专利名称：具有生物活性生长素纳米粒的制备方法基因重组技术用于治疗蛋白的表达和生产的20多年以来，到目前为止，已有30 多个蛋白药物产品投入临床使用，近200个在审批和研发过程中，涌现出一批诸如安进 (Amgen)、基因技术(Genentech)等一批新的大型医药公司。相对于蛋白大分子药物本身的 快速发展，其剂型技术进展缓慢。一方面，蛋白大分子药物口服不吸收、体内半衰期短，需要 注射给药；另一方面，许多何尔蒙、细胞因子类的蛋白药物药物治疗周期长，长期而频繁地 注射成为必须，也影响患者顺应性的主要原因。缓释蛋白药物的剂型的研发，由于在制备纳 米粒过程导致活性的损失诸如W/0/W法等。发展制备具有活性的纳米粒势在必行。而葡聚 糖和PEG是常用来蛋白药物的冻干保护剂和分离纯化蛋白的试剂。经过对现有技术的检索发现，Stenekes等人利用修饰的葡聚糖制备蛋白缓释微 球的报道，如 Stenekes. R. J. H. , Franssen. 0. , van Bomme 1. Ε. Μ. G. , Crommelin. J. A. D., Hennink. W. E.在国际药剂学杂志上发表了 The use of aqueouse PEG/dextran phase separation for the preparation of dextran microspheres.〈〈禾[!用聚乙二醇禾口匿 分离法制备微球》(International Journal ofPharmaceutics，1999，183 :29-32)，但该技 术用到强氧化剂如过硫酸钾、过硫酸铵等，及聚合物引发剂使葡聚糖分子发生交联，这些难 免不与蛋白发生反应，导致蛋白的失活或增加免疫原性，将蛋白分子用多价金属离子交联 沉淀形成蛋白颗粒后再行微囊包。金属离子固化保护蛋白目前只报道对少数蛋白质有效如 生长素，把生长素和醋酸锌按照摩尔比1 6混和后通过喷雾出液滴在液氮速冻形成粉末， 再悬浮在PLGA溶液中喷雾到液氮中冷冻干燥得微球。或将蛋白及其保护剂通过喷雾干燥 法制成固体颗粒。现有技术中尚无在水溶性的环境下，不用喷雾干燥在高分子水溶液制备 蛋白质-金属纳米粒方法，尤其是重组人生长素的纳米粒制备方法。
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种具有生物活性生长素纳米粒的制 备方法，制备得到的纳米粒的表面光滑圆整，均勻度好，粒径可以根据需要进行调控从IOnm 到lOOOnm，径距分布较窄，其冻干粉剂为白色细腻，再分散性良好。可以运用到各种药物缓 释装置的制备及疫苗的佐剂。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过将重组人生长素加到葡聚糖溶 液、聚乙二醇(PEG)溶液和锌盐混合分散为混和，然后将混和好的样品置于-10-196°C进行 预冻，通过物理方式除去水相，用有机溶剂溶解连续相PEG离心除去连续相并挥发干有机 溶剂收集得到具有生物活性生长素纳米粒，其粒径为lOnm-lOOOnm。所述的混合分散是指采用摇晃、超声、勻质化、涡旋或离心中的任一多种组合的3方式进行分散；所述的离心是指采用离心机在8000 12000rpm环境下处理5min并去除上清液，重复该处理三次；所述的预冻的时间大于等于8小时；所述的物理方式是指真空干燥M小时；所述的葡聚糖溶液是指质量百分比浓度为0. 5 20%的分子量为5000到 5000000的葡萄糖水溶液；所述的聚乙二醇溶液是指质量百分比浓度为1 20%的分子量为4000到22000 的聚乙二醇水溶液；所述的锌盐溶液是指质量百分比浓度为0. 01 4%的醋酸锌[Zn(AC)2 · 2H20]、 氯化锌(ZnCl2)、硫酸锌(ZnSO4)或葡萄糖酸锌的水溶液；所述的重组人生长素的质量百分比浓度为0. 5 10%。本发明通过上述方法制备得到的具有生物活性生长素纳米粒，其表面光滑圆整， 均勻度好，粒径从IOnm到IOOOnm可控。本发明的有益效果是本发明选择了合适的连续相PEG相和分散相，可以在完全 无有机溶剂、不加表面活性剂制备纳米粒的方法，且不用喷雾冷冻干燥，大大的节约成本， 而且制备的颗粒比喷雾干燥的结实致密。在发展口服蛋白、多肽制剂、疫苗制剂有着广泛的 应用前景，同时在细胞生物活性验证这种纳米颗粒具有良好的保持生长素的活性。与市场 上的注射剂的药效等同，但储存条件比市场上的要求低，如目前市场上的要求4°C保存，而 的室温保存两年，活性保持99%以上，而对照组的为80%。图1为实施例1的纳米粒的电镜示意图。图2为实施例1的纳米粒的粒径分布示意图。图3为实施例2的纳米粒的电镜示意图。图4为实施例2的纳米粒的粒径分布示意图。图5为对照组的电镜示意图。图6为实施例3的纳米粒的电镜示意图。图7为实施例4的纳米粒的电镜示意图。图8为实施例5的纳米粒的电镜示意图。

