨酸重复的意义。
TARP氨基酸序列另一个独特的特征是碱性氨基酸的区域紧接着可能的亮氨酸拉链基元(附图7A)，此表明其可能的DNA结合基元。然而，其中碱性区域的方向是非常独特的，其紧接着亮氨酸重复而不是在其前面。大多数结合DNA的亮氨酸拉链蛋白在亮氨酸重复前面具有碱性区域(参见(Chook，Y.M.等，Nature 399230-237(1999)))。TARP的碱性区域可能仅仅充当核定位信号，但TARP是一种核蛋白的事实加强了TARP可结合DNA的假说。
为了检测TARP是否与任意已知的蛋白具有同源性，我们在GenBank中进行了蛋白BLAST检索。此检索显示TARP的氨基酸序列与Dictyostelium dicoideum Tupl(GenBank登录号AAC29438)以及Saccharomyces cerevisiae Tupl(Williams，F.E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990))(附图7C)有一些同源性。酵母Tupl通常在Cyc8(Ssn6)复合体发现且是被葡萄糖、氧和DNA损害所调控的基因的转录抑制所需要的(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。Cyc8(Ssn6)和Tupl都不结合DNA，但是它们通过特异性DNA结合蛋白例如α2、Migl、Roxl和al作为共抑制剂复合物的一个部分而发挥作用(Tzamarias，D.等，Genes Dev.9821-831(1995))。Tup1的C′-末端部分含有富含天门冬氨酸和色氨酸的43个氨基酸序列的6个重复，已知为WD-40或β-转导素重复子(Williams，F.E.等，Mol.Cell.Biol.106500-6511(1990)；Fong，H.K.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832162-2166(1986))。WD-40重复子已在很多蛋白中被鉴定出，在蛋白-蛋白的相互作用中起作用。值得注意的是，Tupl已被显示通过2个WD-40重复子与α2相互作用(Komachi，K.等，Genes Dev.82857-2867(1994))。令人感兴趣的是TARP与Tupl的第5个WD-40重复子具有同源性(附图7C)。因为TARP是一种核蛋白，其与Tupl同源则表明TARP是一种涉及转录调控的功能性核蛋白复合物的成员。
TARP抗体识别前列腺和乳房核提取物的双重物质(附图6A)。最快的7 kDa条带与His-TARP重组蛋白共移动，而最弱的条带为较大分子量。对于9kDa条带的一个可能解释则是存在翻译后修饰。为了确定TARP是否含有任意已知的翻译后修饰的位点，我们利用PROSITE程序分析TARP氨基酸序列，其中的PROSITE程序来自Swiss Institute of Bioinformatics ExPASy proteomics server(http//www.expasy.ch)(Appel，R.D.等，Trends Biochem.Sci.19248-260(1994)；Hofmann，K.等，Nucleic Acids Res.27215-219(1999))。如附图7A所示，许多可能的磷酸化作用位点被发现，包括cAMP和cGMP-依赖性蛋白激酶磷酸化位点(RRAT和RRGT)以及蛋白激酶C磷酸化位点(SSR和SRR)。已在很多例子中表明在SDS PAGE凝胶上磷酸化作用引起蛋白显示出较大分子量。如果也是这种情况，附图6的结果表明未修饰的形式在LNCaP细胞中是普遍的，而且仅仅磷酸化形式存在于MCF7和SK-BR-3细胞中。因此，TARP可能在前列腺和乳房癌细胞中表达后进行了翻译后-修饰。
我们最初的对TARP转录本的研究没有揭示TARP在乳房中表达(Essand，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 969287-9292(1999))。一种可能的解释是TARP在正常乳房中表达的水平很低，因此是很难被检测的。如在结果部分中所述的，与癌样品中检测到的强烈信号相比，在正常乳房样品的PCR分析中检测到非常弱的信号。因此，TARP在乳房癌细胞中的存在可表明在乳房细胞致癌转化后TARP被诱导表达。此外，TARP在乳房癌细胞中的存在表明TARP被雌激素所调控。在TARP的内含启动子中鉴定出的使雄激素应答元件(ARE)与雌激素应答元件(ERE)结合的元件加强了这一假说。此杂交元件含有两个半-位点，其在5’末端对ARE特异，在3’末端对ERE特异[(Zilliacus，J.等，Mol.Endocrinol.9389-400(1995))以及未公开的数据]]。另外需要进行一些实验来检测是否雌激素调控TARP。然而有一些例子，其中的突变体ARE引起某些前列腺特异性基因在乳房肿瘤中表达。例如，前列腺特异性抗原(PSA)已被显示在乳房肿瘤中表达(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。PSA异常表达的分子分析使得发现了在PSA启动子中发现的ARE中的单一位点突变。据信，该突变导致雄激素调控的PSA在乳房瘤中表达的丧失(Majumdar，S.等，Br.J.Cancer 791594-1602(1999))。此时是否在3个被检测的乳房细胞系中在TARP启动子中发生了类似的突变仍不得而知。
