专利名称：生长分化因子抑制剂及其用途的制作方法生长和分化因子-8(GDF-8)也被称为Myostatin，是结构相关性生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的一个成员，所有的成员均具有生理学重要的生长调节和形态发生特征(D.M.Kingsley等(1994)，基因与发育，8，133-46，P.A.Hoodless等(1988)，微生物学和免疫学的现代话题，228，235-72)。TGF-β超家族的成员通过异数的蛋白激酶受体复合物发送信号。此家族还包括骨形态发生蛋白(BMPs)、活化素、抑制素、Mullerian抑制物质、神经胶质衍生神经营养因子以及仍在增加数目的生长和分化因子(GDFs)。Myostatin本身特别在发育的和成熟的骨骼肌中被高度表达，而在脂肪内只有很小程度的表达。Myostatin看来与许多生理过程有关，其中完全确定的是它调节骨骼肌容量的能力，并因此被称为“Myostatin”。通过基因靶向产生的Myostatin无效小鼠发育正常，但具有多于正常骨骼肌一倍的肌肉容量(A.C.McPherron等(1997)自然，387，83-90)。对于其表型是由于Myostatin基因突变产生的二个品种双倍肌肉牛比利时兰和Piedmontese以及超肌肉Compt突变小鼠的鉴定表明，在这二种动物Myostatin具有相同的发育功能(A.C.McPherron等(1997)PNAS，94，12457-61；R.Jambadur等(1997)基因研究，7，910-15；G.Szabo等(1998)哺乳动物基因组，9，671-2)。来自不同种动物的序列资料表明在脊椎动物中GDF-8是高度保守的，这暗示GDF-8可能具有超越物种的相同作用(McPherron和Lee，(1997)PNAS，94，12457-61)。与上述结果一致，最近的研究已显示在人类HIV-感染相关性肌肉消耗伴随有Myostatin蛋白表达增加(N.F.Gonzalez-Gadavid等(1998)PNAS，95，14938-43)。总的说来，此证据有力地支持GDF-8(或Myostatin)对控制骨骼肌容量的重要作用。发明概述本发明至少部分地基于发现从表达GDF-8的细胞获得的培养基中存在GDF-8抑制活性。因此，一方面本发明的特征在于一种方法，用于鉴定抑制GDF如GDF-8活性的GDF抑制剂如GDF-8抑制剂，例如它是一种GDF多肽。在一个实施方案中，该抑制剂本身不具有GDF如GDF-8活性(例如该抑制剂是一种本身不具有GDF活性的GDF多肽)。该方法包括获得在其中已培养了产生GDF多肽的细胞的培养基，并测定培养基成分抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。在一个实施方案中，该方法包括在测定培养基抑制GDF活性的能力之前对培养基进行层析。在另一实施方案中，该方法包括对从层析中获得的组分进行电泳，例如初步的非还原性或还原性SDS-PAGE，并通过例如电洗脱回收这些组分。在另一些优选的实施方案中，这种表达GDF多肽的细胞是例如CHO细胞，此细胞已被用含有编码GDF多肽的插入片段的质粒转染了。在还有其它一些优选的实施方案中，这种细胞产生内源性GDF多肽如GDF-8。这类细胞包括例如杆状肌肉瘤系RD(ATCC，CCL-136)和QM7肌肉成肌细胞(ATCC，CRL-1962)。另一方面，本发明的特征在于一种用于鉴定GDF抑制剂的方法，它包括制备GDF多肽的多肽片段，并测定这些片段抑制GDF活性的能力，从而鉴定GDF抑制剂。可以通过消化GDF多肽如天然的GDF多肽或重组产生的GDF多肽来制备这种多肽片段，或者它们还可以被重组合成或人工合成。例如，可以用蛋白酶消化GDF多肽，包括但不局限于胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或其它任何已知的蛋白酶。然后可以在对这种多肽测定抑制GDF活性的能力之前将它们分离出。在制备该种肽片段之前，为了引发通过免疫应答对内源性GDF的中和作用还可以对此肽进行选择。可以通过筛选该多肽片段引发导致产生GDF抑制性抗体的免疫应答的能力而对该多肽片段进行测定。GDF多肽抑制剂可以是足以抑制GDF活性的任何长度多肽。通常此多肽的长度范围是5-10，10-25，25-40或者40或40个以上氨基酸。在某些优选的实施方案中，该GDF多肽片段的长度至少是5，10，15，20，25，30，35，40或45个氨基酸。
另一方面，本发明的特征在于一种GDF抑制剂，例如一种可能具有或不具有GDF活性的抑制剂，此GDF抑制剂具有如下的一个或几个特征它可以从已通过柱层析分离出其中一种细胞(例如CHO)的培养基中被分离出，此细胞是用含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段的表达质粒稳定转染的细胞；在100℃加热直到10分钟之后它仍保持活性；在还原之后它保持或不保持活性；以及在用6M尿素处理之后它仍保持活性。在一个实施方案中，本发明的特征在于一种在还原和变性凝胶中具有小于70kDa分子量的GDF-8抑制剂。
另一方面，本发明的特征在于一种借助于在此所述的方法发现的GDF抑制剂，例如一种GDF多肽。
另一方面，本发明的特征在于一种包含GDF多肽前功能区或其一部分的GDF抑制剂。在优选的实施方案中，此GDF多肽前功能区或其一部分是糖基化的。
另一方面，本发明的特征在于一种包含GDF多肽变异体的GDF抑制剂。在一个实施方案中，此GDF多肽变异体是半胱氨酸变异体。在另一实施方案中，此GDF多肽变异体是前功能区变异体。还有一个实施方案中，此GDF多肽变异体是翻译后修饰变异体。还有另一个实施方案中，此GDF多肽变异体是位点切割变异体。
在另一方面，本发明的特征在于一种包含分离核酸分子的GDF抑制剂，此核酸分子连接和/或粘附于由编码GDF多肽的基因产生的RNA转录物。在某些实施方案中，此核酸是含有SEQ ID NO1-4任何之一核苷酸序列的核酶。在其它实施方案中，此核酸是含有SEQ ID NOs5-24任何之一核苷酸序列的反义分子。
另一方面，本发明的特征在于一种用于测定GDF活性的测定法，此方法可用于鉴定GDF抑制剂。适合于测定对GDF活性抑制作用的生物测定法包括但不限于检测肌肉特异性酶如肌酸激酶活性的测定法；检测脂肪细胞分化如3T3-L1前-脂肪细胞分化的测定法；DNA复制测定法；以及基于转录作用的测定法。
再一方面，本发明的特征在于一种应用基于蛋白质分泌作用的测定法测定细胞系统中GDF抑制剂的方法。
另一方面，本发明的特征在于几种转基因动物，在这种转基因动物中，编码本发明GDF抑制剂的基因表达含干扰GDF多肽的加工、GDF多肽的分泌、和/或GDF多肽的生物活性。
本发明其它几方面的特征在于将本发明的GDF抑制剂用于例如治疗多种疾病的方法。
从下面的详述和权利要求，本发明的其它特征和有益用途将是显而易见的。
附图简述

图1显示对在230nm测定的组分A和B的离子交换层析图谱(HQ柱)。
图2显示在215nm测定的组分A离子交换层析图谱。插入图表显示用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是20mM磷酸钠盐pH5.0，缓冲液B是20mM磷酸钠盐pH5.0/2M NaCl。
图3显示在215nm测定的组分B离子交换层析图谱。插入图表显示用于洗脱的梯度液，在此缓冲液A是20mM磷酸钠盐pH5.0，缓冲液B是20mM磷酸钠盐pH5.0/2M NaCl。
图4显示对在21-23分钟之间洗脱的组分A的反相层析(C4柱)图谱。也显示了用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是在80％乙腈中的0.1％TFA。
图5显示对在27-29分钟洗脱的组分B的反相层析(C4柱)图谱。也显示了用于洗脱的梯度，在此缓冲液A是0.1％TFA，缓冲液B是在80％乙腈中的0.085％TFA。
图6A和B图解显示组分A抑制GDF-8对细胞增殖的作用。图6A显示如通过BrdU掺入所测定的组分A对G8或肌细胞中DNA合成的作用。图6B显示如通过[3H]-TdR掺入所测定的组分A对水貂肺CCL-64上皮细胞中DNA合成的作用。
图7A和B图解显示通过基于转录的测定法监测的组分A的GDF-8-抑制活性。萤光素酶的表达来源于报道质粒p(CAGA)12-MLP(图7A和7B)。
图8图解显示组分A对GDF-8抑制作用的特异性。
图9图解显示通过基于转录的测定法监测的组分B的GDF-8抑制活性。
图10图解显示组分B对GDF-8抑制作用的特异性。
