专利名称：含有羧肽酶u抑制剂和凝血酶抑制剂的药物制剂的制作方法血液凝固是参与止血(即防止血液从被损伤血管流失)和血栓形成(即血管被血块病理性阻塞)的关键过程。凝固是多级酶反应的结果，其中最终步骤之一是酶原凝血酶原转化为活性酶凝血酶。凝血酶在血液凝固中起核心作用。它激活血小板，使纤维蛋白原转化为纤维蛋白单聚体，其自发聚合成丝状，并且活化凝血因子XIII，凝血因子XIII又转过来交联该聚合物成为不溶性血纤蛋白。凝血酶在一个正反馈反应中进一步激活凝血因子V和凝血因子VIII。因此，期望凝血酶的抑制剂通过抑制血小板、血纤蛋白形成和血纤蛋白稳定化来有效抗凝血。通过抑制正反馈机制，期望它们能够在一连串的导致凝血和血栓形成的事件早期发挥抑制作用。血纤蛋白溶解是一连串的酶促反应的结果，使血纤蛋白在纤溶酶的作用下降解。纤溶酶原的激活是血纤蛋白溶解中的核心过程。在纤溶酶原活化剂、组织型纤溶酶原(t-PA)或尿激酶型纤溶酶原活化剂(u-PA)的作用下纤溶酶原完成裂解生成纤溶酶。血纤蛋白的初始纤溶酶降解产生羧基末端的赖氨酸残基，其作为纤溶酶原的高亲和性结合位点。由于与血纤蛋白结合的纤溶酶原比游离纤溶酶原更容易激活纤溶酶，因此这种机制提供血纤蛋白溶解的正反馈调节。一种血纤蛋白溶解的内源性抑制剂是CPU。CPU也被称作血浆羧肽酶B、活化凝血酶可激活血纤蛋白溶解抑制剂(TAFIa)、羧肽酶R和可诱导羧肽酶的活性。CPU是由其前体羧肽酶原U(proCPU)在蛋白水解酶如凝血酶、凝血酶-血栓调节蛋白复合物或纤溶酶的作用下形成。CPU裂解血纤蛋白片段的羧基末端处的碱性氨基酸。脱去羧基末端的赖氨酸且由此失去纤溶酶原的赖氨酸结合位点随后实现抑制血纤蛋白溶解。发明概述本发明涉及含有与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的药物制剂，以及一种治疗的方法和所述制剂在治疗其中需要或期望CPU抑制和/或凝血酶抑制的疾病中的应用。本发明进一步涉及一种多部分的容器的试剂盒，其中含有CPU抑制剂和凝血酶抑制剂以及对需要它的患者施用该抑制剂的说明书。本发明还涉及一种多个部分的制剂的试剂盒，其中含有各自与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的CPU抑制剂和凝血酶抑制剂。发明详述令人惊奇地发现，与分别应用CPU和凝血酶抑制剂相比，本发明包括一种具有加强抗血栓效果的CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的联合形式，由此减少哺乳动物的血液和组织中血栓形成和凝固性过高的危险。此外，本发明提出施用较低剂量的上述活性成分，由此降低凝血酶抑制剂的潜在副作用的危险性。
在一个方面中，由此本发明涉及药物组合物，其含有(i)羧肽酶U的抑制剂或其可药用盐，和(ii)凝血酶抑制剂或其衍生物，其与可药用辅剂、稀释剂或载体混合。
本发明的另一方面涉及一个多部分的试剂盒，其包括(i)含有羧肽酶U抑制剂或其可药用盐的容器；(ii)含有凝血酶抑制剂或其衍生物的容器；和给需要它的患者顺序、分开或同时施用抑制剂(i)和(ii)的说明书。
本发明的另一方面涉及多部分的试剂盒，其包括(i)含有与可药用辅剂、稀释剂或载体相混合的羧肽酶U抑制剂或其可药用盐的药物制剂；和(ii)含有与可药用辅剂、稀释剂或载体相混合的凝血酶抑制剂或其衍生物的药物制剂；其抑制剂(i)和(ii)分别以适合与另一抑制剂联合给药的形式提供。
对于“联合给药”，我们包括各个含有CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的制剂在有关病症的治疗过程中顺序、分开和/或同时给药，所述的病症可以是急性或慢性疾病。优选地，该术语包括两种制剂在足够接近的时间内(任选地重复给药)给药以对患者产生有益效果，这种在有关疾病的治疗过程中的效果高于在其它制剂不存在条件下在相同治疗过程中如果单独施用(任选地重复)这两种制剂中任何一种的效果。联合形式是否在有关的特定疾病和在特定疾病的治疗过程中提供较高有益效果的测定将取决于被治疗或预防的疾病，但所属领域普通技术人员按照常规方式可以获得。
所以，术语“联合”包括两种制剂的一种或另一种制剂可以在另外的组分给药之前、之后和/或同时给药(任选地重复)。当在本文中使用时，术语“同时给药”和“同时地给药”包括在彼此相隔48小时内如24小时内给药CPU抑制剂和凝血酶抑制剂。
按照本发明的另一方面，提供一种制备本文定义的多个部分的试剂盒的方法，该方法包括将如上定义的组成部分(a)与如上定义的组成部分(b)结合在一起，由此使两种组成部分适合彼此联合给药。
将包括组分(a)和(b)的两种组成部分联合可(i)作为分开的制剂提供(即相互独立)，其随后在联合疗法中彼此结合在一起；或(ii)作为“复合包装”的独立组成部分包装并且一起提供，用于在联合疗法中彼此结合。
本发明的再另一方面涉及治疗患有或易感染其中需要或期望凝血酶抑制和/或羧肽酶U抑制的疾病的患者的方法，该方法包括给该患者施用治疗有效总量的(i)与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的羧肽酶U的抑制剂或其可药用盐与(ii)与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的凝血酶抑制剂或其衍生物联合。
本发明的另一方面涉及治疗患有或易感染其中需要或期望凝血酶抑制和/或羧肽酶U抑制的疾病的患者的方法，该方法包括给该患者施用一种药物制剂，其中含有与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的(i)羧肽酶U的抑制剂或其可药用盐，和(ii)凝血酶抑制剂或其衍生物。