前列腺依据雄激素来维持其结构和功能。当前列腺细胞变为恶性细胞时，其失去了雄激素依赖性。在此研究中，我们使用两种对用于生长的雄激素具有不同依赖性的前列腺细胞系LNCaP和PC3细胞。雄激素受体存在于雄激素依赖的LNCaP细胞系中，但不存在于雄激素非依赖性的PC3细胞系中(Tilley，W.D.等，Cancer Res.505382-5386(1990))。如附图3所示，TARP在LNCaP细胞而不在PC3细胞中表达。此结果表明TARP表达可通过雄激素刺激来调控。TARP启动子中的ARE样元件的鉴定加强了TARP被雄激素诱导的观点。在LNCaP细胞而不在PC3细胞中表达表明TARP在调控雄激素依赖的应答中是重要的II.名词定义除非另有定义，此处所用的技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。下面引用的文献提供了本发明所用的很多术语的基本定义Singleton等，微生物学和分子生物学词典(DICTIONARY OFMICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY)(第二版，1994)；剑桥科技词典(THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE ANDTECHNOLOGY)(Walker ed.，1988)；遗传学专业词典(THEGLOSSARY OF GENETICS)，第5版.，R.Rieger等(编辑)，SpringerVerlag(1991)；和Hale & Marham，HARPER COLLINS生物学词典(THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY)(1991)。如此处所述的，下面的术语除非另有说明，其具有上述词典中的含义。
″T细胞受体″是指在含有一个α链和一个β链或一个γ链和一个δ链的T细胞表面发现的杂二聚体。T细胞受体识别与MHC分子结合的抗原。
″T-细胞受体γ可变阅读框架蛋白″和″TARP″是指一种多肽，其序列如例如附图14所描述的。此多肽由T细胞受体γ基因翻译而来，所述基因转录本存在于上皮来源的前列腺细胞中，前列腺癌细胞中，以及在很多乳房癌中。由于″TARP″中的最后一个缩写字母代表单词″蛋白″，所以″TARP蛋白″是多余的。
此处所用的从其可翻译成TARP的核酸转录本是指″TARP核酸″或″编码TARP的核酸″，从中转录TARP的基因在此处是指″TARP基因。″如此处所用的，TARP的″免疫原性片段″是指TARP的一部分，当其在主要组织相容性复合物分子体系中被细胞提呈后，可以在T细胞活化测定中，激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。尽管较长的片段也可被使用，典型地，此种片段为TARP的8到12个连续氨基酸。
在上下文中将一个与另一个多肽比较时，“序列同一性”通过比较作为参考序列的TARP序列与一个受试序列而被测定。典型地，两个序列进行最大和最佳比对。
″配体″是指一种特异性与靶分子结合的化合物。
″受体″是特异性与配体结合的化合物。
″细胞毒素T淋巴细胞″(″CTL″)在对肿瘤细胞的免疫应答中是重要的。CTL识别被在几乎所有有核细胞的细胞表面表达的HLA I类分子提呈的肽的表位。
已知肿瘤特异性辅助T淋巴细胞(″HTL″)对维持有效的抗肿瘤免疫时是很重要的。其在抗肿瘤免疫中的作用也已在动物模型中被证明，其中这些细胞不仅为CTL的诱导和抗体应答提供帮助，而且提供效应器功能，该功能通过直接细胞接触和通过淋巴因子(例如IFNγ和IFN-α)的分泌来介导。
″抗体″是指特异性识别和结合表位(例如，抗原)的至少含有轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体。包括完整的免疫球蛋白和变体和本领域已知的它们的部分例如Fab′片段，F(ab)′2片段，单链Fv蛋白(″scFv″)，以及二硫化物稳定的Fv蛋白(″dsFv″)。scFv蛋白是一种融合蛋白，其免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合。天然的免疫球蛋白由免疫球蛋白基因编码。包括κ和λ轻链恒定区基因，α、γ、δ、ε和μ重链恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。术语″抗体″包括多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体和人源化抗体，通过免疫产生的，从杂交瘤产生的，或重组的。
