装载凝血酶的dna自组装纳米结构、其制备方法及应用的制作方法【技术领域】,尤其涉及一种装载凝血酶的DNA自组装纳米结构、其制备方法及应用。[0002]肿瘤血管系统与肿瘤的生长、侵袭及转移密切相关，它既是肿瘤组织获取营养物质和氧气的主要场所，也是肿瘤排走代谢产物、肿瘤细胞逃逸、转移的通道，因而肿瘤血管成为肿瘤靶向治疗的良好靶点。肿瘤血管靶向治疗法主要包括两种策略:抗新生血管生成的治疗和阻断肿瘤血供的治疗。其中阻断肿瘤血供治疗法是通过栓塞已经存在的血管，使肿瘤细胞因缺乏营养和氧气饥饿而死。该治疗方法针对的靶点是血液成分，因而不易产生耐药性，适用范围广泛。此外，对临床大多数癌症患者而言，药物所针对的都是已经血管化的肿瘤。因此，阻断肿瘤血供疗法呈现出较好的临床应用前景。然而，迄今为止寻找安全而有效的肿瘤血管栓塞方法仍然是该研究领域的一个“瓶颈”。[0003]凝血酶(thrombin)又称凝血因子Ila，是机体凝血系统的一种关键酶。它一方面可直接作用于血液中的纤维蛋白原，使之转变为纤维蛋白，形成纤维蛋白凝胶，另一方面则通过受体介导途径诱导血小板活化，活化的血小板发生聚集，在纤维蛋白凝胶网的作用下形成血小板血栓，之后血液中其他有形成分的加入导致稳定血栓的形成。因此，作为一种有效的促凝剂，凝血酶在不需要其它众多凝血因子参与的情况下，快速而高效的诱导血栓的形成。那么，如果将凝血酶作为促凝药物靶向递送到肿瘤血管中，无疑可有效阻断肿瘤血供，达到治疗肿瘤的目的。然而，凝血酶自身的高促凝活性使其不适于静脉注射，再者，凝血酶在血液中的半衰期较短。因此，如何实现凝血酶的静脉注射以及对肿瘤组织的靶向输送是将其应用于肿瘤治疗的关键技术挑战。[0004]DNA纳米技术在新兴的纳米领域中具有广泛的潜在应用，其中DNA折纸术作为一种全新的DNA自组装方法引起人们广泛的关注。DNA折纸术(origami)是通过将一条长的DNA单链(称为脚手架链，通常为基因组DNA)与一系列经过特定设计的短DNA单链(称为订书钉链)进行碱基互补，构造出各种复杂可控的纳米图案或结构。
[0005]本发明的目的在于提出一种能够实现凝血酶对肿瘤组织血管的靶向输送和可控释放的装载凝血酶的DNA自组装纳米结构，该纳米结构具有一可控的“锁”结构以特异性响应肿瘤血管内皮特异性受体进而释放出凝血酶，是一种可寻址、安全、高效，具有较高医用价值的肿瘤血管阻断剂。[0006]为达此目的，本发明采用以下技术方案:
[0007]第一方面，本发明提供了一种装载凝血酶的DNA自组装纳米结构的制备方法，该制备方法包括以下步骤:
[0008](1)利用DNA折纸技术，将单链DNA分子自组装成长方形的纳米结构；[0009](2)将凝血酶固定于步骤⑴所得长方形纳米结构的表面；
[0010](3)将包含可特异性识别肿瘤血管内皮受体的适配体的辅链I和包含该适配体的互补序列的辅链2进行杂交，并将该杂交体中的两个自由单链部分通过碱基互补配对分别固定于所述长方形纳米结构的两条长边。
[0011]上述制备方法中，作为优选，步骤(1)中，通过订书钉链的辅助折叠，将所述单链DNA分子自组装成长方形的纳米结构；
[0012]优选地，所述单链DNA分子为M13噬菌体基因组DNA ；
[0013]所述长方形的长宽比可根据实际需要进行调整，优选地，所述长方形的长宽比为(1.5~2.5): 1、优选为(1.5~2):1、更优选为1.5:1。
[0014]在本发明优选的实施方案中，所述长方形的长X宽=90nmX60nm。
[0015]进一步优选地，步骤(1)的自组装过程为:
[0016]将所述单链DNA分子与订书钉链按1: (6-10)、优选1:8的摩尔比混合，所得混合溶液从60-70°C、优选62-68°C、更优选65°C，以0.8-1.2°C、优选I°C为一个梯度，逐渐降温至20-30°C、优选22-28°C、更优选25°C进行退火，得到所述长方形纳米结构；
