专利名称：角质细胞生长因子－2制剂的制作方法本发明的领域本发明涉及角质细胞生长因子-2(KGF-2)的液体和冻干制剂及其衍生物。本发明还涉及KGF-2的制剂，尤其是可用于需要软组织生长和再生之适应征的治疗用途的局部和可注射的制剂。相关领域成纤维细胞生长因子家族曾以参与软组织生长和再生的一个大家族的生长因子出现。它目前包括在蛋白质水平上享有不同同源性的几个成员，和除了一个例外之外，似乎具有类似广泛的促有丝分裂谱，即，促进多种多样的中胚层和神经外胚层起源的细胞增生和/或促进血管形成。通过序列同源性或因子纯化和克隆，KGF原先被鉴定为FGF的一个家族成员。角质细胞生长因子(KGF)从培养的老鼠角质细胞系中作为一种分裂素分离出来(Rubin，J.S.等，美国国家科学院院报86802-806(1989))。不像其它的FGF家族成员，它对间质来源的细胞很少有活性，但刺激上皮细胞的生长。角质细胞生长因子通过来源于皮肤和胎儿肺脏的成纤维细胞产生(Rubin等，(1989))。角质细胞生长因子mRNA被发现在成年人的肾，结肠和肠骨中表达，但不在大脑或者肺脏中表达(Finch，P.W.等，科学245752-755/(1989))。KGF显示出FGF蛋白质家族内的保守区。KGF以高亲和性与FGF-2受体结合。消弱的创伤愈合是一个重大的病态源，可以导致一些并发症，如开裂，吻合崩溃和非治愈的创伤。在正常的个体中，创伤愈合完成简单。相反，削弱的愈合与几个疾病状况相联系，如糖尿病，感染，免疫抑制，肥胖症，以及营养不良(Cruse，P.J.和Foord，R.，Arch.Surg.107206(1973)；Schrock，T.R.等，Ann.Surg.177513(1973)；Poole，G.U.，Jr.，外科97631(1985)；Irvin，G.L.等，Am.Surg.51418(1985))。创伤修复是复杂的相互作用和生物学病变过程的结果。在正常的创伤愈合中描述了三个阶段急性炎症期，胞外基质和胶原合成，以及模型重建(Peacock，E.E.，Jr.，创伤修复，第二版，WB Saunders，费城(1984))。该过程牵涉到角质细胞，成纤维细胞和炎症细胞在创伤位点的相互作用。理想的是研制能够促进和增加软组织生长和再生的药物组合物的多肽制剂，该药物组合物(1)在延长的保存期间是稳定的，(2)增加药用的活性或多肽的效能或者(3)使得在治疗范围内容易使用或者施用多肽。发明概要本发明涉及KGF-2的液体和冻干制剂，以及它们的缺失突变体或点突变体或取代突变体(本文称为KGF-2多肽)。本发明还涉及这些KGF-2多肽制剂促进或者加速软组织生长或者再生的用途，例如在创伤愈合，或者在治疗mucocytis或炎症性的肠疾病方面的用途。本发明的优选制剂使用新型的KGF-2突变体形式，并且在一个实施方案中，使用一个本文称为KGF2-Δ33的缺失突变体。本制剂中使用的辅助组分(1)提供KGF-2多肽保存的稳定性，(2)进一步提高治疗组合物的软组织治愈活性，和/或(3)当为特定的治疗目的使得容易使用和施用时，以一种活性形式提供KGF-2多肽。本发明的第一个方面涉及一种包含KGF-2多肽和具有介于约pH5.0和约pH8.0之间缓冲能力的缓冲剂的制剂。有用的缓冲液包括磷酸盐，醋酸盐，顺乌头酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，碳酸盐以及柠檬酸盐缓冲液，优选的为柠檬酸盐。本发明的第二个方面涉及一种包含KGF-2多肽，冷冻干燥成块剂和具有介于约pH5.0和约pH8.0之间缓冲能力的缓冲剂制剂。有用的缓冲液包括磷酸盐，醋酸盐，顺乌头酸盐，琥珀酸盐，苹果酸盐，碳酸盐以及柠檬酸盐缓冲液，优选的为柠檬酸盐。
本发明的第三方面涉及一种包含KGF-2多肽和含巯基的混合物、优选地为能够稳定KGF-2多肽的单巯基甘油制剂。该制剂优选地包含具有介于约pH5.0和约pH8.0之间缓冲能力的缓冲剂。该制剂还可包含一种或多种抗氧剂或一种或多种金属螯合剂。