″表位″或″抗原决定基″是指B和/或T细胞对其产生应答的抗原上的位点。表位可由抗原上的连续氨基酸形成或由非相邻氨基酸通过蛋白质的三级折叠形成。由连续氨基酸形成的表位典型地在变性溶剂中可保留而由非邻接氨基酸形成的表位典型地在用变性溶剂的处理中会丢失。一个表位典型地在独特空间构象中包括至少3个，和通常更多，至少5个或8-10个氨基酸。测定表位的空间构象的方法包括，例如，x-光衍射以及两维核磁共振。参见，例如.，分子生物学方法，Vol.66，Glenn E.Morris，Ed(1996)中的表位绘图手册(Epitope MappingProctocols in Methods in Molecular Biology)。
当配体或受体进行结合反应时，配体或受体“特异性地结合于”某一化合物，即“待分析物”，该结合是待分析物在异质化合物样品中存在的决定因素。因此，配体或受体优选与特定的待分析物结合且不结合样品中的有效量的其它物质。例如，多核苷酸特异性地结合于含有一个互补序列的待分析多核苷酸而抗体在免疫测定条件下特异地与含有抗体所针对的表位的抗原待分析物结合。
″免疫测定″是指检测样品中待分析物的方法，其中待分析物的特异性是抗体和配体之间的特异性结合所赋予的。包括通过抗体和配体之间的特异性结合来检测抗体待分析物。参见Harlow和Lane(1988)抗体，实验室手册，冷泉港出版社，New York，描述了可被用来检测特异性免疫活性的免疫测定形式和条件。
″疫苗″是指含有有效赋予生物体仅引起较低发病率和致死率的生物免疫治疗水平的药剂或组合物。当然，制备疫苗的方法在免疫系统的的研究并预防和治疗动物和人类疾病方面是有用的。
“免疫有效量”是有效地在个体中引起免疫应答的量″多肽″是指由氨基酸残基、相关的天然存在的其结构变体和合成的通过肽键连接的非天然存在的类似物、相关的天然存在的结构变体，以及合成的非天然产生的类似物组成的聚合物。合成多肽可被例如利用自动多肽合成仪来合成。术语“蛋白质”典型地是指大的多肽。术语“肽”典型地是指短的多肽。
在此使用常规的符号来描述多肽序列多肽序列的左手端为氨基末端，多肽序列的右手端为羧基末端″融合蛋白″是指由两个或多个多肽通过肽键连接形成的多肽，其中的肽键是由一个多肽的氨基末端和另一个多肽的羧基末端形成的。融合蛋白可典型地被表达为单一连续的融合蛋白的核酸序列所编码。然而，融合蛋白也可由组成型多肽的化学偶联来形成。
″保守替代″是指多肽中的氨基酸用功能类似的氨基酸来替代。下列6组中均包括作为另一个氨基酸保守替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天门冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；
5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
两个蛋白如存在于不同的种中且具有共同的遗传祖先和70％的氨基酸序列同一性则彼此是″同源物″。
″大体上纯的″或″分离的″是指目的物质是主要存在的物质(例如，以摩尔计算，在组合物中比其它任意的大分子物质含量更多)，而基本上纯化的部分是一种其中含有在所有存在的大分子物质中至少50％(以摩尔计算)为目的物质的组分。通常，大体上纯的组分是指组分中的大约80％到90％或以上的大分子物质是纯化的目的物质。如果组分主要含有一种单一的大分子物质，则目的物质被纯化到基本上同质(通过常规的检测方法在组分中检测不到污染物)。为了定义，溶剂、小分子(＜500道尔顿)、稳定剂(例如，BSA)，以及元素离子在此不被认为是大分子。
″核酸″是指由通过磷酸二酯键连接的核苷酸(核糖核苷酸，脱氧核糖核苷酸，其相关的天然存在的结构变体，及合成的非天然存在的其类似物)单元、相关的天然存在的其结构变体及合成的非天然存在的其类似物组成的聚合物。因此，此术语包括核苷酸聚合物，其中的核苷酸及其之间的键，包括非天然存在的合成类似物，例如(但不限制于)，硫代磷酸酯，氨基磷酸酯，甲基磷酸盐，手性-甲基磷酸盐，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核酸(PNA)，等等。此种多核苷酸可以利用例如自动DNA合成仪来合成。术语“寡核苷酸”典型地是指短的多核苷酸，通常不长于50个核苷酸。当通过DNA来表示核苷酸序列时(例如，A，T，G，C)，可以理解的是其也包括RNA序列(例如，A，U，G，C)，其中的″U″替代″T″。
此处所用的描述核苷酸序列的常规表示是单链核苷酸的左手边为5’末端；双链核苷酸序列的左手方向作为5’方向。产生RNA转录本的核苷酸5’到3’的增加的方向作为转录的方向。与mRNA具有相同序列的DNA链被称为“编码链”；与转录自DNA的mRNA具有相同序列的且位于RNA转录本的5’末端的5’的DNA链的序列为″上游序列″；与转录自DNA的mRNA具有相同序列的且位于编码RNA转录本的3’末端的3’的DNA链的序列为″下游序列″；″cDNA″是指互补于或等同于mRNA的DNA，其为单链或双链的形式。
″编码″是例如基因、cDNA或mRNA充当模板来合成其它聚合物的多核苷酸和在生物学的过程中具有所定义的核苷酸序列(例如，rRNA，tRNA和mRNA)或所定义的氨基酸序列大分子中的特定核苷酸序列固有的特性以及由其产生的生物学特性。因此，如果由基因产生的mRNA的转录和翻译在细胞或其它的生物系统中产生蛋白质则此基因编码了蛋白。基因或cDNA的编码链(等同于mRNA序列且通常被显示在序列表中的核苷酸序列)，以及被用作转录模板的非编码链可被称为编码蛋白或基因或cDNA的其它产物。除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有的编码相同氨基酸序列的核苷酸序列简并形式。编码蛋白的核苷酸序列和RNA可包括内含子。