③把完成②的混悬液或溶液在冰箱预冻M小时；④把完成③的样品冻干；⑤把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑥把⑤干燥即得成品；⑦然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图1)显示粒径较 均勻约200nm-500nm，同时也用粒度仪测试，也得到验证(图2)，细胞活性显示与对照组的 活性高20%与用来制备的原料药的活性一致(新买的原料药)。实施例2①取重量百分比浓度为5%重组人生长素0. 2mL滴到2mL的重量百分比浓度为 5%的分子量为6000的PEG水溶液和0. 5%分子量为500，000的葡聚糖中，混勻；②取0. OlmL的重量百分比浓度为Si(AC)2 ·2Η20缓慢的滴加到①中混勻备用；③把完成②的混悬液或溶液在_80°C冰箱预冻10小时；④把完成③的样品冻干；⑤把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑥把⑤干燥即得成品；⑦然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图3)显示粒径较 均勻约200nm-400nm，同时也用粒度仪测试，也得到验证(图4)，细胞活性与对照组的活性 高30%与用来制备的原料药的活性一致(新买的原料药)。实施例3取重量百分比浓度为1 %重组人生长素0. 2mL滴到2mL的重量百分比浓度为5% 的分子量为4000的PEG和0. 5%分子量为500，000的葡聚糖水溶液中，混勻；①取0. ImL的重量百分比浓度为0. 1% Zn(AC)2 · 2H20缓慢的滴加到①中混勻备 用；②把完成②的混悬液或溶液在液氮中(_196°C )冷冻8小时；③把完成③的样品冻干；④把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑤把⑤干燥即得成品；⑥然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图6)显示粒径较 均勻，细胞活性与对照组的活性高25%与用来制备的原料药的活性一致(新买的原料药)。实施例4①取重量百分比浓度为0. 01%重组人生长素0. 2mL滴到2mL的重量百分比浓度为 20%的分子量为4000的PEG水溶液和0. 5%分子量为5000，000的葡聚糖水溶液中，混勻；②取0. ImL的重量百分比浓度为0. 01% Zn(AC)2 · 2H20缓慢的滴加到①中混勻备用；③把完成②的混悬液或溶液在-10冰箱预冻M小时；④把完成③的样品冻干；⑤把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑥把⑤干燥即得成品；⑦然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图7)显示粒径较 均勻约10nm-20nm，，细胞活性与对照组的活性高30%与用来制备的原料药的活性一致(新 买的原料药)。实施例5①取重量百分比浓度为0. 01%重组人生长素0. 2mL滴到2mL的重量百分比浓度为 5%的分子量为6，000的PEG水溶液和分子量为50，000的葡聚糖水溶液中，混勻；②取0. ImL的重量百分比浓度为0. 01% Zn(AC)2 · 2H20缓慢的滴加到①中混勻备 用；③把完成②的混悬液或溶液在冰箱冷冻M小时；④把完成③的样品冻干；⑤把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑥把⑤干燥即得成品；⑦然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图8)显示粒径较 均勻约10nm-20nm，细胞活性与对照组的活性高与用来制备的原料药的活性一致(新 买的原料药)。实施例6①取重量百分比浓度为0. 01%重组人生长素0. 2mL滴到2mL的重量百分比浓度为 20%的分子量为22，000的PEG水溶液和20%的分子量为5000的葡聚糖水溶液中，混勻；②取0. ImL的重量百分比浓度为0. 01% ZnCl缓慢的滴加到①中混勻备用；③把完成②的混悬液或溶液在_80°C冰箱预冻10小时；④把完成③的样品冻干；⑤把完成④的冻干样品用10_20mL的二氯甲烷、乙酸乙酯或乙腈洗涤三次，并离 心除去上清，收集下面的固体；⑥把⑤干燥即得成品；⑦然后放在室温和湿度为30%的环境下保存两年，取出用细胞测定其生物活性；通过上述方法制备的重组人生长素的纳米颗粒的扫描电镜(如图9)显示粒径较 均勻约30nm-50nm，细胞活性与对照组的活性高与用来制备的原料药的活性一致(新 买的原料药)。


一种水溶性纳米材料技术领域的具有生物活性生长素纳米粒的制备方法，通过将重组人生长素加到葡聚糖溶液、聚乙二醇(PEG)溶液和锌盐混合分散为混和，然后将混和好的样品置于-10-196℃进行预冻，通过物理方式除去水相，用有机溶剂溶解连续相PEG离心除去连续相并挥发干有机溶剂收集得到具有生物活性生长素纳米粒，其粒径为10nm-1000nm且径距分布较窄。本发明制备得到的纳米粒的表面光滑圆整，均匀度好，其冻干粉剂为白色细腻，再分散性良好，可以运用到各种药物缓释装置的制备及疫苗的佐剂。