图11是对鼠、大鼠、人、狒狒、牛、猪、绵羊、鸡、火鸡和斑马鱼GDF-8氨基酸序列顺序的描绘。
图12示意表示不同GDF-8的结构。图12A显示野生型全长度GDF-8的结构。GDF-8在细胞中被加工产生成熟的GDF-8和剩余前-肽。图12B显示带有被取代的切割位点的未断开的突变体。此突变体作为前体分子被分泌。图12C显示独立表达的GDF-8前功能区。
图13显示小鼠GDF-8的核苷酸和氨基酸序列。指示出了为产生GDF-8变异体所导入的突变。切割位点被加上了方框。用三角形标示出了在除去信号序列之后前-功能区的起始和末端。在下面划线指示预测的N-连接的糖基化位点。
图14图解显示GDF-8的前区域可抑制成熟GDF-8的活性。
图15图解显示GDF-8的前功能区对GDF-8抑制作用的特异性。
图16的曲线显示其前功能区对GDF-8活性的剂量依赖性抑制作用。
图17显示预测的人GDF-11(上列)和人GDF-8(下列)氨基酸序列的序列比较。纵线指示同样的氨基酸。图点表示为了使此序列比较最大化所引入的缺口。数字表示相对于N-末端氨基酸的位置。用空框标示假定的蛋白水解加工位点。用阴影框标示C-末端区保守的半胱氨酸残基。
图18显示小鼠GDF-8 mRNA序列中核酶的靶标位点。倒置箭头指示出在小鼠GDF-8mRNA序列中被选择的4个核酶的切割位点。加底线的核苷酸指示与每个核酶中位于催化功能区两侧的序列互补的区域。加方框指示对于GDF-8蛋白的翻译起始和终止密码子。
图19显示4种小鼠GDF-8核酶的核苷酸序列。每个核酶序列被显示在它与之互补的小鼠GDF-8mRNA序列的下面。倒置箭头指示在此GDF-8序列中核酶切割的靶标位点。
图20显示含有在图19中所示、前后排列的4种核酶的DNA盒核苷酸序列及其反向重复序列。加阴影突出4种核酶的序列(SEQ IDNOs1-4)，在下面加箭头线的序列指示反向重复序列。
图21显示所选择的核酶表达构建体。带有反向重复序列的核酶盒被连接进入三种不同的质粒。pGDF8R-1含有小鼠GDF-8翻译起始位点、外置子1、内含子1，以及部分外显子2 2.8kb上游序列，此外显子2来自连接核酶盒上游序列的小鼠GDF-8基因。来自SV40巨大T抗原基因的聚腺苷酸化信号被连接在核酶盒的其它位点上。pMLCR-1含有连接核酶盒上游序列的大鼠肌球蛋白轻链1基因转录起始部位的～1500bp上游序列，以及包含连接核酶盒下游序列的大鼠肌球蛋白轻链基因3′增强子的～900bp片段。pCMVR-1含有连接核酶上游序列的大约500bp的人巨细胞病毒紧连的主要初始基因启动子。Rib1、Rib2、Rib3和Rib4表示编码4种不同核酶的DNA区；带有反向箭头的方框相当于反向重复序列。
图22显示与所示区域内人GDF-8cDNA序列互补的20个寡核苷酸的序列(SEQ ID NOs5-24)。在寡核苷酸序列下面加圆圈的数字指示各个寡核苷酸序列的5′端。
图23显示为了进一步鉴定组分B特征进行的电喷射/电离质谱分析结果。此质谱图显示出由带有29472.0Da分子量的主要成分的600Da分隔的三个峰。
图24图解显示化学修饰的GDF-8前功能区对它抑制成熟GDF-8治疗能力的影响。
图25图解显示从组分B中纯化的GDF-8前功能区对GDF-8诱导A204细胞中报道质粒的作用。图25显示了使用报道质粒p(CAGA)12-MLP所得到的结果。
图26图解显示通过基于肌酸激酶的测定法所测定的，GDF-8和TGF-β1对C2C12和鸡初始成肌细胞肌源性分化的作用。
图27图解显示GDF-8对3T3-L1脂肪细胞内萄萄糖摄入的作用。数据表明在对胰岛素应答时GDF-8抑制葡萄糖摄入3T3-L1细胞中。
图28图解显示组分B体外去糖基化导致丧失其抑制活性。
图29图解显示为了测定QM-7成肌细胞产生的GDF-8复合物的生物活性，而进行的基于转录的报导质粒激活测定法的测定结果。
图30A-B图解显示为了测定来自m-钙蛋白酶处理的QM-7细胞(以WT-GDF-8-F构建体转化的细胞或者对照细胞)上清液的生物活性，而进行的基于转录的报导质粒激活测定法的测定结果。
图31图解显示TGF-β和GDF-8对CCL-64细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图32图解显示TGF-β和GDF-8对R1B细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图33图解显示通过将ALK-5 I型受体重新导入R1B细胞而挽救R1B细胞对TGFβ和GDF-8的应答性。
图34图解显示TGFβ和GDF-8对DR26细胞中萤光素酶报导质粒诱导的作用。
图35图解显示ActRIIB KR表达载体对DR26细胞对GDF-8应答性的影响。
详述本发明提供了几种用于抑制生长分化因子(GDF)蛋白的组合物和方法，以及用于鉴定这种抑制剂的方法。
特别是可以应用多种筛选方法鉴定本发明的GDF抑制剂，这些筛选方法可对来自GDF蛋白如GDF-8和GFD-11的肽，或者对来自产生GDF蛋白的细胞的培养基测定其GDF抑制活性。在一个筛选方法中，是制备GDF肽的片段(即比整个全长度的蛋白质小的、包含GDF蛋白任何部分的肽)并测定其GDF抑制活性。在优选的实施方案中，此片段是来源于GDF蛋白的前区，例如来源于此蛋白前-区(前功能区)的N末端。例如，此片段可以是来源于GDF-8中精氨酸99上游的前功能区的区域(见图11)。例如可根据它诱导产生抗抑制GDF活性的GDF蛋白抗体的能力来选择这种肽。另一种方面如下面所详述的，可以从产生GDF蛋白的细胞的培养基中直接鉴定和分离出GDF抑制剂。例如按照在此所述的研究，以表达GDF-8的CHO细胞的培养基中分离出了二个层析组分，组分A和组分B。
如在此使用的名词“GDF多肽”和“GDF蛋白”包括结构相关性生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员，所有这些成员均具有生理学重要的生长调节和形态发生特征。例如在如下文献中论述了此相关生长因子的家族D.M.Kingsley等(1994)基因与发育，8，133-46；P.A.Hoodless等(1998)微生物学和免疫学现代话题，228，235-72，此文献的内容在此被引入作为参考。TGF-β超家族成员通过异数蛋白激酶受体复合物发送信号。
因此，在此使用的名词“GDF多肽”和“GDF蛋白”是指TGF-β超家族中的蛋白质，包括骨形态发生蛋白(BMPs)、活化素、抑制素、Mullerian抑制物质、神经胶质衍生神经营养因子，以及仍在增加数目的生长和分化因子(GDFs)，包括GDF-8(Myostatin)和GDF-11。
在此使用的名词“GDF抑制剂”包括能够抑制GDF蛋白的活性、表达、加工和/或分泌的任何作用剂，包括但不局限于特异性抑制GDF蛋白作用的肽、肽相似物、核酶、反义寡核苷酸、或小分子。GDF抑制剂可能具有GDF活性，或者优选地是一种不具有GDF活性的GDF抑制剂。
在此使用的名词“GDF-8抑制剂”和“GDF-11抑制剂”包括能够抑制GDF-8或GDF-11活性、表达、加工和/或分泌的任何作用剂，包括但不局限于肽、肽相似物、核酶、反义寡核苷酸、或小分子，这些作用剂特异性抑制GDF-8或GDF-11的作用而优选地保留不损害TGF-β或活化素或者TGF-β超家族其它成员的活性。GDF-8或GDF-11抑制剂可能具有GDF-8或GDF-11活性，或者优选地是不具有GDF-8或GDF-11活性的GDF-8或GDF-11抑制剂。
在此使用的名词“GDF-8或GDF-11活性”包括由GDF-8或GDF-11中介的任何活性。例如已知GDF-8抑制成纤维细胞分化成脂肪细胞，调节肌肉特异性酶如肌酸激酶的产生，以及调节细胞摄取葡萄糖和刺激成肌细胞增殖。因此，可以通过例如测定GDF-8或GDF-11的活性来鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂，如通过如下能力测定的GDF-8或GDF-11活性GDF-8或GDF-11干扰3T3-L1前脂肪细胞(成纤维细胞)变成脂肪细胞分化过程的能力，调节肌肉特异性酶如肌酸激酶活性的能力，调节细胞摄取葡萄糖的能力，或者刺激成肌细胞细胞增殖的能力。
如在此使用的名词“生物测定性”包括为鉴定GDF抑制剂所设计的任何测定方法。此测定法可以是适合于鉴定是在GDF抑制剂可抑制GDF蛋白一种或几种生物功能的体外或体内测定法。适合的生物测定法包括例如DNA复制测定法，基于转录的测定法，肌酸激酶测定法，基于3T3-L1前脂肪细胞分化的测定法，基于3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄取的测定法，以及免疫测定法。