本发明的另一方面涉及所述药物制剂在制备用于治疗其中需要或期望凝血酶抑制和/或羧肽酶U抑制的疾病的药物中的应用，该制剂含有与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的(i)羧肽酶U的抑制剂或其可药用盐，和(ii)凝血酶抑制剂或其衍生物。
为了避免质疑，本文所用的术语“治疗”包括治疗和/或预防性处理。CPU抑制剂本申请涉及的CPU的抑制剂包括分子量小于约1000、适宜小于700的低分子量羧肽酶抑制剂。
在本申请中，CPU抑制剂优选(i)通式I的化合物 或其可药用盐或其溶剂化物，或所述盐的溶剂化物，其中R1表示C1-C6烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；或芳基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R2表示H、酰基、酰氨基、烷基、烷基氨基甲酰基、烷硫基、烷氧基、芳酰基、芳酰基氨基、芳氧基、芳硫基、脒基、氨基、芳基、氨基甲酰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂环基、羟基、氧代、硝基、巯基、Z2N-CO-O-、ZO-CO-NZ-或Z2N-CO-NZ-基团，R3表示COOR5、SO(OR5)、SO3R5、P＝O(OR5)2、B(OR5)2、P＝OR5(OR5)或四唑，或任何羧酸电子等排物，R4表示SH、S-CO-C1-C6烷基或S-CO-芳基，R5表示H、C1-C6烷基或芳基，R6表示H或C1-C6烷基，X表示O、S、SO、SO2、C(Z)2、N(Z)、NR6SO2、SO2NR6、NR6CO或CONR6，Y表示C(Z)2，Z独立地表示H、C1-C6烷基、芳基、环烷基或杂环基，或(ii)通式II的化合物 或其可药用盐或其溶剂化物，或所述盐的溶剂化物，其中R7表示C1-C6烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；或芳基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R8表示H、酰基、酰氨基、烷基、烷基氨基甲酰基、烷硫基、烷氧基、芳酰基、芳酰基氨基、芳氧基、芳硫基、脒基、氨基、芳基、氨基甲酰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂环基、羟基、氧代、硝基、巯基、Z2N-CO-O-、ZO-CO-NZ-或ZN-CO-NZ-基团，R9表示COOR11、SO(OR11)、SO3R11、P＝O(OR11)2、B(OR11)2、P＝OR11(OR11)或四唑，或任何羧酸电子等排物，R10表示 -基团，或 基团，或 基团，R11表示H、C1-C6烷基或芳基，R12表示C1-C6烷基、芳基、环烷基、杂环基或任选N取代的H2N-C(Z)-CONH-C(Z)-或H2N-C(Z)-基团，R13表示H或C1-C6烷基，X表示O、S、SO、SO2、C(Z)2、N(Z)、NR13SO2、SO2NR13、NR13CO或CONR13，Y表示O、N(Z)、S、C(Z)2或单键，Z独立地表示H、C1-C6烷基、芳基、环烷基或杂环基，条件是当X表示O、S、SO、SO2、N(Z)、NR7SO2、SO2NR7或NR7CO时，Y表示C(Z)2或单键。
更优选的CPU抑制剂包括通式I的化合物、其可药用盐或其溶剂化物、或所述盐的溶剂化物，其中下面各个和独立的优选采用R1表示环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；或芳基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R2表示H、酰基、酰氨基、烷基、烷基氨基甲酰基、烷硫基、烷氧基、芳酰基、芳酰基氨基、芳氧基、芳硫基、脒基、氨基、芳基、氨基甲酰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂环基、羟基、氧代、硝基、巯基、Z2N-CO-O-、ZO-CO-NZ-或Z2N-CO-NZ-基团，R3表示COOR5，R4表示SH、S-CO-C1-C6烷基或S-CO-芳基，R5表示H、C1-C6烷基或芳基，R6表示H或C1-C6烷基，X表示O、S、SO、SO2、C(Z)2、N(Z)、NR6SO2、SO2NR6或CONR6，Y表示C(Z)2，Z独立地表示H、C1-C6烷基、芳基、环烷基或杂环基。
甚至更优选的CPU抑制剂包括通式I的化合物或其可药用盐，其中下面各个和独立的优选采用R1表示环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R2表示H、C1-C3烷基、氨基、卤素或羟基，R3表示COOR5，R4表示SH、S-CO-C1-C6烷基或S-CO-芳基，R5表示H、C1-C6烷基或芳基，X表示C(Z)2，Y表示C(Z)2，Z独立地表示H或C1-C6烷基。