″重组核酸″是指具有非天然连接在一起的核苷酸序列的核酸。其包括含有扩增的或装配的可用于转化合适宿主细胞的核酸的核酸载体。含有重组核酸的宿主细胞称为“重组宿主细胞”。然后基因在重组宿主中表达来产生，例如，“重组多肽”。重组核酸也可行使非编码的功能(例如，启动子，复制区，核糖体结合位点等)。
″表达调控序列″是指多核苷酸中的调控与其可操作地连接的核苷酸序列的表达(转录和/或翻译)的核苷酸序列。“可操作地连接”是指两个部分的功能关系，其中一个部分的活性(例如，调控转录的能力)是另一个部分作用的结果(例如，序列的转录)。表达调控序列可包括，例如，用于举例而并非限制，启动子的序列(例如，诱导型的或组成型的)，增强子，转录终止子，起始密码子(例如，ATG)，内含子的剪接信号，以及终止密码子。
″表达盒″是指含有与可表达的核苷酸序列可操作相连的表达调控序列的重组核酸构建体。表达盒通常含有足够用于表达的顺式作用元件，其它用于表达的元件可由宿主细胞或体外表达系统提供。
″表达载体″是指含有一个表达盒的载体。表达载体包括所有本领域已知的载体，例如，粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)以及包含表达盒的病毒。
如果多核苷酸的序列是与其序列是第二序列的多核苷酸特异地杂交的第一序列，则相对于第二序列，第一序列是“反义序列”。
用于描述两个或多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的关系的术语包括″参考序列″，″选自″，″对比窗″，″同一性″，″序列同一性的百分比″，″基本上相同″，″互补″和″基本互补″。
为了核酸序列的序列比较，典型地，一个序列充当参考序列，来与待测序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，指定亚序列坐标系，如果需要，还要设定序列算法程序的参数。使用默认的程序参数。序列比较的比对方法是本领域公知的。可进行序列比较的最佳比对通过如下方法进行例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)的同源性比对算法，Pearson&Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444(1988)的相似性检索法，这些算法的计算机处理(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过人工比对和肉眼检察(参见，例如现代分子生物学手册(Current Proctocols in Molecular Biology)(Ausubel等编辑，1995增补本))。
一个有用算法的例子是PILEUP。PILEUP利用Feng & Doolittle，J.Mol.Evol.35351-360(1987)的改进比对法的简化方法。该方法类似于Higgins & Sharp，CABIOS 5151-153(1989)所描述的方法。利用PILEUP，比较参考序列与其它的测试序列来测定序列同一性的百分比，使用下面的参数默认缺口权值(3.00)，默认缺口长度权值(0.10)，以及加权的末端缺口。PILEUP可从GCG序列分析软件包中获得，例如，7.0版本(Devereaux等，Nuc.Acids Res.12387-395(1984)。
另一个适于测定百分序列同一性和相似性的算法的例子是BLAST和BLAST 2.0算法，其被描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)和Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1977))中。进行BLAST分析的软件可通过国家生物工程信息中心(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。BLASTN程序(用于核苷酸程序)使用默认的字节长(W)为11，校验值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，和两个链的比较。BLASTP程序(用于氨基酸序列)使用默认的字节(W)长为3，期望值(E)为10，以及BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915(1989))。
″严格杂交条件″是指50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS在42℃下温育或5×SSC和1％SDS 65℃下温育，并用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗涤。
″自然产生的″这一术语，对研究对象而言是指研究对象可在自然中找到。例如，可从天然源中分离得到并没有经过人在实验室中进行的有意的改造的存在于生物体(包括病毒)中的氨基酸或核苷酸序列。就可称其为“天然产生的”。