下面的章节将对本发明的各个方面作进一步详细的论述。为了便于说明本发明这些章节均针对GDF-8和GDF-11(二种高度同源的GDF蛋白)的抑制剂。但是本发明(例如下面的论述和测定法)可用于产生和使用对于任何GDF蛋白的抑制剂，因此不应该解释为本发明仅限于GDF-8和GDF-11。I.蛋白抑制剂A.GDF-8和GDF-11蛋白抑制剂1.从在其中已培养了表达GDF-8或GDF-11的细胞的培养基中鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂在一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括获得其中已培养了产生GDF-8或GDF-11的细胞的培养基，以及测定此培养基抑制GDF-8或GDF-11活性的能力，从而鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂。
从其中鉴定了GDF-8或GDF-11抑制剂的培养基可以包含以质粒转染的细胞，此质粒含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段。另一方面，从其中鉴定了GDF-8或GDF-11抑制剂的培养基可以包含产生内源性GDF-8或GDF-11(即天然的GDF-8或GDF-11)的细胞。在此使用的名词“天然蛋白质”包括从天然存在的来源中回收的蛋白质。
产生GDF-8或GDF-11的细胞可以是任何一种原核细胞或真核细胞。例如可在细菌如大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达GDF-8或GDF-11蛋白。对于本领域的技术人员也容易找到其它适合的宿主细胞。
借助于常规的转化或转染技术可以将含有编码GDF-8或GDF-11的插入片段的质粒导入原核或真核细胞。在此使用的名词“转化”和“转染”打算意指用于将外来的核酸(如DNA)导入宿主细胞的各种被认可的人工技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖-介导的转染、脂染法(lipofection)或电穿孔法。可以在Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)和其它实验室手册中找到适合于转化或转染宿主细胞的方法。
关于哺乳动物细胞的稳定转染，已知取决于所使用的表达载体和转染技术，只有小部分细胞可能将外来的DNA整合进入它们的基因组。为了鉴定和选择这些整合组分，通常使一个编码可选择标记(例如对抗菌素的抗性)的基因与所需基因一起被导入宿主细胞。优选的可选择标记包括可赋予对药物如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的标记。编码可选择标记的核酸可以在与编码GDF-8或GDF-11蛋白的相同载体上被导入宿主细胞，或者也可以在单独的载体上被导入。通过药物选择可以鉴别以导入的核酸稳定转染的细胞(例如已掺入可选择标记基因的细胞将存活，而其它的细胞将死亡)。
在此使用的名词“GDF-8”包括所有已知的GDF-8形式，包括但不限于人GDF-8、牛GDF-8、鸡GDF-8、鼠GDF-8、大鼠GDF-8、猪GDF-8、绵羊GDF-8、火鸡GDF-8、狒狒GDF-8和鱼GDF-8。在参考文献McPherron A.C等(1997)美国国家科学院学报，9412457-12461中描述了这些分子，此文献的内容在此被引入作为参考。这些蛋白质的氨基酸序列被显示在图11中。
在此使用的名词“GDF-11”包括所有已知的GDF-11形式，包括但不限于人GDF-11、牛GDF-11、鸡GDF-11、鼠GDF-11、大鼠GDF-11、猪GDF-11、绵羊GDF-11、火鸡GDF-11、狒狒GDF-11和鱼GDF-11。在例如美国专利5,871,935和文献L.W.Gamer等(1999)发育生物学，208，222-232中描述了这些分子，这些文献的内容在此被引入作为参考。GDF-8或GDF-11蛋白氨基酸序列的序列比较被显示在图17中。
应用本领域已知的纯化肽或蛋白质的技术，可以从表达GDF-8或GDF-11的细胞的培养基中纯化和分离出GDF-8或GDF-11抑制剂，这些技术包括离子交换层析、反相层析、凝胶过滤层析、超过滤、电泳、以及用对GDF-8或GDF-11抑制剂，或者对它们的一部分特异性抗体的免疫亲和性纯化法。在一个实施方案中，如在实施例部分所述，是使从表达GDF-8或GDF-11的细胞培养物中得到的培养基经受高效液相层析(HPLC)。
然后如下面所述，可对所得到的样品测定其GDF-8或GDF-11抑制活性。
2.鉴定来自GDF-8或GDF-11的抑制GDF-8或GDF-11活性的肽本发明的另一方面是通过筛选GDF-8或GDF-11片段的抑制活性鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂。可通过各种已知的人工技术产生GDF-8或GDF-11片段。例如可以合成(如化学合成或重组合成)跨越GDF-8或GDF-11序列的特定寡肽(大约10-25个氨基酸长度)，并应用例如在此所述的测定法测定它们抑制GDF-8或GDF-11的能力。可以应用在如下文献中所述的标准技术合成此GDF-8或GDF-11肽片段Bodansky，M.肽合成原理，Springer Verlag，Berlin(1993)和Grant，G.A(ed)合成肽使用者指南，W.H.Freeman和Company，New York(1992)。自动肽合成仪可作为商品购买到(例如Advanced ChemTech 396型；Milligen/Biosearch 9600)。
按另一种方式，可通过应用蛋白酶例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或胃蛋白酶消化天然的或重组产生的GDF-8或GDF-11来产生GDF-8或GDF-11片段。计算机分析法(应用可购买到的软件例如Mac Vector，Omega，PCGene，分子模拟公司)可用于鉴定蛋白水解切割位点。
本发明的GDF-8或GDF-11肽优选地是被分离的。在此使用的“分离”或“纯化的”蛋白质或者其生物活性肽基本上不含细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质，该GDF-8或GDF-11蛋白或肽是从此细胞或组织来源产生的，或者当被化学合成是基本上不含化学前体物或其它化学试剂。措辞“基本上不含细胞物质”包括这样一种GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的制备物，其中的蛋白质或其肽是从分离或重组产生它的细胞的细胞成分中被分离出。在一个实施方案中，措辞“基本上不含细胞物质”包括这样一种GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的制备物，此制备物含有少于大约30％(以干重计)的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质(在此也被称为“污染蛋白”)，较优选地是少于大约20％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质，更加优选地是少于大约10％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质，而最优选地是少于大约5％的非-GDF-8或GDF-11蛋白质或其肽的物质。当此GDF-8或GDF-11蛋白质或其生物活性部分是由重组产生时，优选地它也基本上不含培养基，也就是说，培养基占此蛋白质制备物的体积少于大约20％，较优选地是少于大约10％，而最优选地是少于大约5％。
二步法可用于产生和分离这种蛋白水解切割的GDF-8或GDF-11肽。第一步包括酶促消化此GDF-8或GDF-11蛋白。GDF-8或GDF-11即可作为二聚体从CHO细胞限制的培养基中，作为单体在大肠杆菌或酵母中被产生，也可从天然产生GDF-8或GDF-11的细胞中被分离出。在借助于例如HPLC层析纯化GDF-8或GDF-11的单体或二聚体之后，如下面所述对它们进行酶促消化。如本领域所知道的，在消化过程中被切割的氨基酸取决于在此实验中所使用的特定蛋白酶。例如，如果选择的蛋白酶是胰蛋白酶，切割位点将是精氨酸和赖氨酸。可以使用一种或几种这样的蛋白酶消化GDF-8或GDF-11蛋白。