更加优选的CPU抑制剂包括通式II的化合物、其可药用盐或其溶剂化物或所述盐的溶剂化物，其中下面各个和独立的优选采用R7表示，C1-C6烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；或芳基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R8表示H、酰基、酰氨基、烷基、烷基氨基甲酰基、烷硫基、烷氧基、芳酰基、芳酰基氨基、芳氧基、芳硫基、脒基、氨基、芳基、氨基甲酰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂环基、羟基、氧代、硝基、巯基、Z2N-CO-O-、ZO-CO-NZ-或Z2N-CO-NZ-基，R9表示COOR11，R10表示 -基团，或 基团，或 基团，R11表示H、C1-C6烷基或芳基，R12表示C1-C6烷基、芳基、环烷基、杂环基或任选N取代的H2N-C(Z)-CONH-C(Z)-或H2N-C(Z)-基团，R13表示H或C1-C6烷基，X表示C(Z)2，Y表示O、N(Z)、S、C(Z)2或单键，Z独立地表示H、C1-C6烷基、芳基、环烷基或杂环基。
甚至更加优选的CPU抑制剂包括通式II的化合物、其可药用盐或其溶剂化物、或所述盐的溶剂化物，其中下面各个和独立的优选采用R7表示，环烷基，被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；杂环基，含有至少一个氮原子；杂环基，含有至少一个选自S或O的杂原子，并且被一个或多个碱性基团如氨基、脒基和/或胍基取代；R8表示H、C1-C3烷基、氨基、卤素、羟基，R9表示COO11，R10表示 R11表示H、C1-C6烷基或芳基，R12表示C1-C6烷基、芳基、环烷基、杂环基或任选N取代的H2N-C(Z)-CONH-C(Z)-或H2N-C(Z)-基团，X表示C(Z)2，Y表示O或C(Z)2，Z独立地表示H或C1-C6烷基。
下列定义应该适用于整个说明书和所附权利要求书术语“碱性基团”表示碱性的基团，其中该碱性基团的共轭酸具有约-5至约25，优选1至15的pKa。
术语“羧酸(电子)等排物”表示pKa为约-5至约25，优选1至15的酸性基团。
术语“C1-C6烷基”表示直链或支链、饱和或不饱和、取代和未取代的链中具有1-6个碳原子的烷基，其中所述的烷基可以被一个或多个选自O、N或S的杂原子任选中断。该烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、正丙基、异丙基、丙烯基、异丙烯基、丙炔基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、丁烯基、异丁烯基、丁炔基和直链和支链戊基和己基。
术语“C1-C3烷基”代表直链或支链、饱和或不饱和、取代或未取代的链中具有1-3个碳原子的烷基，其中该烷基可以任选地被一个或多个选自O、N或S的杂原子中断。该烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、乙烯基、乙炔基、正丙基、异丙基、丙烯基、异丙烯基、丙炔基。
术语“C1烷基”代表取代或未取代的具有1个碳原子的烷基。该烷基的实例包括但不限于甲基。
术语“C1-C6烷氧基”代表烷基-O-基，其中C1-C6烷基定义如上。
术语“C1-C3烷氧基”代表烷基-O-基，其中C1-C3烷基定义如上。
术语“杂环基”代表取代或未取代的、4-至10-元单环或多环环系，其中在一个或多个环中一个或多个原子是除碳以外的元素，例如氮、氧或硫，尤其是4-、5-或6-元芳族或脂肪族杂环基团；并且包括但不限于氮杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、吡咯烷、二氧杂环戊烷、oxathiolane、噁唑烷(oxazolane)、噁唑、噻唑、咪唑、咪唑啉、咪唑烷、吡唑、吡唑啉、吡唑烷、异噁唑、异噻唑、噁二唑、呋咱、三唑、噻二唑、吡喃、吡啶、哌啶、二噁烷、吗啉、二噻烷、氧硫杂环己烷、硫代吗啉、哒嗪、嘧啶、吡嗪、哌嗪、三嗪、噻二嗪、二噻嗪、氮杂吲哚、氮杂二氢吲哚、吲哚、二氢吲哚、萘啶基，而且应理解还包括上述基团的所有异构体。术语“氮杂环丁烷”例如应理解为包括2-和3-异构体，术语“吡啶基”和“哌啶基”例如应理解为包括2-、3-和4-异构体。
术语“环烷基”表示饱和或不饱和、取代或未取代、由3、4、5、6或7个碳原子组成的非芳族环，其包括但不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，环丁烯基，环戊烯基，环己烯基，环庚烯基，环戊二烯基，环己二烯基和环庚二烯基，术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
术语“芳基”代表取代或未取代的C6-C14芳香烃，并且包括但不限于苯基、萘基、茚基、antracenyl、fenantrenyl和芴基。
术语“芳氧基”代表芳基-O-基团，其中芳基定义如上。
术语“酰基”代表烷基-CO-基团，其中烷基定义如上。
术语“芳酰基”代表芳基-CO-基团，其中芳基定义如上。
术语“烷硫基”代表烷基-S-基团，其中烷基定义如上。
术语“芳硫基”代表芳基-S-基团，其中芳基定义如上。
术语“芳酰基氨基”代表芳酰基-N(Z)-基团，其中芳酰基和Z定义如上。
术语“酰氨基”代表酰基-N(Z)-基团，其中酰基和Z定义如上。
术语“氨基甲酰基”代表H2N-CO-基团。
术语“烷基氨基甲酰基”代表Z2N-CO-基团，其中Z定义如上。
术语“取代”表示上面定义的“C1烷基”、“C1-C3烷基”、“C1-C6烷基”、“环烷基”、“杂环基”、“芳基”H2N-C(Z)-CONH-C(Z)-或H2N-C(Z)-基团被一个或多个酰基、酰氨基、烷基、烷基氨基甲酰基、烷硫基、烷氧基、芳酰基、芳酰基氨基、芳氧基、芳硫基、脒基、氨基、芳基、氨基甲酰基、羧基、氰基、环烷基、甲酰基、胍基、卤素、杂环基、羟基、氧代、硝基、巯基、硫基、Z2N-CO-O-、ZO-CO-NZ-或Z2N-CO-NZ-基团取代。