本发明的第四个方面涉及一种包含KGF-2多肽，缓冲液，和使该制剂在某个预定温度形成凝胶的高分子量化合物的制剂。一种优选的的高分子量化合物是Pluronic或者Poloxamer的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯的嵌段共聚物。含巯基的混合物，如单巯基甘油，也可包含在本制剂中以提供多肽附加的稳定性。
本发明的第五个方面涉及一种包含KGF-2多肽，缓冲剂和增稠剂的制剂。增稠剂用来增加该制剂的粘度。优选的增稠剂为羧甲基纤维素(CMC)，羟乙基纤维素(HEC)，羟丙基甲基纤维素(HPMC)，Natrosol，以及Carbomers。
此外，本发明的制剂也可以包含金属螯合剂，抗氧剂或者含巯基混合物如抗坏血酸酯，单巯基甘油，半胱氨酸，生育粉，丁化羟基苯甲醚，硫酸钠，亚硫酸氢钠，以及偏亚硫酸钠，以及防腐剂如m-甲苯酚，苯酚，氯丁烷，氯丁醇，苯甲醇，甲基对羟基苯甲酸酯和丙基对羟基苯甲酸酯。抗微生物防腐剂可以减少KGF-2制剂的稳定性，令人惊奇的是，甲基对羟基苯甲酸酯和丙基对羟基苯甲酸酯的结合被发现适于在KGF-2制剂中使用。本发明的制剂在药瓶的头部空间也可以有一层氮气覆盖物。此外，本发明的制剂可以包含用氦气，氩气，或者氮气清洗制剂缓冲液。
附图简要描述图形1A-1C说明了KGF-2的cDNA与相应的所推导的氨基酸序列。初始的35个或者36个氨基酸残基代表可能的引导序列(下画线的)。对氨基酸使用一个字母的缩写标准。当试图确定多核苷酸序列时，序列测定的不准确性是一个普遍的问题。利用373自动DNA序列分析仪(应用生物系统公司)进行序列分析。预计序列分析的准确性大于97％的准确率。(SEQ ID NO1和2)
图2(A)-2(C)描述了通过本发明的KGF-2多肽刺激正常的原初上皮角质细胞的增生作用。图(2A)显示KGF-2对正常的原初上皮角质细胞增生的刺激作用。图(2B)显示KGF-2Δ33对正常的原初上皮角质细胞增生的刺激作用。图(2C)显示KGF-2Δ28对正常的原初上皮角质细胞增生的刺激作用。
图3显示了KGF-2Δ33的液体制剂10个月稳定性的生物活性结果。
图4显示了KGF-2Δ33的冻干制剂9个月稳定性的生物活性结果。
图5显示了单巯基甘油对KGF-2生物活性的影响。
优选实施方案的详细描述KGF-2刺激上皮角质细胞，但不是间质细胞如成纤维细胞的增生。这样，“具有KGF-2蛋白质样活性的多肽”包括在下面陈述的角质细胞增生实验中显示KGF-2活性和结合FGF受体异构形式1-iiib和2-iiib的多肽。
本发明涉及KGF-2多肽的药物和兽药制剂。通过参考附

图1的多肽(SEQID NO2)和由保藏的cDNA编码的多肽，以及包括附图1多肽(SEQ ID NO2)的片段，衍生物和类似物，或者由保藏的cDNA编码的本质上保持与亲代多肽相同的生物学功能的多肽定义本文的KGF-2多肽。本发明中使用的多肽可以是重组多肽，天然多肽或者是合成的多肽，优选地为重组多肽。
在pH为4.5或小于4.5，或大于8.0pH时，已经发现KGF-2多肽表现出较差的活性和稳定性。本发明者曾发现KGF-2多肽的氧化和沉淀。当试图把其配制为用于治疗目的的制剂时，这些多肽呈现出一定的困难。为了保持理化性质和生物活性，KGF-2多肽可用抗氧剂(如氧清除混合物)，和/或蛋白质稳定剂(如含巯基混合物)，和/或金属-螯合剂(如EDTA)进行配制。本文所使用的稳定作用是指在指定的时间段内维持KGF-2多肽的理化性质和实质上的生物学活性。