在消化之后，第二步包括分离由蛋白质消化产生的肽组分。可借助于例如下面所述的高分辨能力的肽分离法完成此步骤。一旦组分被分离，如下面所述，可借助于适当的生物测定法测定它们的GDF-8或GDF-11抑制活性。
蛋白水解或合成的GDF-8或GDF-11片段可以包含例如部分地或完全抑制GDF-8或GDF-11功能所必需数目的氨基酸残基，优选的长度是包含至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多氨基酸。
在一个实施方案中，选择了不含有足够数量T细胞抗原表位用于诱导T细胞介导性免疫应答的肽，以及/或者选择含有足够数量B细胞抗原表位的肽，以便当给予哺乳动物时诱发产生抗体。优选的GDF-8或GDF-11抑制剂不含有足够数量诱导T细胞介导性(例如细胞因子)应答的T细胞抗原表位。但是B细胞表位是符合需要的，可以通过例如下面所论述的测定此肽诱发抗体应答的能力来选择。
应用许多熟知的技术可以鉴定GDF-8或GDF-11片段内的T细胞抗原表位。例如应用算法(参见例如Rothbard，J和Taylor，W.R(1998)EMBO杂志，793-100；Berzofsky，J.A(1989)Philos TransR.Soc.Lond.323535-544)可预测T细胞抗原表位。优选地，应用已知的结合特定氨基酸残基的HLA II类可预测GDF-8或GDF-11蛋白中的人T细胞抗原表位。在如下文献中报导了已成功地被用于预测具有T细胞刺激活性多肽的一种算法Rothbard，第一届病毒学论会，巴士德研究所年刊，pp518-526(1986年12月)；Rothbard和Taylor(1988)Embo杂志，793-100；以及EP0304279。这些文献报导了对一般T细胞模式的判定(算法)，它的统计学显著性和它同已知抗原表位的相关性，以及它在预测多种蛋白质抗原和自身抗原以前未发现的T细胞抗原表位中的成功应用。如在上述文献中报导的T细胞抗原表位的一般模式似乎包含由带电氨基酸残基或甘氨酸组成的，随后是二个疏水性残基的线性模式。已被用于预测以前未确定的蛋白质T细胞抗原表位的其它算法包括由Margalit等(1987)免疫学杂志，1382213-2229报导的算法，它是基于一种双亲性螺旋模型。
用于鉴定T细胞抗原表位的其它方法包括筛选本发明GDF-8或GDF-11抑制肽对人T细胞的刺激活性。可应用一种或几种不同的测定法实现此目的。例如在体外，可通过使本发明的肽与T细胞培养物中呈递合适MHC分子的抗原呈递细胞相接触来测定T细胞刺激活性。将本发明的GDF-8或GDF-11抑制性肽与适合的MHC分子相结合呈递给T细胞，连同必需的共同刺激作用，可具有对诱导产生增加水平的细胞因子，特别白介素-2和白介素-4的T细胞传递信号的作用。取得这种培养物的上清液并测定白介素-2或其它已知的细胞因子。例如可采用白介素-2的几种常规测定法中的任何一种，如美国国家科学院学报861333(1989)中所述的测定法，此文献的全部内容在此被引入作为参考。用于测定干扰素产生的试剂盒也可从Genzyme公司(剑桥，MA)获得。
通常测定T细胞增殖需要测定氚标记胸苷的掺入。通过在体外测定掺入培养细胞复制DNA的3H标记胸苷的量可测量T细胞的增殖。因此，可定量测定DNA合成的速度，并进而定量测定细胞分裂的速度。
应用本领域技术人员熟知的计算机分析程序，可以鉴定位于该蛋白质表面如亲水区及高抗原性区的GDF-8或GDF-11的其它优选片段或具有高度表面机率得分的片段(Hopp和Wood(1983)，分子免疫学，20，483-9，Kyte和Doolittle(1982)，分子生物学杂志，157，105-32，Corrigan和Huang(1992)，生物医学计算机程序，3，163-8)。
其它一些将被测定GDF-8或GDF-11抑制活性的优选GDF-8或GDF-11片段还包含有一种或几种B-细胞抗原表位。通过如下步骤可鉴定这种肽用此肽单独或者与佐剂(如半抗原)组合或连接免疫接种哺乳动物，并测定来自被免疫接种动物血清中的抗-GDF-8或GDF-11抗体。优选的肽产生抑制GDF-8或GDF-11活性的抗-GDF-8或GDF-11抗体。例如，应用在此所述的任何一种GDF-8或GDF-11生物测定法可测定来自被免疫接种动物血清的GDF-8或GDF-11抑制活性。可以用蛋白水解的或合成的GDF-8或GDF-11片段(单独或与半抗原连接)免疫接种合适的受试动物(例如兔、山羊、小鼠或其它的哺乳动物或者脊椎动物)。例如可采用在美国专利NOs 5,422,110；5,837,268；5,708,155；5,723,129和5,849,531中所述的方法(这些专利的内容在此被引入作为参考)。这种致免疫性制备物还可进一步包含一种佐剂如福氏完全或不完全佐剂，或者类似的免疫激活剂。用致免疫性水解蛋白或合成的GDF-8或GDF-11片段的制备物免疫接种合适的受试动物可诱发多克隆抗-GDF-8或GDF-11抗体应答。可借助于标准的技术如使用固定化GDF-8或GDF-11的酶联免疫吸附试验(ELISA)在一段时间内监测被免疫接种受试者体内抗-GDF-8或GDF-11抗体的滴度。随后可应用在此所述的任何生物测定法，测定来自被免疫接种受试者血清的GDF-8或GDF-11抑制活性。
从该哺乳动物(例如从血液中)可分离出定向针对GDF-8或GDF-11的抗体分子，并且借助于熟知的技术如蛋白A层析法可进一步纯化得到IgG组分。可在免疫接种后的适当时间如抗-GDF-8或GDF-11抗体滴度最高时，从此受试动物取得产生抗体的细胞，用于借助于标准的技术如最初由Kohle和Milstein(1957)自然，256495-497)所描述的杂交瘤技术制备例如单克隆抗体(也见Brown等(1981)免疫学杂志，127539-46；Brown等(1980)生物化学杂志，2554980-83；Yeh等(1976)美国国家科学院学报，762927-31；以及Yeh等(1982)国际癌症杂志，2926975)，还可应用EBV-杂交瘤技术(Cole等，(1985)，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Inc.pp77-96)或者trioma技术。产生单克隆抗体杂交瘤的技术也是熟知的(通常可参见R.H.Kenneth，单克隆抗体生物学分析中的新尺度，Plenum出版公司，纽约，(1989)；E.A.Lerner(1981)耶鲁大学生物医学杂志，54387-402；M.L.Gefter等(1977)，体细胞遗传，3231-36)。概括地说，使永生化的细胞系(通常是骨髓瘤细胞)与来自如上所述用GDF-8或GDF-11免疫原免疫接种的哺乳动物的淋巴细胞(通常是脾细胞)融合，然后筛选所形成杂交瘤细胞的培养上清液，以便鉴定产生可结合GDF-8或GDF-11的单克隆抗体的杂交瘤。
为了产生抗-GDF-8或GDF-11单克隆抗体，用于融合淋巴细胞和永生化细胞系的许多已知方案中任何一种都可被采用(见例如G.Galfre等(1977)自然，26655052；Gefter等体细胞遗传，同上；Lerner，耶鲁大学生物医学杂志，同上；Kenneth，单克隆抗体，同上)。而且一般的技术人员都将意识到，还可采用与这些方法不同的许多方法。永生化的细胞系(例如骨髓瘤)通常来源于与此淋巴细胞相同种哺乳动物。例如通过使来自以本发明的致免疫性制备物免疫接种小鼠的淋巴细胞与永生化的小鼠细胞系融合可形成鼠杂交瘤。优选的永生化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，此细胞系对含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基(“HAT培养基”)敏感。多种骨髓瘤细胞系中的任何一种都可以按照标准的技术用作融合配体，例如P3-NS1/1-Ag4-1，P3-x63-Ag8.653或Sp2/O-Ag14骨髓瘤系。这些骨髓瘤系都可从ATCC获得。一般是用聚乙二醇(“PEG”)使HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞融合。然后用HAT培养基选择由融合形成的杂交瘤细胞，此培养基杀死未融合的和未配合成的骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞在几天后也死亡，因为它未被转化)。通过例如应用标准的ELISA试验筛选杂交瘤培养物上清液中可结合GDF-8或GDF-11的抗体检测出产生本发明单克隆抗体的杂交瘤细胞。然后可应用例如在此所述的检测法测定此抗体的GDF-8或GDF-11抑制活性。