此外，其中R4是巯基的式I化合物可以呈现为经-S-S-键结合的二聚体，其也属于本发明。
纯的对映体、外消旋混合物和两种对映体的不等量混合物属于本发明的范围内。应该理解，所有可能的非对映体形式属于本发明的范围内。
依赖于处理的条件，通式I和II的化合物可以以中性形式获得，成为盐，例如可药用盐；或成为溶剂化物，例如水合物；其全部属于本发明的范围内。
本发明还包括分别具有式I和II化合物的生物功能的通式I和II的衍生物。例如，某些式I或II的保护衍生物可以在分别制备式I和II化合物的最终脱保护阶段之前制成。
保护基的应用公开在“Protective Groups in OrganicSynthesis”，2nd edition，T.W.Greene & P.G.M.Wutz，Wiley-Interscience(1991)。保护基还可以是高分子树脂，例如Wang树脂或2-氯三苯甲基氯树脂。
所属领域普通技术人员还应理解，虽然所述的式I或II的化合物的保护衍生物可能不具有药理学活性，但它们经非肠道或口服与凝血酶抑制剂一起给药后并且此后在体内代谢形成具有药理学活性的式I或II的化合物。因此，此类衍生物可以描述为“前药”。式I或II化合物的所有前药属于本发明的范围内。
在本申请中，CPU抑制剂包括化学修饰物，例如有活性或无活性的酯、前药和代谢产物和任何这些物质的可药用盐。通式I的CPU抑制剂的制备通式I的CPU抑制剂可以利用下列方法A-C制备。方法A方法A适于制备其中R1、R3、R4和Y定义如上并且R2是H和X是C(Z)2的通式I的化合物，该方法包括下列步骤a)通式III的化合物，R1-X-OH (III)其中R1如式I定义并且X是C(Z)2，其或购得或者利用已知技术制得，可以在标准条件下利用适宜试剂如PPh3/CBr4、TosCl/吡啶或(CF3SO2)2O/TEA转化为通式IV的化合物，R1-X-L (IV)其中L是适当的离去基团，例如氯、溴、碘、三氟甲基磺酸酯或对甲苯磺酰基。b)通式IV的化合物可以进而在适当碱如K2CO3或NaH的存在下、在标准条件下与通式V的化合物反应 其中R2和R3如式I的定义，其或是商购或利用已知技术获得，得到通式VI的化合物 c)通式VI的化合物，其中R1和R3如式I定义且X是C(Z)2和R2是H，此后通过在适当碱如Et2NH的存在下、于标准条件下用甲醛处理，可以转化为通式VII的化合物 d)通式VII的化合物也可以通过在适当碱如LDA和NaH的存在下、于标准条件下用通式IV的烷基化试剂处理通式VIII的化合物 其中R3和R5如式I的定义，得到通式IX的化合物， e)通式IX的化合物随后与适宜的醛或酮OC(Z)2在适当碱如KOtBu、LDA或NaH的存在下、于标准条件下反应得到通式VII的化合物 f)通式VII的化合物可以进一步与通式X的化合物R5-SH (X)其中R5是适宜的保护基，如Ac、Bz、PMB或Bn，单独或在适当碱如NaOMe、NaH或三乙胺的存在下或同样在自由基引发剂如AIBN的存在下、于标准条件下反应得到通式I的化合物，其中R1、R3、R4和Y如式I定义和R2是H和X是C(Z)2。方法B方法B用于制备通式I的化合物，其中R1、R2、R3和R4如式I定义和Y是CH2，和X是O、S、SO、SO2、C(Z)2或N(Z)，该方法包括下列步骤a)通式XI的化合物，R1-X-H (XI)其中R1如式I定义和X是O、S或N(Z)，与通式XII的烷基化试剂反应， 其中R2和R3如式I定义和L是适宜的离去基团，例如氯、溴、碘、三氟甲磺酰基(triflate)或对甲苯磺酰基，该反应在标准条件下、采用适当试剂如NaH、Ag2CO3或Bu4NHSO4/NaOH进行，得到通式XIII的化合物， b)通式XIII的化合物此后可以与二氧化碳在适当碱如LDA或KHMDS的存在下、于标准条件下反应得到通式XIV的化合物， (c)通式XIV的化合物进而可以与氯甲酸烷基酯如ClCOOMe在碱如三乙胺的存在下反应，此后用适宜的还原剂如NaBH4在标准条件下还原所得的混合酐，得到通式XV的化合物， (d)通式XV的化合物此后可以与通式X的化合物R5-SH(X)其中R5是适宜的保护基，例如Ac或Bz，在适当试剂如PPh3/DIAD的存在下、于标准条件下反应得到通式I的化合物，其中R1、R2、R3、和R4定义如上和Y是CH2和X是O、S、C(Z)2或N(Z)。e)通式I的化合物，其中R1、R2、R3、R4和Y定义如上和X是S，进而可以与适当的氧化剂如MCPBA、在标准条件下反应，得到通式I的化合物，其中R1、R2、R3、R4和Y定义如上和X是SO或SO2。方法C方法C用于制备通式I的化合物，其中R1、R2、R3，、R4和Y定义如上，和X是NR6CO、CONR6、SO2NR6或NR6SO2，该方法包括下列步骤a)通式XVI的化合物， 其中R2、R3、R6和Y如式I定义和R5是适宜的保护基，例如Ac、Bz、PMB或Bn，与通式XVII的化合物反应，R1-X (XVII)其中R1如式I定义和X是COOH或SO2Cl，该反应在适当偶联剂如PyBOP/DIPEA、DCC/HOBt、EDC/TEA/DMAP或吡啶的存在下、于标准条件下进行，得到通式I的化合物，其中R1、R2、R3、R4和Y定义如上和X是NR6CO或NR6SO2。