根据本发明的制剂包含凝胶，增稠剂，溶液和冻干形式。这些制剂本文也称为“药物组合物”或者“组合物”。可注射的制剂液体制剂本发明的第一个方面涉及KGF-2多肽的液体制剂，包含一种KGF-2多肽和一种具有介于约pH5.0和约pH8.0之间、更优选地为pH5.5至pH6.5之间、最优选地为pH6.2的缓冲能力的缓冲液。有用的缓冲液包括来源于磷酸，醋酸，乌头酸，柠檬酸，戊二酸，苹果酸，琥珀酸和碳酸的缓冲液。典型地所使用的是上述一种酸的碱金属或碱土金属盐。更优选的缓冲液将是醋酸盐或者为柠檬酸盐，最优选地为柠檬酸盐。例如，制剂可以包含通过在水中把一种缓冲量的柠檬酸或其药学上可接受的盐与KGF-2Δ33相混合所形成的组合物。或者，制剂也可包括通过在水中把一种缓冲量的醋酸或其药学上可接受的盐与KGF-2Δ33相混合所形成的组合物。优选的缓冲液浓度从约5mM到约50mM。最优选的醋酸盐缓冲液将具有约20mM的浓度，以及柠檬酸盐缓冲液将具有约10mM到约20mM的浓度。制剂也可包含NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者其组合作为一种补剂，浓度约从0mM至150mM，优选地为10至约150mM，最优选地为约125mM，以及金属螯合剂，如EDTA，浓度约从0mM至10mM，最优选地为约1mM。另外，本发明的液体制剂也可包含一种或多种(a)一种稳定量的抗氧剂，如抗坏血酸和或(b)一种稳定蛋白质量的巯基化合物，例如单巯基甘油(MTG)。不希望被理论所束缚，人们相信巯基混合物如MTG用作保护KGF-多肽中存在的游离硫羟基基团。用于液体制剂的保存条件典型地在约2℃至约8℃。或者，保存条件在-20℃或低于-20℃。最优选地，保存条件在约-20℃。在冷冻状态下保存KGF-2液体制剂限制了对多肽的氧化量，转过来导致形成稳定的多肽制剂。
优选地，液体制剂包含(1)一种治疗有效量的KGF-2多肽；(2)一种有效量的具有介于约pH5.0和约pH8.0之间缓冲能力的缓冲液；和(3)一种药学上可接受的稀释剂；和(4)可有可无的下列一种或多种(a)NaCl，甘氨酸，蔗糖或甘露醇或者其组合体，作为一种补剂(b)一种螯合剂，(c)一种稳定量的抗氧剂，和
(d)一种稳定量的蛋白质稳定剂。KGF-2多肽优选地保存于溶液中。
本发明的组合物通过一起混合上述所列出的组分进行加工，优选地以本文表示的浓度和比例进行加工。
可用于液体制剂的抗氧剂包括硫酸氢钠，半胱氨酸，亚硫酸钠，抗坏血酸，生育粉，以及丁化羟基苯甲醚。此外，可用于液体制剂的稳定剂还包括巯基类如半胱氨酸，甲硫氨酸和巯基甘油。可使用的金属螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)，或二乙三胺五乙酸(DPTA)，以EDTA为优选。
本发明包含抗氧化剂或巯基类的制剂可以增加KGF-2多肽的稳定性。这使具有较长的货架寿命的药物产品成为可能。
此外，本发明的制剂还可包含一种或多种防腐剂，如苯甲醇，优选地浓度为约0.5％至约1.5％，最优选地浓度为0.9％；氯丁醇，优选地浓度为约0.01％至约1％，最优选地浓度为0.5％；甲基对羟基苯甲酸酯，优选地浓度为约0.1％至约0.2％，最优选地浓度为0.18％；丙基对羟基苯甲酸酯，优选地浓度为约0.01％至约0.05％，最优选地浓度为0.02％；间-甲酚，优选地浓度为约0.1％至约1％，最优选地浓度为0.3％；和/或苯酚，优选地浓度为约0.1％至约1％，最优选地浓度为0.5％。特别优选地是甲基对羟基苯甲酸酯和丙基对羟基苯甲酸酯一起使用，甲基对羟基苯甲酸酯的浓度为约0.1％至约0.2％，丙基对羟基苯甲酸酯的浓度为约0.10％至约0.05％。最优选地是甲基对羟基苯甲酸酯和丙基对羟基苯甲酸酯的组合，甲基对羟基苯甲酸酯的浓度为0.18％，丙基对羟基苯甲酸酯的浓度为0.02％。
更优选的液体制剂包含(1)浓度范围为约0.02至约40mg/ml(w/v)的KGF-多肽，更优选地为约0.05至约30mg/ml(w/v)，甚至更优选地为约0.1至约2mg/ml(w/v)，还有更优选地为约10mg/ml(w/v)；并且最优选地为约0.2至4mg/ml(w/v)；(2)浓度范围在约5mM至50mM，优选地约5mM至30mM的具有介于约pH5.0和约pH8.0之间缓冲能力的缓冲液；和(3)一种药物学上可接受的稀释剂，优选地为水，使组合物稀释至指定的体积。