本发明的另一方面是，GDF-8肽抑制剂包含全部或一部分GDF-8前-功能区。应用多种表达系统(例如CHO，杆状病毒等)都可产生GDF-8前-功能区或它的一部分。可通过例如应用Bottinger等(1996)PNAS 935877-5882中所述的方法，或者其它任何技术上被认可的肽纯化法纯化被表达的GDF-8前-功能区。另一方面，如在下面实施例中所述，可用例如FLAG或6-His标记该前-功能区。此外，通过切割，例如化学切割天然GDF-8也可产生GDF-8前-功能区或其一部分。而且还可应用在此所述的已知技术化学合成GDF-8前-功能区或其一部分。
在特定的实施方案中，GDF-8抑制剂是一个肽，例如二十五肽，它包括(例如跨越)成熟GDF-8的C-末端。优选地此GDF-8肽长度是大约25个氨基酸，包括或基本上由选自如下的序列组成ANYCSGECEFVFLQKYPHTHLVH(SEQ ID NO25)，KIPAMVVDRCGCS(SEQ ID NO29)和/或LSKLRLETAPNISKDVIRQLLP(SEQ ID NO30)。在另一个实施方案中，该GDF-8抑制剂具有全部或部分上面所鉴定的序列，并且有长度大约20-25，25-30，30-35，35-40或40-45个氨基酸残基。然后可应用在此所述的检测法测定基于这些肽的GDF-8肽抑制剂的GDF-8或GDF-11抑制活性。
在另一个实施方案中，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂是肽、肽相似物或小分子，它们可抑制从GDF-8/前-功能区复合物中释放出成熟的GDF-8蛋白，和/或它们可稳定GDF-8/前-功能区复合物。这类GDF-8和GDF-11抑制剂包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂如m-钙蛋白酶抑制剂。
还有在另一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是(同GDF-8或GDF-11)竞争结合于GDF-8或GDF-11受体的可溶性GDF-8或GDF-11受体，例如可溶性GDF-8或GDF-11受体片段。将在此描述这类可溶性GDF-8或GDF-11受体。
B.抑制GDF-8和GDF-11活性的GDF-8和GDF-11蛋白变异体在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是不具有可检测GDF-8活性的GDF-8或GDF-11蛋白变异体。本发明的GDF-8或GDF-11变异体可能含有野生型GDF-8或GDF-11氨基酸序列的一个或几个保守性或非保守性氨基酸取代、缺失、插入或未成熟的短片段。另一方面，该变异体在GDF-8或GDF-11蛋白活性的关键性残基或关键性区域也可能含有一个或几个保守性或非保守性氨基酸取代、插入或缺失。所形成的GDF-8或GDF-11蛋白变异体将干扰例如GDF-8或GDF-11的加工、分泌或/和它的生物活性，从而起GDF-8或GDF-11抑制剂的作用。
“保守性氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有相似侧链(例如电荷、大小等)的氨基酸残基代替的取代。“非-保守性氨基酸取代”是其中的氨基酸残基被具有不相似侧链(例如电荷、大小等)的氨基酸残基代替的取代。在本领域对具有相似侧链的氨基酸残基家族已有定义。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，带有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，带有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，带有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及带有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
1.切割位点变异体在一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是GDF-8和GDF-11蛋白的优势阴性突变体。属于TGF-β超家族如GDF-8和GDF-11的生长因子通过二个前体分子的二聚体化形成同源二聚体和异源二聚体。这种相互作用对于这些因子的分泌是必不可少的。配体二聚体的激活需要切去羧基端成熟的肽，遗留氨基端前体，并在正确的生理条件下发生。因此，在保守的切割序列中需要激活的突变可导致合成非功能性GDF-8和GDF-11分子。而且，这些突变前体分子的过度表达可导致在竞争性融合中带有内源性未修饰单体的突变GDF-8和GDF-11多肽形成异源二聚体。当GDF-8和GDF-11突变体以高水平表达时，大多数内源性二聚体将由于异源二聚体形成被滴定出，因此，以特异性方式完全阻断活性生长因子如GDF-8和/或GDF-11的分泌。如在下面实施例中所述的，可应用在例如如下文献中所述的技术制备GDF-8和GDF-11优势阴性突变体如切割位点突变体Lopez等(1992)分子细胞生物学，12，1674-1679；Wittbrodt和Rosa(1994)基因与发育，8，1448-1462；Suzuki等(1997)发育生物学，189，112-122；以及Hawley等(1995)基因与发育，9，2923-2935。这些文献的内容在此均被引入作为参考。
2.半胱氨酸变异体在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是在一个或几个关键性半胱氨酸残基包含点突变的GDF-8或GDF-11蛋白，此半胱氨酸残基是包含在例如维持TGF-β家族成员如GDF-8和GDF-11的三级结构的分子内半胱氨酸桥中。例如，保留在所有TGF-β超家族成员中半胱氨酸残基如在GDF-8多肽位置313的半胱氨酸残基可以用不具有相似侧链的氨基酸残基(如上面所述)非保守地代替。如在下面实施例部分所述，应用在如下文献中所述的技术可以制成本发明的半胱氨酸突变McPherron和Lee(1977)自然，387，83-90，以及Kambadur等(1997)基因组研究，7，910-15，这些文献的内容在此均被引入作为参考。
3.前-功能区变异体在另一实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是包含全部或部分GDF-8或GDF-11多肽前-功能区的GDF-8或GDF-11多肽的被修饰形式。如在前面小节和下面实施例部分所述，可应用如下文献中所述技术制备在此被分别称为“前-GDF-8”和“前-GDF-11”的含有GDF-8和GDF-11蛋白前-功能区的抑制剂Bottinger等(1996)PNAS，93，5877-5882以及Gentry和Nash(1990)生物化学，29，6851-6857，这些文献的内容在此均被引入作为参考。本发明的“前-GDF-8”和“前-GDF-11”抑制剂可被用于在此前-功能区来源于其中的相同种动物中，或者在不同种动物中抑制GDF-8或GDF-11活性(例如小鼠前-GDF-8可被用于抑制人GDF-8活性)。在优选的实施方案中，该抑制剂(如前-GDF-8)包含GDF-8前-功能区的N-末端(例如包含在Arg99上游的前-功能区的区域(见图11))。
4.翻译后修饰变异体在进一步的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂包括不含有GDF-8或GDF-11蛋白或肽活性所必需的翻译后修饰的GDF-8或GDF-11蛋白或肽(例如它含有变异的翻译后修饰)。在此使用的名词“变异”包括来源于GDF-8或GDF-11多肽野生型翻译后修饰的翻译后修饰。变异的翻译后修饰包括翻译后修饰的增加或减少，以及不遵循GDF-8或GDF-11多肽翻译后修饰野生型模式的翻译后修饰。在此使用的名词“翻译后修饰”包括在GDF-8或GDF-11多肽已被翻译之后(例如肽键形成已发生之后)它所经受的任何修饰。翻译后修饰的实例包括糖基化、酰化、有限的蛋白质水解、磷酸化和异戊二烯化(isoprenylation)。翻译后修饰对蛋白质的加工、分泌和生物功能有重要的作用。