“接头”是指通过共价键或离子键、范德华力或氢键将两个分子连接在一起的分子，例如，与一互补序列在5’末端杂交并与另一互补序列在3’末端杂交的核酸分子由此将两个非互补的序列连接起来。
“药物组合物”是指适于在哺乳动物中使用的组合物。药物组合物含有药学有效量的活性剂及可药用载体。
“药学有效量的”是能产生所希望的药学结果的有效药剂的量。
“可药用载体”是指任何标准的药物载体、缓冲剂和赋形剂如磷酸盐缓冲液、5％葡萄糖水溶液、乳液如油/水乳液或水/油乳液和各种类型的湿润剂和/或佐剂。合适的药物载体和制剂被描述于Remington’sPharmaceutical Sciences，第19版，Mack Publishing Co.，Easton，1995中。优选的药物载体取决于所希望的活性药物的给药方式。给药的典型方式包括肠内(例如，口服)或肠胃外(例如，皮下、肌肉内、静脉内或腹膜内注射)或局部、经皮或经粘膜给药。“可药用盐”是可配制成可药用化合物的盐，例如，金属盐(钠、钾、镁、钙盐等)，以及铵或有机胺的盐。
用于诊断或治疗的″个体″是人或非人的哺乳动物。
组合物的″给药″是指通过一个选择的途径将组合物导入到个体中，例如，如果所选的途径是静脉内施用，则组合物被通过导入组合物到个体的血管中来给药。
″治疗″是指预防性治疗或治疗性治疗。
″预防性″治疗是给药于没有显示疾病症状或显示早期症状的个体来减少病症发展的危险。
″治疗性″治疗是一种给药于表现出病症的个体进行的治疗，目的是减小或消除这些症状。
″诊断″是指鉴定病症状况的存在或特性。诊断的方法根据其敏感性和特异性而不同。诊断方法的“敏感性”是指进行试验呈阳性的患病个体的百分数(真阳性的百分数)。诊断方法的“特异性”是指1减去假阳性率，其中的假阳性率是指那些试验呈阳性但是却没有患病的比例。而一种特定的诊断方法有可能不能提供出一种病况的确定性诊断，如果该方法提供了有助于诊断的阳性显示，其就足够了。
″预诊″是指对一种病症可能性进展(例如，严重性)的预测。III.TARP本发明提供分离的重组的TARP。因为我们首先发现了分离的前列腺特异性TCRγ转录本，我们最初使用术语“PS-TCRγ蛋白”和“PS-TCRγ多肽”来代表能够从约1.1kb PS-TCRγ转录本开始的任何阅读框架中翻译的任何多肽。具体地讲，该术语是指两种在体外翻译系统中翻译的蛋白PS-TCRγ-1(SEQ ID NO14)和PS-TCRγ-2(SEQ IDNO15)。我们现在已知道只有这些阅读框架的第一个在前列腺细胞中被翻译。因为这个阅读框架不是产生TCRγ链的阅读框架，该蛋白目前被称为“T细胞受体可变阅读框架蛋白”。全长TARP是一个58氨基酸的蛋白，其序列被描述于SEQ ID NO14和附图14中。
在某些的实施方案中，本发明提供了含有包含从TARP的至少5到至少15个保守氨基酸的表位的多肽。这样的蛋白与抗全长TARP的抗体结合(在此部分，除非上下文的其它需要，“TARP”是指全长蛋白)。其它的实施方案中，本发明提供了含有第一和第二多肽部分的融合蛋白，其中一个蛋白部分含有被鉴定为TARP表位的至少5个氨基酸的氨基酸序列。在一个实施方案中，TARP部分是指TARP的全部或基本上全部的TARP。另外一部分可以是一个例如免疫原性蛋白。这样的融合子也可以被用于激发抗TARP的免疫反应。在本发明其它的实施方案中提供了TARP样肽(“TARP类似物”)，其氨基酸序列至少90％相同于TARP(虽然它们可能具有相对于TARP91％，92％，93％，94％，95％，或更高的序列同一性)且其被与TARP特异性结合的抗体特异性地结合。在其它实施方案中，本发明提供了TARP样肽(有时此处也称为“TARP类似物”)，其氨基酸序列至少90％相同于TARP(虽然它们可能具有相对于TARP 91％，92％，93％，94％，95％，或更高的序列同一性)且激活T淋巴细胞抵抗表达TARP的细胞。这样的蛋白也可用作免疫原以阻断对PS-TCRγ蛋白的耐受。
在另一个实施方案中，所述多肽含有结合于MHC分子例如HLA分子或DR分子的表位。这些分子结合于具有由大约8或9个氨基酸所间隔的校正锚氨基酸的多肽。这些肽可通过检测TARP的氨基酸序列或者通过本领域技术人员所公知的有关MHC结合基元的知识进行鉴定。
TARP、其免疫原性片段和TARP类似物，可被重组合成。TARP的免疫原性片段和TARP自身的58个残基也可通过常规的方法化学合成。如果需要，多肽也可通过已有技术来化学合成。一种这样的方法被描述于W.Lu等，Federation of European Biochemical SocietiesLetters.42931-35(1998)。IV.TARP核酸本发明的一个方面提供了含有编码TARP多肽的核苷酸序列的分离的重组核酸分子(参见，例如附图14)。该核酸可被用于表达TARP，然后所表达的TARP可被用于例如产生用于治疗目的的抗体。如上所述，该核酸分子具有3个阅读框架，每一个编码由不同可读框所定义的多肽。
在此处所述的实施方案中，目的阅读框架就是编码TARP的阅读框架。