用于本发明制剂的有用的缓冲液包括来源于醋酸，乌头酸，柠檬酸，戊二酸，苹果酸，琥珀酸，磷酸盐和碳酸的缓冲液。典型地所使用的是上述酸的碱金属或碱土金属盐。优选的为醋酸盐和柠檬酸盐缓冲液，如醋酸或者其药学上可接受的盐，或者柠檬酸或者其药学上可接受的盐。该溶液制剂更优选的pH范围从约pH5.0至约pH8.0，更优选地为pH5.5至pH6.5，以及最优选地为约pH6.2。醋酸钠或者柠檬酸钠是优选的的缓冲剂，尤以柠檬酸钠盐为最优选。
优选地向上述溶液中加入的还有(4)一种螯合剂，如浓度范围在约0.1mM至约10mM，更优选地在约1mM的EDTA；(5)一种补剂，如浓度范围在约0.01mM至约150mM，更优选地为约125mM的NaCl，甘氨酸，蔗糖或者甘露醇，或者它们的组合体。
可选择地，一种液体制剂也可以包含一种稳定蛋白质的量的选自下组的混合物(a)约0.5％至约2％w/v的甘油，(b)约0.1％至约1％w/v的甲硫氨酸，或者(c)约0.1％至约2％w/v的单巯基甘油。
本发明该方面的优选实施方案包括通过混合下列物质所形成的组合物(1)浓度为约0.02至约40mg/ml(w/v)，更优选的浓度约0.1至约20mg/ml，最优选的为约0.2至4mg/ml的KGF-2多肽。
(2)10mM的柠檬酸钠或者20mM醋酸钠；(3)125mM NaCl；(4)1mM EDTA；和(5)作为稀释剂的水。
更优选地，该溶液制剂包含通过混合以下物质所形成的组合物(1)约0.2至4mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的醋酸钠；
(3)125mM的NaCl；(4)1mM的EDTA；和(5)作为稀释剂的水，其中溶液在约pH6.2，并且在约-20℃保存。
最优选地，该溶液制剂包含通过混合以下物质所形成的组合物(1)约1.0mg/ml的KGF-2多肽；(2)20mM的柠檬酸盐，pH5-5.5；和(3)0.01％的多山梨酸酯80。
该溶液优选地还包含约7％蔗糖或者2％甘氨酸与0.5％蔗糖的组合体。
或者，该溶液制剂包含通过混合以下物质所形成的组合物(1)约1.0mg/ml的一个KGF-2多肽；(2)20mM的柠檬酸盐，pH5-5.5；(3)1mM的EDTA；和(4)0.01％的多山梨酸酯80。
该溶液优选地还包含约7％蔗糖或者2％甘氨酸与0.5％蔗糖的组合体。
本发明者已经发现KGF-2多肽容易氧化，凝聚和在溶液中沉淀。虽然KGF-2的氧化作用不破坏生物活性，限制该产品的氧化程度导致一种更稳定的产品。本发明者观察到，如果液体制剂pH太低，KGF-2多肽将失去生物活性。此外，随着溶液的pH接近KGF-2的pI，蛋白质将从溶液中沉淀下来。因此，本发明者曾测定液体制剂应该保持在约pH6.0至约pH7.0的范围内，并且约6.2的pH对稳定KGF-2多肽来说是最合适的。而且，发明者令人惊奇地测定到柠檬酸盐缓冲液特别能稳定KGF-2多肽。
虽然，使用约pH6.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液提供一种可减少KGF-2多肽的凝聚，并且增加稳定性的液体制剂，但液体多肽制剂中KGF-2多肽仍然易受氧化和沉淀。因此，发明者开发了一种下面陈述的冻干制剂。冻干制剂本发明的第二个方面涉及KGF-2多肽的冻干制剂，包含一种KGF-2多肽和一种具有介于约pH5.0和约pH8.0之间、更优选地为pH5.5至pH6.5、最优选地为pH6.2的缓冲能力的缓冲液。有用的缓冲液包括来源于磷酸，醋酸，乌头酸，柠檬酸，戊二酸，苹果酸，琥珀酸和碳酸的缓冲液。典型地所使用的是上述酸的碱金属或碱土金属盐。