在优选的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂含有变异的糖基化。例如，本发明的某些GDF-8抑制剂在GDF-8前-功能区内预测的N-连接糖基化位点含有一个突变(见图13)。II.GDF-8和GDF-11核酸抑制剂A.核酶(Ribozymes)在另一个实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是定向针对GDF-8或GDF-11基因转录的核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，它能够切割由于具有互补区它们可对其杂交的单链核酸如mRNA。因此，本发明的核酶(例如在Haselhoff和Gerlach(1988)自然，334585-591中所述的锤头结构核酶)可用于催化切割GDF-8或GDF-11mRNA转录物，从而抑制GDF-8或GDF-11mRNA的翻译。根据例如在如下文献中所述的GDF-8或GDF-11cDNA核苷酸序列，可以设计对GDF-8或GDF-11-编码核酸具有特异性的核酶McPherron A.C等(1997)国家科学院学报，9412457-12461和美国专利申请系列号08/706958，这些文献的内容在此均被引入作为参考。例如可以构建其中活性位点的核苷酸序列与GDF-8-或GDF-11-编码mRNA中待切割核苷酸序列互补的四膜虫L-19IVS RNA的衍生物(见例如Cech等，美国专利No.4,987,071；和Cech等，美国专利No.5,116,742)。另外，GDF-8或GDF-11mRNA可用于从RNA分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(见例如Bartel，D.和Szostak，J.W(1993)科学，2611411-1418)。
另一方面，GDF-8或GDF-11抑制剂核酶还可以包含与GDF-8或GDF-11基因的一个或几个调节区(例如GDF-8或GDF-11启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，从而形成阻碍靶细胞内GDF-8或GDF-11基因转录的三联螺旋结构(在例如Helenc.C(1991)抗癌药物研究6(6)569-84；Helenc，C等(1992)纽约科学院年报，66027-36；以及Maher，L.J(1992)生物测定法，14(12)807-15中描述了用于此目的的技术)。
在特定的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是包含在SEQ ID NOs1-4中所提供的四个核苷酸序列之一的核酶。本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂还包括具有与在SEQ ID NOs1-4中列举的抑制GDF-8或GDF-11表达的核苷酸序列至少70％，80％，85％，90％，95％，98％，或更多同一性的核苷酸序列的核酶。为了确定二个核酸序列同一性的百分数，将这些序列排成直线以便于最佳比较的目的(例如为了最佳排列可在第一和第二核酸序列的一个或二个序列中导入缺口，并且为了比较的目的对非-同源性序列可忽略不计)。在优选的实施方案中，为比较的目的而排列的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选地是至少40％，较优选地是至少50％，更优选地是至少60％，而更加优选地是至少70％、80％或90％。然后将在对应核苷酸位置的核苷酸作比较。当第一序列中的一个位置被与第二序列中对应位置相同的核苷酸占据时，那未该分子在此位置是相同的(在此使用的核酸“同一性”等同于核酸的“同源性”)。考虑到为了此二序列的最佳排列需要引入的缺口数和每个缺口的长度，二个序列之间同一性百分数是二序列共有的相同位置数的函数。
应用一个计算公式可实现二个序列间的序列比较和确定同一性百分数。在优选的实施方案中，是应用GCG软件包(可在http//www.gcg.com获得)中的GAP程序确定二个核苷酸序列之间的同一性百分数，使用NWSgapdna.CMP矩阵以及缺口权重40、50、60、70或80，和长度权重1、2、3、4、5或6。在另一实施方案中，是应用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，411-17(1989))的公式确定二个核苷酸序列之间的同一性百分数，此算法已被编入ALIGN程序(版本2.0)，使用PAM120权重残数表，一个缺口长度补偿为12，一个缺口补偿为4。
B.GDF-8和GDF-11反义寡核苷酸另一方面，本发明提供了以分离的反义核酸分子形式存在的GDF-8或GDF-11抑制剂。“反义”核酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补的核苷酸序列，例如与双链cDNA分子编码链互补的，或者与mRNA序列互补的核苷酸序列。因此，反义核酸可同有义核酸杂交结合。本发明的反义核酸可以是与整个GDF-8或GDF-11编码链，或者与其一部分互补。在一个实施方案中，GDF-8或GDF-11反义核酸是对编码GDF-8或GDF-11核苷酸序列编码区反义的。名词“编码区”指包含将被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸区域。在另一实施方案中，反义核酸是对编码GDF-8或GDF-11的核苷酸序列非编码区反义的。名词“非编码区”指编码区二侧不被翻译成氨基酸的5′和3′序列(即也被称为5′和3′非翻译区)。
基于已知的编码GDF-8和GDF-11的核苷酸序列，按照Watson和Crick碱基配对原则可以设计本发明的反义核酸。此反义核酸分子可以是与GDF-8或GDF-11 mRNA的整个编码区互补的，但通常是仅对GDF-8或GDF-11 mRNA的一部分编码区或非编码区反义的寡核苷酸。例如，此反义寡核苷酸可以是与GDF-8或GDF-11mRNA翻译起始位点周围的区域互补的。适合的反义寡核苷酸是例如大约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的长度。按照本领域已知程序，应用化学合成和酶促连接反应可构建本发明适合的反义GDF-8或GDF-11抑制剂。例如可使用天然存在的核苷酸，或者使用为增加分子生物学稳定性或为增加反义和有义核酸之间形成的双螺旋物理稳定性而设计的各种修饰的核苷酸，化学合成反义核酸(如反义寡核苷酸)，例如可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可用于形成反义核酸的被修饰核苷酸的实例包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胺嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿苷、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine次黄苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、拟尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)W、和2，6-二氨基嘌呤。另一方面，还可应用核酸已按反义取向亚克隆进入其中的表达载体以生物学方法产生反义核酸(也就是说，从插入核酸片段转录的RNA将是对所需靶标核酸反义取向的，下面的小节中将进一步论述)。
通常是将本发明的反义GDF-8或GDF-11抑制剂对受试者给药，或者使其在原位产生，以致使它们可同编码GDF-8或GDF-11多肽的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而例如通过抑制转录和/或翻译而抑制该多肽的表达。这种杂交可以是通过常规的核苷酸互补形成稳定的双螺旋，或者例如在结合于DNA双螺旋的反义核酸分子的情况下是通过双螺旋主槽内的特异性相互作用。给予本发明反义核酸分子的途径包括在组织部位直接注射。另外可以修饰反义核酸分子使之对准选定的细胞，然后通过全身性给药。例如，为了全身给药，可以如此修饰反义GDF-8或GDF-11分子以致于它们能特异性地结合于在所选定细胞表面表达的受体或抗原，例如通过将此反义核酸分子连接于与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。还可以使用本领域已知的载体来投递这种反义GDF-8或GDF-11核酸分子(例如这种表达载体被抄录成定向针对GDF-8或GDF-11 mRNA的反义mRNA)。为了使细胞内达到足够的反义GDF-8或GDF-11分子浓度，优选的载体结构是其中的反义GDF-8或GDF-11核酸分子被置于强启动子如pol II或pol III启动子的控制之下。