b)通式XVIII的化合物， 其中R2、R3和Y如式I定义和X是COOH或SO2Cl和R5是适宜的保护基，例如Ac、Bz、PMB或Bn，与通式XIX的化合物反应，R6-NH2(XIX)其中R6如式I定义，该反应在适当偶联剂如PyBOP/DIPEA、DCC/HOBt、EDC/TEA/DMAP或吡啶的存在下、于标准条件下进行，得到通式I的化合物，其中R1、R2、R3、R4和Y定义如上和X是CONR6或SO2NR6。通式II的CPU抑制剂的制备通式II的CPU抑制剂可以利用下列方法D-G制备。方法D方法D用于制备通式II的化合物，其中R7、R11、R12和Z如上定义和R8是H，R9是COOR11，R10表示 X是C(Z)2，Y是C(Z)2并且该方法包括下列步骤a)通式XX的化合物，R7-X-OH(XX)其中R7和Z如式II定义和X是C(Z)2，其或是商购或利用已知技术制得，可以在标准条件下用适当试剂如PPh3/CBR4、TosCl/吡啶或(CF3SO2)2O/TEA转化为通式XXI的化合物，R7-X-L (XXI)其中L是适宜的离去基团，例如氯、溴、碘、三氟甲磺酰基或对甲苯磺酰基。b)通式XXI的化合物此后可以与通式XXII的化合物 其或是商购或利用已知技术制得，在适当碱如K2CO3或NaOH的存在下、于标准条件下反应，得到通式XXIII的化合物， c)通式XXIII的化合物此后可以通过在适当碱如Et2NH的存在下、于标准条件下用甲醛处理，得到通式XXIV的化合物， 然而，如果Y是CH(Z)，则通式XXIV的化合物可以通过通式XXV的化合物， 用通式XXI的烷基化试剂R7-X-L (XXI)其中R7是如式II定义和L是适宜的离去基团，例如氯、溴、碘、三氟甲磺酰基或对甲苯磺酰基，在适当碱如LDA或NaH的存在下、于标准条件下处理，得到通式XXVI的化合物， 通式XXVI的化合物随后可以与适当的醛CHO(Z)，其中Z如式II定义，在适当碱如KOtBu、LDA或NaH的存在下、于标准条件下反应，得到通式XXIV的化合物。d)通式XXIV的化合物进一步与通式XXVII的化合物R12PO2H2(XXVII)其中R12如式II定义，在适当试剂如BSA或HMDS的存在下、于标准条件下反应，得到通式II的化合物，其中R7、R11、R12和Z如上定义，R8是H，R9是COOR11，R10表示 X是C(Z)2和Y是C(Z)2。方法E方法E用于制备通式II的化合物，其中R7、R8、R11、R12和Z如上定义，R9是COOR11，X是C(Z)2，Y是O，和R10表示 该方法包括下列步骤a)通式XXVIII的化合物，R7-XCO-R8(XXVIII)其中R7、R8和Z如式II定义和X是C(Z)2，在适当试剂如TMSCN/ZnI2或KCN/HOAc的存在下、于标准条件下反应，得到通式XXIX的化合物， 其中R7和R8如式II定义和X是C(Z)2。b)通式XXIX的化合物此后可以用适当试剂如HCl或HCl/MeOH在标准条件下处理，得到通式XXX的化合物， 其中R7和R8如式II定义和X是C(Z)2。c)通式XXX的化合物随后可以与通式XXXI的化合物反应，R12PO3H2(XXXI)其中R12如式II定义，其或是商购，公开在文献中或利用已知技术制得，该反应是在适当偶联剂如DCC/DMAP、PyBop/DIPEA或SOCl2的存在下、在标准条件下进行，得到通式II的化合物，其中R7、R8、R11、R12和Z如上定义，R9是COOR11，R10表示 X是C(Z)2和Y是O。方法F方法F用于制备通式II的化合物，其中R7和R8如上定义和X和Y是C(Z)2或单键，并且R9和R10是COOR11，该方法包括下列步骤a)通式XXXII的化合物， 其中R8和R11如式II定义和Y是C(Z)2或单键，其或是商购、文献公开或利用已知技术制得，与通式XXI的化合物R7-X-L(XXI)其中R7如式II定义，X是C(Z)2和L是适宜的离去基团，例如Cl、Br、I或对甲苯磺酰基，在适当碱如LDA或NaH的存在下，于标准条件下反应，得到通式XXXIII的化合物， b)通式XXXIII的化合物例如通过用NaOH水溶液或TFA水溶液在标准条件下水解，得到通式II的化合物，其中R7和R8如上定义和X和Y是C(Z)2或单键，并且R9和R10是COOH。方法G方法G用于制备通式II的化合物，其中R7、R8、R11、R13、X、Y知Z如上定义，R9是COOR11和R10表示 该方法包括下列步骤a)通式XXXIII的化合物， 可以与通式XXXIV的化合物反应，HR13NOH(XXXIV)其中R13如式II定义，该反应在适当试剂如DCC/DMAP的存在下、于标准条件下进行，得到通式II的化合物，其中R7、R8、R11、R13、X、Y和Z如上定义，R9是COOR11和R10表示 基团凝血酶抑制剂本申请中所述凝血酶抑制剂包括但不限于低分子量凝血酶抑制剂。所属领域技术人员应理解术语“低分子量凝血酶抑制剂”。该术语也应该被理解为包括在体内和/或体外试验中使凝血酶抑制为实验上可测定的程度并且分子量小于约2000，优选分子量小于约1000的物质(即化合物)的任何组合物。
优选的低分子量凝血酶抑制剂包括基于低分子量的肽、基于氨基酸和/或基于肽类似物的凝血酶抑制剂。