[0017]优选地，每个梯度停留时间为8-12分钟、优选为10分钟，整个退火过程为6-8小时，优选为?小时。
[0018]上述制备方法中，作为优选，步骤(2)中，所述凝血酶通过偶联剂偶联到巯基化的寡聚dT上，所得复合体再通过巯基化的寡聚dT共价结合于所述长方形结构的表面；
[0019]优选地，所述偶联剂为4-(N_马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐；
[0020]优选地，在所述长方形结构的表面设3-6个、优选为4个凝血酶结合位点。
[0021]进一步优选地，步骤(2)包括:
[0022]0- )将凝血酶与偶联剂混合，于20-30°C、优选22-28°C、更优选25-26°C下反应40-90min、优选60min,得到凝血酶与偶联剂的复合物；
[0023](2’ )将步骤0- )所得复合物与巯基化的寡聚dT混合，于2_8°C、优选4_6°C、更优选4°C下反应12-20小时、优选14-18小时、更优选16小时，得到凝血酶-偶联剂-寡聚dT的复合物；
[0024]优选地，步骤(1)所得复合物与巯基化的寡聚dT的摩尔比为1:(12-20)、优选为I:15 ；
[0025](3’)将步骤(2’)所得复合物与所述长方形纳米结构混合，所得混合物从40-50°C、优选42-48°C、更优选45°C，以0.8-1.2 °C、优选I °C为一个梯度，逐渐降温至20-30°C、优选22-28°C、更优选25°C进行退火，从而将凝血酶共价结合于长方形纳米结构上；
[0026] 优选地，步骤(2’)所得复合物与所述长方形纳米结构的摩尔比为(8-12):1、优选为 10:1 ；
[0027]优选地，每个梯度停留时间为8-12分钟、优选为10分钟，整个退火过程为2-4小时，优选为3小时。
[0028]上述制备方法中，作为优选，步骤(3)中，所述可特异性识别肿瘤血管内皮受体的适配体为DNA或RNA适配体，优选为AS-1411 ；[0029]优选地，包含所述适配体的辅链I的序列如SEQ ID N0.1所示，包含该适配体的互补序列的辅链2的序列如SEQ ID N0.2所示:
[0030]SEQ ID N0.1:
[0031]5’ -GTGCGCAAAGAGTTTACAAAATTAAAGTACGGTGTCTGGAAGAGGTCA-3’ ；
[0032]SEQ ID N0.2:
[0033]5’ -GTGCGCAAAGAGTTTATTTTTGCGCAGAAAACGAGAATGAATGTTTAG-3’。
[0034]进一步优选地,步骤(3)包括:
[0035]将所述辅链I与辅链2退火杂交，所得杂交体与步骤(2)所得产物混合，并从35-40°C、优选37°C，以I°C为一个梯度，逐渐降温至12_18°C、优选为15°C进行退火，从而将所述杂交体的两个自由单链部分通过碱基互补配对分别固定于所述长方形结构的两个长边；
[0036]优选地，所述杂交体与步骤(2)所得产物的摩尔比为(18-22):1、优选为20:1 ;
[0037]优选地，每个梯度停留时间为8-12分钟、优选为10分钟，整个退火过程为3-5小时，优选为4小时。
[0038]作为优选，上述制备方法还包括:
[0039](4)在所述长方形纳米结构的宽边上固定能够特异性识别肿瘤血管的靶向链，所述靶向链优选为肿瘤血管内皮特异性受体的适配体、多肽、抗体或抗体片段，更优选为AS-1411适配体；
[0040]优选地，宽边上的适配体的种类和数目与长边上的相同；