在再一个实施方案中，本发明的反义GDF-8或GDF-11抑制剂包括α-异头核酸分子。α-异头核酸分子形成带有互补RNA的特定双链杂交体，与通常的β-单位相反，其中的链是相互平行排列(Gaultier等(1987)核酸研究，156625-6641)。该反义核酸分子还可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)核酸研究，156131-6148)或嵌合的RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS通讯，215327-330)。
在特别优选的实施方案中，本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂是含有在SEQ ID NOs5-24中列举的205个核苷酸序列之一的反义寡核苷酸。III.测定其抑制作用的GDF-8或GDF-11测定法可应用各种适当的测定对GDF-8或GDF-11活性抑制作用的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。优选地此抑制作用是特异性的。即GDF-8抑制剂可特异性地抑制GDF-8蛋白而不影响其它蛋白质的活性，GDF-11抑制剂可特异性地抑制GDF-11蛋白而不影响其它蛋白质的活性。在某些实施方案中GDF-8抑制剂也能够抑制GDF-11的活性，GDF-11抑制剂也能够抑制GDF-8的活性。
在此使用的名词“测定法”包括为鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂而设计的任何检测法。这种测定法可以是适合于鉴定是否该GDF-8或GDF-11抑制剂影响例如下调GDF-8或GDF-11的一种或几种生物功能的体外或体内测定法。适合的测定法包括例如DNA复制测定法、基于转录的测定法、肌酸激酶测定法、基于3T3-L1前脂肪细胞分化的测定法、基于3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄入控制的测定法以及免疫学测定法，所有这些方法都将在下面的小节II和随后的实施例中描述。用于鉴定GDF-8或GDF-11抑制剂的肌酸激酶生物测定法GDF-8和GDF-11调节肌肉特异性酶肌酸激酶的蛋白质水平，因此调节它的活性。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是可以在成肌细胞，如小鼠骨骼肌成肌细胞系CIC12或从11天的鸡胚中分离的鸡初始成肌细胞中实施肌酸激酶测定法。为了测定此抑制剂调节肌酸激酶活性的能力，通常在48孔培养板中培养细胞，其中含血清的培养基可保持细胞不分化。当已达到70％汇合时将培养基改变成1％血清，这样使细胞能够分化并能够表达肌酸激酶。在改变培养基时，对某些孔加入可能的GDF-8或GDF-11抑制性组分，某些时间之后加入GDF-8或GDF-11本身。将细胞返回培养箱中再培养2-3天的时间。最后使细胞裂解、使用可购买到的试剂盒(通过Sigms.St Louis，MO获得)测定细胞裂解中肌酸激酶的活性。基于3T3-L1前-脂肪细胞分化的测定法GDF-8和GDF-11干扰3T3-L1前-脂肪细胞(成纤维细胞)分化成脂肪细胞的过程。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是可以按如下方式实施本发明的生物测定。培养3T3-L1前-脂肪细胞使达到汇合，随后按如下步骤通过连续地取代它们的含血清DMEM培养基可实现分化DMEM+血清+甲基异丁基黄嘌呤+地塞米松+胰岛素培养2天，DMEM+血清+胰岛素再培养2天，DMEM+血清再培养3天(Spiegelman等(1993)生物化学杂志，268，6823-6826)。可在分化开始时加入GDF-8和可能的抑制剂，并在每次再进行培养基改变时再加入一次。可通过各种途径测定脂肪细胞分化的程度，例如通过观察评估前-脂肪细胞中脂滴的含量，或者通过使用来自Sigma(St Louis，MO)三甘油酯(Gro-Trinder)试剂盒，按照厂商说明书定量测定细胞裂解液中甘油/三甘油酯的含量。基干3T3-L1脂肪细胞中葡萄糖摄入控制的测定法GDF-8和GDF-11调节脂肪细胞中葡萄糖摄入的控制。GDF-8或GDF-11的这种作用可用于筛选可能的GDF-8或GDF-11抑制剂。特别是按照上面所述的方案可诱导3T3-L1前-脂肪细胞充分地分化。随后进行葡萄糖转运测定。简要地说，在分化之后将培养基改变成无血清DMEM，并用GDF-8或GDF-11抑制剂以及GDF-8或GDF-11处理细胞，持续从2小时至3天的不同时间。随之将细胞转移至低葡萄糖，无血清的DMEM培养基(无辅助因子和抑制剂)中4小时。然后用Ringer/Krebs液洗细胞2次，并对它们加入胰岛素(0.01-1μM)作用5-20分钟。洗去胰岛素2次，以在Ringer缓冲液中1μCi/ml的最后浓度加入氚标记(放射活性的)脱氧葡萄糖(NENDupont)。使葡萄糖摄取持续进行5-10分钟，然后用过量的Krebs液洗细胞，使细胞裂解，通过对细胞裂解液作闪烁计数测定放射活性葡萄糖的摄入量。DNA复制测定法应用DNA复制测定法也可以测定本发明的GDF-8和GDF-11抑制剂。这种生物测定法是以细胞为基础的生长测定法，可以在对GDF-8或GDF-11敏感的任何细胞类型中进行。在这种类型的测定中，DNA复制，从而其增殖，通过使溴代-脱氧尿苷(BrdU)或氚化胸苷([3H]-TdR)标记掺入此DNA中可被精确地测定。可使用几种细胞系进行这种生物测定，包括但不局限于G8小鼠骨骼肌成肌细胞、C2C12小鼠成肌细胞和貂肺上皮细胞系、CCL-64以及它的突变体衍生物。
简要地说是用适合的培养条件在培养板内培养细胞。例如G8成肌细胞是在以0.1％明胶(Sigma)包被的96-孔培养板中培养，而CCL-64细胞是在未包被的培养板中培养。细胞以10×103个细胞/孔的密度在含有0.1％w/v BSA的无血清DMEM培养基中培养。第二天除去原培养基，以新鲜培养基代替。加入有关的抑制性组分，并将细胞返回培养箱培养60分钟，然后对它们加入生长因子(GDF-8、活化素等)。在另一实施方案中，可使抑制性组分与生长因子在室温下混合30分钟-2小时，便于抑制剂-配体相互作用，然后将此混合液施加于细胞上。对于G8成肌细胞，是在加入待测因子之后24小时加入适当的标记，并允许掺入过程再持续进行24小时。对于CCL-64细胞，是在加入待测因子12小时之后加入适当的标记，并允许掺入过程再持续进行4小时。当BrdU被用作标记时，使用购得的试剂盒(Boehringer-Mannheim)按照厂商的说明书手册最后固定和处理细胞。对掺入的BrdU作比色测定。当用[3H]-胸苷(NEN-Dupont)作标记时，用10％三氯乙酸洗细胞2次，用0.3N NaOH提取放射活性并通过闪烁计数测定。基于转录的测定法在另一实施方案中，可在任何一种包括但不局限于G8成肌细胞、C2C12成肌细胞、CCL-64貂肺上皮细胞和A204人杆状肌肉瘤细胞的GDF-8或GDF-11敏感细胞系中，应用基于转录的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。
对GDF-8或GDF-11有应答的人工报导质粒可用于这种类型的测定。例如，在此测定法中可使用p3TP-Lux(例如在Wrana等(1992)细胞，71，1003-14中所描述的)和p(CAGA)12-MLP(例如在Dennler等(1998)EMBO杂志，17，3091-3100中所描述的)。不论在p3TP-Lux和在p(CAGA)12-MLP中，通过对TGF-β家族成员有应答的最小人工启动子都可驱动萤光素酶基因转录(因此驱动其活性)。因此，细胞裂解液中萤光素酶活性与所施加生长因子对细胞的刺激作用程度呈线性相关。
简要地说，用48孔培养板，在以10％胎牛血清、抗菌素和L-谷氨酰胺补充的适当培养基(例如对CCL-64用DMEM，对A204用McCoy氏培养基)中培养细胞。在达到80％细胞汇合时，按照厂商的说明书用FuGENE-6(Boehringer-Mannheim)转染细胞，以便促进质粒的摄入。用如下二种质粒的混合质粒瞬时转染细胞监测转染效果的pSV-β-gal质粒和二种萤光素酶报导质粒中的一种。在与此转染作用剂共同温育过夜之后，用含有0.1％BSA的适当无血清培养基洗细胞2次。然后加入假定的抑制性因子，将细胞返回培养箱培养60分钟。在此培养结束时可加入如下因子从表达GDF-8的CHO细胞条件化培养基中得到的重组人Myostatin/GDF-8，人TGF-β1(R&D Biosystems，Minneapolis)和来自表达活化素βA的CHO细胞的浓缩条件化培养基。