术语“基于低分子量的肽、基于氨基酸和/或基于肽类似物的凝血酶抑制剂”所属领域技术人员应理解为包括具有1-4个肽键的低分子量凝血酶抑制剂，并且包括那些在Claesson在Blood Coagul.Fibrin.(1994)5，411的综述文章中公开的凝血酶抑制剂；以及公开在美国专利No4,346,078；国际专利申请WO93/11152，WO93/18060、WO93/05069、WO94/20467、WO94/29336、WO95/35309、WO95/23609、WO96/03374、WO96/06832、WO96/06849、WO96/25426、WO96/32110、WO97/01338、WO97/02284、WO97/15190、WO97/30708、WO97/40024、WO97/46577、WO98/06740、WO97/49404、WO97/11693、WO97/24135、WO97/47299、WO98/01422、WO98/57932、WO99/29664、WO98/06741、WO99/37668、WO99/37611、WO98/37075、WO99/00371、WO99/28297、WO99/29670、WO99/40072、WO99/54313、WO96/31504、WO00/01704和WO00/08014；和欧洲专利申请648780、468231、559046、641779、185390、526877、542525、195212、362002、364344、530167、293881、686642、669317、601459和623596，这些公开文献全部在此引入作为参考。
在本申请中，凝血酶抑制剂的衍生物包括化学修饰物，例如有活性或无活性的酯、前药和代谢产物，以及任何这些的可药用盐和溶剂化物如水合物；和所述盐的溶剂化物。
优选的基于低分子量肽的凝血酶抑制剂包括总称为“加兰(gatran)”类的凝血酶抑制剂。可以提及的具体加兰类化合物包括HOOCCH2-(R)Cha-Pic-Nag-H(称作伊诺加兰(inogatran))和HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H(称作美拉加兰(melagatran))(分别参见国际专利申请WO93/11152和WO94/29336，并且其中包含缩写的目录)。
国际专利申请WO97/23499中公开了多种业已发现可用作凝血酶抑制剂前药的化合物。所述前药具有通式RaOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-Rb其中Ra表示H、苄基或C1-10烷基，Rb(其取代Pab-H的脒基单元中的一个氢原子)表示OH、OC(O)Rc或C(O)ORd，Rc表示C1-17烷基、苯基或2-萘基和Rd表示C1-12烷基、苯基、C1-3烷基苯基或2-萘基。优选的化合物包括RaOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH，其中R表示苄基或C1-10烷基，例如乙基或异丙基，尤其是EtOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH。活性凝血酶抑制剂本身公开在WO94/29336中。药物制剂本发明涉及含有CPU抑制剂和凝血酶抑制剂或其可药用盐作为活性成分的药物组合物。
优选的CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的联合形式是那些其中CPU抑制剂是通式I或II的化合物同时凝血酶抑制剂是HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H、其衍生物或其前药，特别是EtOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-OH的联合形式。
采用HOOC-CH2-(R)Cgl-Aze-Pab-H、其衍生物及其前药的适宜制剂业已公开在文献中，譬如特别公开在国际专利申请WO94/29336、WO96/14084、WO96/16671、WO97/23499、WO97/39770、WO97/45138、WO98/16252、WO99/27912和WO99/27913，这些文献公开的内容在此引入作为参考。
在本发明中，所述的制剂和/或多部分的试剂盒可以含有两种或多种CPU抑制剂与一种凝血酶抑制剂联用、两种或多种凝血酶抑制剂与一种CPU抑制剂联用或其任何的联合形式。两种或多种抑制剂包括活性成分与其一种前药的联合形式。
为了临床使用，CPU抑制剂和凝血酶抑制剂被配制为口服、静脉内、皮下、气管、支气管、鼻内、经肺、透皮、经颊、直肠、非肠道或一些其他给药方式的药物制剂。该药物制剂含有与可药用辅剂、稀释剂和/或载体相混合的抑制剂。
活性成分的总量适宜占该制剂的约0.1％(w/w)-约95％(w/w)的范围内，适合为0.5％-50％(w/w)并且优选1％-25％(w/w)。
CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的摩尔比例可以在约1000∶1-约1∶1000。CPU抑制剂和凝血酶抑制剂间的摩尔比适宜在300∶1-1∶300内，并且优选50∶1-1∶50。
在本发明的药物制剂的制备中，活性成分可以与固体粉状组分如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物、明胶或另一种适当组分，以及崩解剂和润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酰基富马酸钠和聚乙二醇蜡混合。随后将该混合物加工为颗粒或压制为片剂。
活性成分可以单独地与其他非活性成分在混合制成制剂之前预混合。活性成分还可以在与非活性成分混合制成制剂之前彼此混合。
软明胶胶囊可以用含有本发明的活性成分、植物油、脂肪或适合软明胶胶囊的赋形剂的混合物制备。硬明胶胶囊可以含有活性成分的颗粒。硬明胶胶囊也可以含有与固体粉状组分如乳糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、土豆淀粉、玉米淀粉、支链淀粉、纤维素衍生物或明胶组合的活性成分。