[0041]优选地，将AS-1411适配体与步骤(3)所得产物混合，从35_40°C、优选37°C，以0.8-1.2°C、优选1°C为一个梯度，逐渐降温至12-18°C、优选为15°C进行退火，形成所述装载凝血酶的自组装DNA纳米结构；
[0042]优选地，所述AS-1411适配体与步骤(3)所得产物的摩尔比为(3_8):1、优选为5:1 ；
[0043]优选地，每个梯度停留时间为8-12分钟、优选为10分钟，整个退火过程为3-5小时，优选为4小时。
[0044]步骤(4)的增加，可加强所述DNA自组装纳米结构对肿瘤血管组织的识别和结合能力，更有利于凝血酶的靶向运输和可控释放。
[0045]上述制备方法中，由于DNA纳米结构自组装中的可控、可预测性，从而可实现凝血酶在纳米结构中精密的空间定位。
[0046]第二方面，本发明提供了一种装载凝血酶的DNA自组装纳米结构，由第一方面所述制备方法制得；
[0047]优选地，所述DNA自组装纳米结构为管状，底部直径为16-22nm、优选为18_20nm、更优选为19nm,高为80-100nm、优选为85_95nm、更优选为90nm ；
[0048]优选地,每个DNA自组装纳米结构的内部结合3-6个、优选4个凝血酶蛋白分子。
[0049]第三方面，本发明提供了第二方面所述的DNA自组装纳米结构在制备用于阻断肿瘤血供从而抑制肿瘤生长的药物中的应用；优选地，所述肿瘤为乳腺癌、黑色素瘤、肉瘤、非小细胞肺癌及胃癌。
[0050] 本发明利用DNA折纸技术，以较长的单链DNA为主链(即脚手架链)，通过与过量的订书钉链在特定位置的杂交互补，使其自组装成长方形的DNA纳米结构；再将凝血酶蛋白固定在长方形纳米结构的表面，随后，将包含肿瘤血管内皮特异性受体的适配体的辅链I以及包含适配体互补序列的辅链2杂交，并将杂交体的两个自由单链部分分别固定在长方形的两条长边，从而形成一个“锁”结构，将长方形的纳米结构闭合为管状，最终得到一种内部装载有凝血酶，同时具有一可控的“锁”以响应肿瘤血管内皮特异性受体的管状DNA纳米结构。
[0051]本发明的装载凝血酶的DNA自组装纳米结构的靶向输送与可控释放的机理为:在到达肿瘤血管组织前的血管运输中，辅链I和辅链2所形成的“锁”结构将凝血酶封闭于管状结构的内部，避免了凝血酶发挥非特异凝血效应；当到达肿瘤血管组织时，辅链I所含特异性适配体可以响应肿瘤血管内皮特异性受体，从而打开“锁”结构，释放凝血酶，进而实现了凝血酶对肿瘤血管组织的靶向输送与可控释放。
[0052]本发明的装载凝血酶的DNA自组装纳米结构可用于静脉注射，实现了对肿瘤的靶向治疗；并且，由于DNA纳米结构易于修饰、生物相容性好、尺寸均匀、在溶液中稳定性好，因此具有广阔的医用前景。



[0053]图1是实施例1中所制备的长方形DNA折纸结构的原子力显微镜(AFM)形貌图，比例尺为200nm。
[0054]图2是实施例1中所制备的长方形DNA折纸结构的透射电镜(TEM)形貌图，比例尺为200nm。
[0055]图3是实施例1所制备的管状DNA纳米结构对乳腺癌肿瘤生长的抑制作用；箭头代表给药时间点。

[0056]下面通过来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0057]实施例1:本发明装载凝血酶的DNA自组装纳米结构的制备
[0058]具体步骤如下:
[0059](I)长方形DNA折纸结构的制备
[0060]将M13噬菌体基因组DNA主链和订书钉链混合，主链和订书钉链的最终浓度分别为IOnM和80nM。利用梯度PCR仪对混合物进行缓慢退火，退火条件为:从65°C到25°C，每I °C为一个梯度，每个梯度停留时间为IO分钟，整个退火过程约为7个小时。