如上所述，两个阅读框架在体外翻译系统中被翻译。获自LNCaPcDNA的约1.1 kb PS-TCRγ转录本(SEQ ID NO13)的核苷酸序列和当转录本在核苷酸位置74(PS-TCRγ-1，SEQ ID NO14)以及核苷酸位置247(PS-TCRγ-2，SEQ ID NO15)的起始密码子开始被翻译的推导的氨基酸序列被描述在附图1中。转录的起始点(加下划线)在Jγ1.2区段的前10个核苷酸内。序列的数据可获自EMBL/GenBank/DDBJ，其登录号为AF151103。应说明的是现在已证实真正的″+1″位置是附图1所示的序列的第6个核苷酸。
研究者可以利用这个序列制备PCR引物，用于分离本发明的核苷酸序列。LNCaP细胞是约1.1 kb转录本序列cDNA的有用的来源。来自尚未进行TCRγ基因重排的人细胞(例如，除了T-淋巴细胞前体之外的细胞)的基因组DNA，可用作在转录后被加工成为约1.1 kb转录本的长序列。该序列可利用公知技术被修饰成为一个编码本发明相关分子的核酸。
含有本发明序列的核酸分子可用体外的方法被克隆或扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)，连接酶链式反应(LCR)，以转录为基础的扩增系统(TAS)，自我维持的序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)。例如，编码所述蛋白的多核苷酸可利用以该分子的DNA序列为基础的引物通过cDNA的聚合酶链式反应被分离。
众多的克隆和体外扩增方法是本领域技术人员所公知的。PCR方法被描述在，例如，U.S.专利.No.4,683,195；Mullis等(1987)ColdSpring Harbor Symp.Quant.Biol.51263；和Erlich，ed.，PCRTECHNOLOGY，(Stockton Press，NY，1989)。多核苷酸也可通过在严格杂交条件下用选自目的多核苷酸序列的探针筛选基因组或cDNA文库进行分离。
核酸的工程化形式可通过编码所述蛋白的多核苷酸的定点诱变来进行，或通过加入0.1mM MnCl2和不平衡浓度的核苷酸增加PCR反应中原始多核苷酸中错误率导致的随机突变来进行。1.表达载体本发明也提供了用于表达由TARP转录本编码的多肽的表达载体。表达载体可通过包含用于转录和mRNA的翻译的适宜的启动子、复制序列、标记物等来使其适用于真核和原核表达系统。表达载体的构建和在转染细胞中基因的表达涉及本领域公知的分子克隆技术的应用。Sambrook等，MOLECULAR CLONING--A LABORATORYMANUAL，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，(1989)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F.M.Ausubel等编辑，(Current Protocols，a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.以及John Wiley & Sons，Inc.)。用于这样目的的有用启动子包括金属硫蛋白启动子，组成型腺病毒主要后期启动子，地塞米松诱导型MMTV启动子，SV40启动子，MRP polIII启动子，组成型MPSV启动子，四环素诱导型CMV启动子(例如，人早早期CMV启动子)，以及组成型CMV启动子。用于基因治疗的质粒可能包括其它的功能元件，例如可选择的标记、鉴别区和其它的基因。
用于本发明的表达载体依赖于其目的用途。当然这样的表达载体必须含有与宿主细胞相容的表达和复制信号。用于表达生物活性结合物的表达载体包括病毒载体，例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，质粒载体，粘粒，等等。病毒和质粒载体优选转染哺乳动物细胞。其中表达控制序列含有CMV启动子的表达载体pcDNA1(Invitrogen，SanDiego，CA)，提供了较好的转染和表达率。腺相关病毒载体在本发明中适用于基因治疗的方法。
很多的方法适用于将多核苷酸传递到细胞，包括，例如由细胞从溶液中直接摄取分子，通过脂质转染法(例如脂质体或免疫脂质体)协助摄取，颗粒介导的转染，以及从具有可操作连接于编码抑制性多核苷酸的核苷酸序列的表达调控序列的表达盒进行胞内表达。参见U.S.专利5,272,065(Inouye等)；酶学方法，vol.185，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(D.V.Goeddel，ed.)(1990)或M.Krieger，GENETRANSFER AND EXPRESSION-A LABORATORY MANUAL，Stockton出版社，New York，NY，(1990)。虽然通过体外化学合成法制备短的寡核苷酸更经济，重组DNA表达质粒也被用于制备本发明的多核苷酸，用于通过除基因治疗以外的方法进行传递。
构建体也可以含有一个标记物从而简化蛋白的分离程序。例如，一个多组氨酸标记，例如，六个组氨酸残基可在蛋白的氨基末端被引入。多组氨酸标志使得蛋白仅通过镍-螯合层析法一步即可提取。2.重组细胞本发明也提供了含有用于表达本发明核苷酸序列的表达载体的重组细胞。可选择高水平表达的宿主细胞来纯化蛋白。细胞可以是原核生物细胞，例如E.coli，或真核细胞。有用的真核细胞包括酵母和哺乳动物细胞。该细胞可以是例如，在培养物中的重组细胞或体内细胞。