在另一实施方案中，在室温下将假定的抑制剂同GDF-8、GDF-11、或其它配体混合30分钟，然后将此混合物加在该接受细胞上。培育6小时后使细胞裂解，使用购自Tropix公司的双光萤光素酶测定试剂盒可在同一样品内测定萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性。活性以相对萤光素酶单位(RLU)表示，即萤光素酶活性被校正为由在相同样品内测定的相应β-半乳糖苷酶活性给出的转染效率。基于蛋白质分泌的测定法在另一实施方案中，可应用基于蛋白质分泌的测定法鉴定本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂。简要地说，可将编码GDF-8或GDF-11抑制剂的构建体(例如优势的阴性突变体、半胱氨酸突变体、前-功能区变异体和翻译后修饰变异体)与产生野生型GDF-8或GDF-11的构建体一起导入或共导入肌肉细胞系如QM7和RD。随后可借助于例如蛋白质印迹分析法测定此共转染细胞产生和分泌成熟GDF-8或GDF-11的能力。然后可以挑选出抑制成熟GDF-8或GDF-11产生和/或分泌的GDF-8或GDF-11抑制剂。IV.GDF-8或GDF-11抑制剂的用途另一方面，本发明提供了通过在此所述方法鉴定的GDF-8或GDF-11抑制剂，还有组合物如药剂组合物，以及应用这抑制剂的方法。通过在此所述方法鉴定的GDF-8或GDF-11抑制剂可被用于为治疗目的调节GDF-8或GDF-11的表达或其活性。在例证性实施方案中，使细胞与GDF-8或GDF-11抑制剂接触，这种抑制剂可调节与此细胞有关的一种或几种GDF-8或GDF-11蛋白质的活性。这种接触可以在体外实现(例如通过与GDF-8或GDF-11抑制剂一起共培养此细胞)，也可以在体内实现(例如对受试者给予GDF-8或GDF-11抑制剂)，或者在卵内实现(例如通过将GDF-8或GDF-11抑制剂注射进卵内)。应用例如下面文献的技术可如在此所述实现卵注射H.Kocamis等(1998)家禽学，77，1913-1919；或P.A.Johnston等(1997)家禽学，76，165-178；C.E.Dean等(1993)生长、发育与衰老，57，59-72。
因此，本发明进一步提供了治疗受一些疾病或失调折磨的个体的方法，这种疾病或失调是以GDF-8或GDF-11蛋白或核酸分子的异常表达或异常活性为特征，例如与肌肉有关的疾病。在GDF-8或GDF-11被异常上调的情况下，和/或在降低GDF-8或GDF-11活性很可能具有有利作用的情况下，所希望的是抑制GDF-8或GDF-11活性。使用本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可治疗的病症包括例如与肌肉有关的病症如癌症、肌肉营养不良、脊髓损伤、损伤性伤害、充血阻塞性肺部疾病、AIDS或恶病质。此外，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂还可用于治疗肥胖及有关的失调，或者治疗与脂肪细胞异常增殖有关的失调。
在优选的实施方案中，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂被用于治疗糖尿病、肥胖和与肥胖有关的失调。例如，本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可用于调节受试者体内葡萄糖的转运，例如通过增加受试者体内葡萄糖转运体GLUT4的活性。
本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂还可以进一步用于降低受试者体内GDF-8或GDF-11的活性。在此使用的名词“受试者”包括表达GDF-8或GDF-11的任何动物，优选的是哺乳动物。在优选的实施方案中受试者是脊椎动物。在更加优选的实施方案中，此脊椎动物是鸡、火鸡、猪、母牛、小鼠、大鼠、兔、山羊、鱼、或人。例如本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂可用于增加受试者如鸡的肌肉容量。
可将本发明的GDF-8或GDF-11抑制剂掺入适合于给药的药剂组合物。这种组合物通常包含GDF-8或GDF-11抑制剂和药剂学允许的载体。在此使用的措辞“药剂学允许的载体”试图包括与药剂给药相适应的任何溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸水延缓剂等。这些基质和作用剂对药剂活性成分的用途是本领域熟知的。除去与GDF-8或GDF-11抑制剂不相容的任何常规基质或作用剂之外，仍打算将常规基质或作用剂用于该组合物。还可将补充的活性化合物掺入此组合物。
本发明的药剂组合物被配制成与其计划的给药途径相适应。给途径包括例如非经肠道给药如静脉内给药、皮内给药、皮下给药、口服(如吸入)给药、透皮(局部)给药、透粘膜给药和直肠给药。用于注射、皮内、或皮下给药的溶液或悬液可包括如下成分无菌稀释剂如注射用水、生理盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它的合成溶剂；抗菌剂如苯甲酰基醇或甲基parabens；抗氧化剂如抗坏血酸或硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及渗透调节剂如氯化钠或葡萄糖，pH可用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。注射剂可被封装在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器、或多剂量药瓶内。
适合于注射使用的药剂组合物包括无菌的水溶液(当是水可溶性时)或水分散体，以及用于临时配制成无菌注射液或分散体的无菌粉末。用于静脉内给药的适合载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下此组合物都必须是无菌的，并且应该是易于以可注射状态存在的流质。在生产和贮存条件下它必须是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。此载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、乙醇、多羟基化合物(甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，以及它们的适合混合液。例如借助于如下方法可保持其适当的流动性使用包衣如卵磷脂、在分散体的情况下保持所需的颗粒大小，以及使用表面活性剂。用各种抗菌剂和抗真菌剂可达到防止微生物作用的目的，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在很多情况下，最好是在组合物内包含等渗剂例如糖、多元醇如manitol、山梨醇、氯化钠。通过在组合物内包含延缓吸收剂如单硬脂酸铝和明胶可引起注射的组合物延长吸收时间。
通过将所需量GDF-8或GDF-11抑制剂在适当的溶剂内同上面列举的一种或几种组合成分相混合可制备成无菌注射液，需要时可作过滤除菌。分散体的制备通常是将GDF-8或GDF-11抑制剂掺入含有碱性分散基质和上面列举的其它所需成分的无菌赋形剂中。对于用于配制无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这样产生的粉末剂包含活性成分加来自其以前的无菌滤液中的任何所需添加成分。
口服组合物通常包含情性稀释剂或可食用的载体。可以将它们封装在明胶胶囊内或压制成片剂。为便于口服治疗给药的目的，可使GDF-8或GDF-11抑制剂同赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊剂的形式使用。使用液体载体也可以制备口服组合物用作口内洗液，此时液体载体内的化合物被口服使用，漱口、被吐出或被吞咽。作为组合物的一部分还可包含药剂学相容的结合剂和/或佐剂材料。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含任何如下成分或类似特性的化合物结合剂