[0061]退火程序完毕以后，将DNA折纸结构样品取出，用IOOkDa离心柱(MWCO)离心分离，除去过量的订书钉链和捕获链。离心条件为:取100 μ L样品，加入350 μ LI X TAE-Mg缓冲溶液，于4700转/分钟条件下离心3分钟，离心柱内剩余溶液的体积大约为100 μ L，重复该过程两遍。最终收集的样品分别用于I %的琼脂糖凝胶电泳分析，以及原子力显微镜和投射电镜下的折纸结构形貌观察，原子力显微镜和透射电镜下的折纸结构形貌图分别如图1、图2所示。经检测，所得长方形DNA折纸结构的长为90nm，宽为60nm，厚度为2nm。
[0062](2)制备凝血酶-偶联剂-巯基化的寡聚dT的复合物[0063] 将200 μ L3 μ M的凝血酶(购自中生华美科技有限公司)和9 μ L15mM的sulfo-SMCC(购自天津希恩思生化科技有限公司)混合后于室温反应I小时，反应结束后，将混合物用30kDa离心柱于7500转/分钟的条件下离心30分钟以除去过量的sulfo-SMCC。收集的溶液中加入15倍过量的巯基化的寡聚dT，混合物于4°C反应过夜，用30kDa离心柱离心纯化Oligo dT修饰的凝血酶产物，纯化产物通过4% -12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。
[0064](3)装载凝血酶的管状自组装DNA纳米颗粒的制备
[0065]将步骤(1)所得纯化后的长方形DNA折纸结构溶液和步骤(2)所得凝血酶复合物按照1:10的摩尔比例混合均匀后，放入梯度PCR仪中，缓慢从45°C降至25°C，每1°C为一个梯度，每个梯度停留时间为10分钟,整个退火过程所需时间约为3个小时。
[0066]退火程序结束后，将样品用IOOkDa离心柱离心分离以除去过量的Oligo dT修饰的凝血酶复合物。然后，向收集的样品中加入20倍过量的辅链I (序列如SEQ ID N0.1所示)与辅链2 (序列如SEQ ID N0.2所示)的杂交体，以及5倍过量的靶向链AS-1411适配体，再次放入梯度PCR仪中进行缓慢退火，退火条件为从37°C降至15°C，每1°C为一个梯度，每个梯度停留时间为10分钟，整个退火过程约历时4个小时。用IOOkDa离心柱离心分离PCR产物，琼脂糖凝胶电泳纯化回收得到提纯的包载有凝血酶的管状DNA纳米颗粒。
[0067]实施例2:本发明装载凝血酶的DNA自组装纳米结构的抗肿瘤效果
[0068]抗肿瘤效果的评价方法:
[0069]将2.0X IO6个人源MDA-MB-231乳腺癌细胞原位接种于BALB/c裸鼠的乳房垫，至肿瘤体积生长到大约100mm3。将实施例1所制备的装载凝血酶的DNA自组装纳米颗粒溶液按照每只小鼠大约1.5U单位凝血酶剂量给荷瘤小鼠尾静脉注射，每隔2天注射一次并测量肿瘤体积大小，注射6次以后，统计分析肿瘤体积变化情况。肿瘤体积按照以下公式计算:体积=(d2XD)/2，其中d是肿瘤的最小直径，D是最大直径。注射生理盐水、游离的凝血酶、空白DNA纳米颗粒，作为阴性对照。实验结果如图3所示。
[0070]由图3可得，与生理盐水组、游离凝血酶组及空白DNA纳米颗粒组相比，本发明的装载凝血酶的DNA纳米颗粒组的肿瘤体积增长明显变慢，其抗肿瘤效果明显。
[0071] 申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属【技术领域】的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，包括本发明所用核苷酸序列的适当改进、具体参数的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。