表达TARP的细胞适用于使个体抵抗表达这些肽的细胞的主动或被动免疫。在特定的实施方案中，这些细胞是细菌细胞。在主动免疫的情况下，重组细胞是个体的自身固有的细胞，其可以与HLA分子联合提呈多肽。例如抗原提呈细胞就适用于该目的。在此情况下，其优选利用“自身固有的细胞”，也即这些细胞来源于个体。这样的细胞是MHC相容性的。编码TARP的核苷酸序列在这样的细胞中应该被一个组成型启动子控制，因为一个目的就是在细胞表面表达高密度的蛋白，优选的，表达比健康前列腺上皮细胞具有更大密度的多肽。V.激发抗表达TARP细胞的细胞介导的免疫反应的方法TARP由上皮来源的前列腺癌细胞和很多乳房癌细胞表达。因此，TARP可被用作干预治疗前列腺癌和表达TARP的乳房癌的靶，也可被用作分别从前列腺或乳房转移的癌细胞的标志物。本发明提供了免疫治疗学的方法用于治疗前列腺癌和表达TARP的乳房癌。本发明涉及对个体进行免疫，使之抗TARP，即激发抗表达TARP细胞的细胞介导的免疫反应。免疫可以是主动的或被动的。在主动免疫中，免疫反应在个体体内被激发。在被动免疫中，被激活的抗多肽的Tc细胞在体外培养并给药于个体。预料这样的方法导致表达TARP的健康上皮前列腺组织被破坏。然而，前列腺并非重要的器官，其损伤必然抵消个体由于前列腺癌导致的寿命的减少，且前列腺实际上可在建立TARP免疫治疗前通过外科手术去除。因为正常的乳房组织尚未发现表达大量的TARP，抗表达TARP细胞的免疫反应并未表现出导致女性正常细胞的损伤。因此TARP组合物可预防给药于女性来提供免疫，防止表达TARP的乳房癌发育到后期。
免疫剂可以是全长的TARP，含有TARP的抗原决定基的肽，例如，TARP的免疫原性片段，或基本上等同于TARP的蛋白或肽。当激发抗TARP的细胞介导的免疫反应时含有抗原决定基的优选肽是带有个体的HLA分子的结合基元的肽。这些基元是本领域公知的。例如HLA-A2是人类的一个普遍的等位基因。此分子的结合包括具有在第二位具有亮氨酸或甲硫氨酸且在最后位置为缬氨酸或亮氨酸的9或10个氨基酸的多肽。基于TARP的多肽序列，可鉴定含有任意特定的HLA分子的基元的氨基酸序列。可通过任一典型的方法(例如，重组法，化学法，等等)制备含有这些基元的肽。因为TARP是一种自身蛋白，优选的含有HLA结合基元的氨基酸序列为那些编码亚显性的或阴性的表位的氨基酸序列。这些表位可通过HLA分子的与分子中的其它表位相比的较低的结合亲合力或与其它的结合于HLA分子的分子比较来鉴定。
含有来自包括HLA结合基元的TARP的氨基酸序列的多肽也适用于激发免疫应答。在一定程定上，因为，这样的蛋白将被细胞加工为可结合于HLA分子且具有TARP表位的肽。
HLA分子和肽抗原的复合物充当被HLA限制性T细胞识别的配体(Buus，S.等，Cell 471071，1986；Babbitt，B.P.等，Nature 317359，1985；Townsend，A.和Bodmer，H.，Annu.Rev.Immunol.7601，1989；Germain，R.N.，Annu.Rev.Immunol.11403，1993)。通过单氨基酸替代的抗原类似物的研究和内源结合的自然加工的肽的测序，与特异性结合于HLA抗原分子所必需的基元相对应的关键残基已被鉴定(参见，例如.，Southwood，等，J.Immunol.1603363，1998；Rammensee，等，Immunogenetics 41178，1995；Rammensee等，Sette，A.和Sidney，J.Curr.Opin.Immunol.10478，1998；Engelhard，V.H.，Curr.Opin.Immunol.613，1994；Sette，A.和Grey，H.M.，Curr.Opin.Immunol.479，1992)。
此外，HLA-肽复合物的x-射线晶体学分析显示在HLA分子的肽结合性裂口中的口袋(蛋白质的立体结构)以等位基因的方式容纳通过肽配体含有的残基；这些残基反过来决定了含有这些残基的肽与HLA结合的能力。(参见，例如.，Madden，D.R.Annu.Rev.Immunol.13587，1995；Smith，等，Immunity 4203，1996；Fremont等，Immunity 8305，1998；Stern等，Structure 2245，1994；Jones，E.Y.Curr.Opin.Immunol.975，1997；Brown，J.H.等，Nature 36433，1993)。
相应地，I类和II类等位基因特异性的HLA结合基元或I类和II类超级基元的定义，涵盖具有结合特定的HLA分子的可能性的TARP的区域。
与TARP有高度序列同一性的分子对于激发免疫反应也是有用的。此种分子可以被免疫系统识别为“外源的”，产生抗体或与TARP发生交叉反应的CTL。与TARP具有高度序列同一性的分子包括非人源的TCRγ同源物，特别是来自灵长目的。氨基酸序列至少与TARP有90％(虽然其可为91％，92％，93％，94％，95％，或甚至与TARP有更高的序列同一性)相同且其特异性地结合于与TARP特异性结合的抗体的TARP类似物可以被使用。此外，在此方面被认为有用的还有TARP类似物，也即，其氨基酸序列与TARP至少90％(虽然其可为91％，92％，93％，94％，95％，或甚至与TARP有更高的序列同一性)相同且激活T-淋巴细胞使之抵抗表达TARP的细胞的肽。