用于直肠给药的剂量单位可以制成(i)栓剂的形式，其中含有与中性脂肪基质混合的活性物质；(ii)明胶直肠胶囊的形式，其含有与植物油、石蜡油或其他适合明胶直肠胶囊的赋形剂混合的活性物质；(iii)现制微型灌肠剂的形式；或(iv)在给药之前即时在适当溶剂中重构的干燥微型灌肠剂的形式。
液体制剂可以配制为糖浆剂或混悬液的形式，例如含有活性成分和其余组分的溶液或混悬液，所述其余组分是由例如糖或糖醇和乙醇、水、甘油、丙二醇及聚乙二醇的混合物组成。如果希望，此类液体制剂可以含有着色剂、矫味剂、防腐剂、糖精和羧甲基纤维素或其他增稠剂。液体制剂还可以制成使用前用适当溶剂重构的干粉的形式。
非肠道给药的溶液可以在可药用溶剂中制成本发明制剂的溶液。这些溶液还可以含有稳定组分、防腐剂和/或缓冲组分。用于非肠道给药的溶液也可以制成使用前用适当溶剂重构的干燥制剂。
所述化合物的给药剂量应取决于有关指征、患者的年龄、体重和性别并且可以由主治医师判断。剂量适宜在0.01mg/kg-10mg/kg的范围内。
活性成分的典型日剂量在宽范围内变化，而且将取决于多种因素，例如有关指征、给药途径、患者的年龄、体重和性别，其可以由主治医师决定。通常，口服和非肠道的剂量应在0.1-1,000mg/天的活性成分总量内。
在本发明中，“治疗有效总量”是指CPU抑制剂和凝血酶抑制剂在联合产生治疗效果时的总量，即使在单独给药时各个用量可能小于治疗有效量。医学和药学应用按照本发明还提供适用于医学疗法的制剂和多部分的试剂盒；本发明的制剂在制备用于治疗其中需要或希望凝血酶抑制和/或CPU抑制的病症的药物中的应用；和医学治疗或包括将治疗有效总量的本发明的CPU抑制剂和凝血酶抑制剂施用给患有、易感染其中需要或期望凝血酶抑制和/或CPU抑制的病症的患者的方法。
CPU抑制剂和凝血酶抑制剂可以顺序、分开和/或同时给药。此外，CPU抑制剂可以在凝血酶抑制剂的给药之前施用，或者反之亦然。
在此所用的术语“医学疗法”是指在人体或其他哺乳动物体内或离体进行的预防、诊断和治疗方案。
本发明的制剂含有CPU的抑制剂和凝血酶的抑制剂，或者在其前药给药后的情况中含有CPU的抑制剂或凝血酶的抑制剂。所以，期望本发明的制剂适用于那些其中CPU的抑制和/或凝血酶的抑制是有益的病症，例如治疗哺乳动物包括人体的血液和组织中的血栓形成和凝固性过高。
术语“需要或期望凝血酶抑制的病症”所属领域技术人员应理解为包括下列内容治疗和/或预防动物包括人体的血液和组织中血栓形成和凝固性过高。已知凝固性过高可能导致血栓栓塞性疾病。上述与凝固性过高有关的病症和血栓栓塞疾病包括遗传或获得性活化蛋白C抗性，例如凝血因子V-突变(凝血因子V病(Leiden))；和遗传或获得性抗凝血酶III、蛋白C、蛋白S、肝素辅因子II缺损。其他已知与凝固性过高和血栓栓塞疾病有关的病症包括循环性抗磷脂抗体(狼疮抗凝固)、高胱氨酸血症(homocysteinemi)、肝素诱发的血小板减少和血纤蛋白溶解缺损。
治疗的其中存在不利过量的凝血酶的病症可以没有凝固性过高体征，例如神经变性疾病如阿尔茨海默氏病。
可提及的特定疾病状态包括治疗和/或预防的静脉血栓形成(例如DVT)和肺栓塞；动脉血栓形成(例如心肌梗塞、不稳定型心绞痛、基于血栓形成的发作和外周动脉血栓形成)和全身栓塞，其常在动脉纤维性颤动过程中从心房开始或在透壁性心肌梗死后由左心室开始，或由充血性心衰引起；预防血栓形成、经皮腔内血管成形术(PTA)和冠状动脉搭桥术后的再闭合(即血栓形成)；预防显微外科术和常规血管外科手术后血栓再形成。
其他适应症包括治疗和/或预防治疗由细菌、多发性创伤、中毒或其他机理引起的弥散性血管内凝血；当血液与机体内外源物表面如血管移植物、血管支架、血管导管机械和生物人工瓣膜或任何其他医学装置接触时的抗凝治疗；和当血液与机体外部的医学装置接触时的抗凝治疗，例如在心血管手术中采用的心肺机或在溶血中；治疗和/或预防特发症和成人呼吸窘迫综合征、放射或化疗后继发的肺纤维化、浓毒性休克、败血症，炎性反应，其包括但不限于水肿、急性或慢性动脉粥样硬化如冠心病，大脑动脉病，外周动脉疾病、再灌注损伤和经皮腔内血管成形术(PTA)后的再狭窄。
实施例下列实施例举例说明但不限定本发明的范围。材料和方法材料在冷冻干燥和溶解在盐水中达到浓度10BU/ml时均使巴曲酶No.520CRY(American Diagnostica Inc.，Greenwich，CT，USA)保持在8℃。其在试验中5天内使用。其余药物冷冻并且在-20℃下最多保存30天。
将内毒素L-3129(Sigma，St.Louis，MO，USA)溶于盐水中浓度为50μg/ml。为各个试验制备新鲜溶液。
在冷冻干燥时将125I-标记的人体纤维蛋白原(Amersham，LittleChalfont，Buck.，UK)保存在8℃。溶于盐水/蒸馏水(80/20v/v)成为约0.8MBq/ml(20μCi/ml)的储备液后，将其分为等份(各试验用一份)，迅速冷冻并且保存在-20℃下。在生产日后14日内用于试验。
将Inactin，即仲丁硫巴比妥钠盐(Research BiochemicalsInternational，Natick，USA)溶于盐水/蒸馏水(50/50v/v)中浓度为50mg/ml。
将凝血酶抑制剂伊诺加兰溶于40％(w/w)环糊精(HPβCD)达到5mg/ml的浓度并且保存在-20℃。不同试验中在使用之前进一步用40％环糊精稀释。在研究中，药物经皮下给药。
将凝血酶抑制剂美拉加兰溶于盐水中。