另一个与TARP抗原决定基基本上同源的分子可通过修饰天然TARP表位的序列使其以较大的亲合力结合于HLA分子来制备。
鉴定编码抗原决定基的基因的方法如下获自患有转移性癌症的个体的TIL被培养并测试其在体外识别自体固有癌的能力。将这些TIL给药到个体中以识别导致肿瘤消退的TIL。这些TIL被用于筛选表达被TIL识别的表位的基因的表达文库。然后用这些基因免疫个体。可选择地，在体外致敏淋巴细胞来抵抗这些基因编码的抗原，然后致敏的淋巴细胞被转移到个体体内并测试其导致肿瘤消退的能力。Rosenberg，等，(1997)Immunol.Today 1997 18175。
这些分子的应用现在已被描述。这些方法也被描述在Rosenberg等.(1997)Immunol.Today 18175和Restifo等.(1999)Oncology 1150。
一种引起免疫应答的方法包括单独地用含有来自TARP的抗原决定基的多肽免疫个体，或者更优选地与佐剂结合，例如弗氏不完全佐剂，类脂或脂质体，gp96，Hsp70或Hsp90。多肽可以为TARP，TARP的抗原片段，含有抗原决定基的融合蛋白，或含有与这样的抗原决定基大体上相同的序列的肽。
另一个方法包括将含有来自TARP的表位的肽结合到抗原提呈细胞上并将细胞给药于个体。
在另一个方法中，将在表达盒中含有编码具有来自TARP抗原决定基的多肽的核酸序列的重组病毒给药于个体。所述病毒选择性地也可编码细胞因子(例如，IL-2)、共刺激分子或其它的增强免疫应答的基因。病毒可以是，例如，腺病毒、鸟痘病毒或牛痘病毒。通过感染，感染的细胞将表达TARP肽并在与具有和抗原决定基相同基元的肽结合的HLA分子结合的情况下在细胞表面表达表位。这些细胞然后激活能识别被提呈的抗原的CTL，导致含有决定基的癌细胞的破坏。
在另一个方法中，通过，例如，肌内、biolistic注射或与脂类连接，个体用编码含有来自TARP的抗原决定基的多肽的裸DNA致免疫。此方法显示产生了对细胞介导的抵抗表达所述编码多肽的细胞的应答的刺激。
在另一种方法中，表达表位的重组细菌例如Bacillus Calmette-Guerin(BCG)，Salmonella或Listera给药于个体，可选择地，重组细菌也编码细胞因子、共刺激分子或其它增强免疫应答的基因。
在另一种方法中，表达抗原的细胞被给药于个体。包括，例如，用TARP表位刺激的树突状细胞，用含有TARP抗原决定基的多肽、HLA和B7基因转染的细胞。多重转染导致产生了一些对于将抗原决定基提呈到细胞表面上所必需的几个组分。在一个实施方案中，分子为一种融合蛋白，含有抗原决定基的多肽被融合于HLA分子(通常通过接头)来提高肽与HLA分子的结合。在一个实施方案中，细胞为抗原提呈细胞。优选的，细胞为真核细胞，较优选的为哺乳动物细胞，更优选的为人细胞，最优选的为获自所述个体的自体固有的人细胞。
在另一种方法中，抗原提呈细胞(APC)在体外被刺激或与含有来自TARP的表位的肽共温育。这些细胞被用于致敏CD8细胞，如来自前列腺癌肿瘤或外周血淋巴细胞的肿瘤浸润淋巴细胞。TIL或PBL优选来自所述个体。然而，它们至少为在个体具有的HLA型所限制的MHC I类细胞。这些致敏细胞然后给药于个体。
在补充的方法中，任意的这些免疫疗法通过给药细胞因子被加强，例如IL-2，IL-3，IL-6，IL-10，IL-12，IL-15，GM-CSF，干扰素。
除了上述评价肽的免疫原性的方法外，免疫原性也可以通过评价来自正常个体的初级T细胞培养物来进行(参见，例如，Wentworth，P.A.等，Mol.Immunol.32603，1995；Celis，E.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 912105，1994；Tsai，V.等，J.Immunol.1581796，1997；Kawashima，I.等，Human Immunol.591，1998)； 通过HLA转基因鼠的免疫来进行(参见，例如，Wentworth，P.A.等，J.Immunol.2697，1996；Wentworth，P.A.等，Int.Immunol.8651，1996；Alexander，J.等，J.Immunol.1594753，1997)，以及通过证实已被有效接种或具有肿瘤的患者的记忆T细胞应答来进行(参见，例如，Rehermann，B.等，J.Exp.Med.1811047，1995；Doolan，D.L.等，Immunity 797，1997；Bertoni，R.等，J.Clin.Invest.100503，1997；Threlkeld，S.C.等，J.Immunol.1591648，1997；Diepolder，H.M.等，J.Virol.716011，1997)。
在选择用于疫苗组合物的CTL诱导性目的肽时，与I类HLA分子有较高结合力的肽是优选的。肽的结合被通过测试候选肽与纯化的HLA分子在体外结合的能力来进行评价。
为确保TARP类似物当用作疫苗时能在体内引起CTL对TARP的应答(或者，为II