将CPU抑制剂MERGETPA和化合物A溶于去氧盐水中。盐水通过超声20分钟且随后再通入氮气20分钟来去氧。在各试验中溶液始终是新制的。CPU抑制剂以静脉内输注在5分钟内给予大鼠。动物在这些试验中采用雄性Sprague Dawley系大鼠(Charles River，Sweden)，体重为325-425g。动物在使用之前在AstraZeneca R&D，Molndal，Sweden适应1周。动物准备用Inactin 100mg/kg腹膜内(i.p.)引起和保持麻醉。
将两根导管插入左颈静脉，一根导管施用125I-纤维蛋白原和巴曲酶，另一根导管施用内毒素和CPU抑制剂或其相应赋形剂。将第三根导管插入颈动脉中用于采集血样和测定平均动脉血压和心率。为了避免动脉导管内血液凝固，在整个试验期间维持缓慢的盐水输注(约1.0ml/kg*h)。切开大鼠气管以促进自发性呼吸。监测体温并且利用外部加热保持38℃。试验方案在试验开始时给动物静脉内注射内毒素(50μg/kg)。2小时后，经皮下注射凝血酶抑制剂或其赋形剂，并且在另一15分钟后静脉内注射125I-血纤蛋白原(0.04MBq)。5分钟后开始持续5分钟的CPU抑制剂或其赋形剂的输注。5分钟后，在1分钟内静脉内快速浓注巴曲酶(10BU/kg)。
在所有试验中在巴曲酶给药之前和之后5、20和30分钟时采集用于测定125I含量的血样。在试验结束时取出肺，该组织轻轻用盐水洗涤，此后印迹和称重。利用Wallac 1282 Compugamma计数器测定组织和血样中的125I含量。血浆和肺中125I的浓度表示为刚好在巴曲酶注射之前采集的参比动脉血样的放射性百分比。
实施例1得自例如Biochimica & Biophysica Acta 1034(1990)86-92的已知CPU抑制剂mergetpa(DL-2-巯甲基-3-胍乙基硫丙酸)与凝血酶抑制剂伊诺加兰合用。
试验的结果表示在表I中。结果表示为处理后肺中的残余血纤蛋白，即100％等于没有影响，n表示试验(大鼠)的数量。
表IMERGETPA和/或伊诺加兰在试验中对麻醉大鼠中的肺血纤蛋白沉积的影响
表I显示，对于处理后的残余血纤蛋白，CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的联合形式的给药优于这两种抑制剂单独的给药。
实施例2CPU抑制剂(3-(6-氨基-吡啶-3-基)-2-巯甲基-丙酸)(化合物A)与凝血酶抑制剂美拉加兰合用。
试验的结果表示在表II中。结果表示为处理后肺中的残余血纤蛋白，即100％等于没有影响，n表示试验(大鼠)的数量。
表II化合物A和/或美拉加兰在试验中对麻醉大鼠中的肺血纤蛋白沉积的影响
表II显示，对于处理后的残余血纤蛋白，CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的联合形式的给药优于这两种抑制剂单独的给药。
实施例3CPU抑制剂(3-(6-氨基-吡啶-3-基)-2-巯甲基-丙酸)(化合物A)与凝血酶抑制剂美拉加兰合用试验的结果表示在表III中。结果表示为处理后肺中的残余血纤蛋白，即100％等于没有影响，n表示试验(大鼠)的数量。
表III化合物A和美拉加兰在试验中验证对麻醉大鼠中的肺血纤蛋白沉积的协同作用
对于四种不同剂量的联合形式的各个试验，也就是只有CPU抑制剂、只有凝血酶抑制剂、凝血酶抑制剂分别与0.2和0.28μmol/kg的CPU抑制剂，适合独立的E-max模型。该模型适合于对数尺度从而给出中值有效剂量，即半数群体产生50％效果时的剂量。

图1中绘出这些ED50的置信区间。当协同效应不存在时，CPU抑制剂和凝血酶抑制剂的联合形式的ED50将位于连接两种药物各自单独给药时的ED50的线上(参见图1)。为了估价协同效应，全部四种剂量的联合形式应用于E-max模型，其中凝血酶抑制剂分别与0.2和0.28μmol/kg的CPU抑制剂的ED50利用参数Δ表示，如图所述。参数Δ测定为0.52同时95％置信区间为
，与0具有显著性差异，p＜0.001。缩写Ac＝乙酸酯(盐)AIBN＝α，α’-偶氮异丁腈Aze＝(S)-氮杂环丁烷-2-甲酸Bn＝苄基Bu＝丁基BU＝由American Diagnostica Inc.，USA)定义的巴曲酶单位Bz＝苯甲酰基Cha＝β-环己基丙氨酸Cgl＝(S)-环己基甘氨酸DCC＝二环己基碳化二亚胺DIAD＝偶氮二甲酸二异丙基酯DIPEA＝二异丙基乙基胺DMAP＝N，N-二甲基氨基吡啶EDC＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺EtOH＝乙醇HMDS＝六甲基二硅烷基胺(hexamethyl disilazane)HOAc＝乙酸HOBt＝1-羟基苯并三唑HPβCD＝羟丙基β-环糊精i.p.＝腹膜内i.v.＝静脉内KHMDS＝双(三甲基甲硅烷基)氨化钾LDA＝二异丙基氨化锂Me＝甲基MeOH＝甲醇Nag-H＝降胍丁胺Pab-H＝1-脒基-4-氨基甲基苯Ph＝苯基Pic＝2-哌啶酸PMB＝4-甲氧基苄基PyBOP＝(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷鏻六氟磷酸盐SD＝标准偏差TEA＝三乙胺TFA＝三氟乙酸THF＝四氢呋喃TMSCN＝三甲基甲硅烷基氰化物Tos(yl)＝甲苯-4-磺酰基


本发明涉及羧肽酶U(CPU)的抑制剂和凝血酶抑制剂与可药用辅剂、稀释剂或载体相混合的药物制剂,以及多部分的试剂盒,治疗方法和所述制剂用于治疗其中需要或期望CPU抑制和/或凝血酶抑制的病症中的应用。