更优选的缓冲液将是磷酸盐或者柠檬酸盐，最优选地为柠檬酸盐。例如，制剂可以包含通过在水中把一种缓冲量的柠檬酸或其药学上可接受的盐与KGF-2Δ33相混合所形成的组合物。优选的缓冲液浓度从约5mM到约50mM。更优选的缓冲液浓度约为10mM。最优选地，以约10mM的浓度加入柠檬酸缓冲液。在该制剂中优选地还包含作为补剂的氯化钠，浓度为约0mM至150mM，最优选地为约20mM，以及金属螯合剂，如EDTA，浓度为约0mM至10mM，最优选地为约1mM。此外，成块剂/低温防冻剂如蔗糖，甘氨酸，甘露醇，海藻糖或者其它的药物学上可接受的成块剂也包括在该制剂中。使用的成块剂的量将使溶液是等渗的，范围在约2％至10％w/v。优选的浓度如下5％甘露醇，7％蔗糖，8％海藻糖，或者2％甘氨酸加0.5％蔗糖。更优选地，使用蔗糖或者蔗糖/甘氨酸的混合物。此外，本发明的冻干制剂也可包含一种或多种的(a)稳定量的抗氧剂，如抗坏血酸或者(b)稳定量的巯基类化合物，例如单巯基甘油。冻干制剂的保存条件典型地是约2℃至约25℃。更优选的保存条件在约2℃至约8℃或者约2℃至约8℃之下。
在初始溶液中浓度为约0.02mg/ml至约10mg/ml的蛋白质被冷冻干燥为KGF-2多肽。
初始的冻干溶液优选地包含(除KGF-2多肽之外)(1)有效量的柠檬酸或者其药物学上可接受的盐，优选地为柠檬酸钠，浓度范围在约5mM至约20mM；(2)浓度范围为约0mM至约125mM的NaCl，(3)浓度范围为约0mM至约10mM的EDTA，(4)一种或多种浓度范围为约2％w/v至15％w/v的蔗糖，甘露醇，甘氨酸或海藻糖，或者它们的混合物；和(5)水。
冷冻干燥缓冲液优选的pH范围为约5.5至约8.0，优选地为约pH6.2。
更优选地，冷冻干燥缓冲液包含10mM的柠檬酸钠，20mM氯化钠，1mM的pH6.2的EDTA和7％蔗糖。
冻干的KGF-2多肽制剂在无菌水中重构，以保持约290mOsm的等渗状态。KGF-2多肽可在无菌水中重构，可以也可以不含有稳定量的抗氧化剂，包含a)约0.01％至约2％w/v的单巯基甘油，b)约0.01％至约2％w/v的抗坏血酸，c)约0.01％至约2％w/v的甲硫氨酸或者，d)它们的组合体。
本发明包括产生稳定的KGF-多肽制剂的冷冻干燥循环。冷冻干燥循环被设计来在初级的干燥阶段把KGF-2多肽产品保持在它的折迭温度之下。此外，含水量优选地定为不到5％，更优选地不到2％％。对任何特定的蛋白质必须在个体基础上测定这种冻干流程。根据本发明的对含有冻干制剂的KGF-2蔗糖的一个示范冻干循环周期测定如下
根据本发明的对KGF-2冻干制剂的另一个示范冻干循环周期测定如下
本发明的冷冻干燥制剂提供了意外地增加的稳定性的产品。的确，本发明的冻干KGF-2制剂在温度高达45℃至少9个月生物学性质还是稳定的(图4)。逆相高效液相色谱显示本发明的冻干KGF-2制剂在45℃或低于45℃的温度和75％的相对湿度下保持其理化性质多达8个月。在这样的高温下，保持如此之长的时间稳定性对蛋白质是十分不寻常的。增稠的和凝胶制剂本发明的第三个方面涉及KGF-2多肽增稠的或者凝胶制剂。
1)增稠剂增稠剂可以添加到上述所描述的液体制剂中，以增加产生制剂的粘度。具有增加的粘度的一种制剂对局部用药是有益的，这些局部用药的地方在控制药物释放，粘附到创伤外面或者避免流失掉可能是重要的。这些增稠的制剂被用于局部的用途，如创伤愈合，治疗皮肤病或任何其它的通过局部施用KGF-2的药物组合物能够治疗的用途。
增稠剂应该提高粘度到约50至约10,000厘泊(cps)，更优选地为约50至约1,000cps，最优选地约200至约300cps。利用一个旋转纺锤粘度计测定粘度。最优选的增稠剂浓度为0至5％(w/w)。增稠的溶液总将保持液体状态。
合适的增稠剂的例子包括，但不限于水溶性的乙醚化的纤维素和carbomer(高分子量的丙烯酸与烯丙基蔗糖或戊赤鲜糖的烯丙基醚交联的聚合物)。乙醚化的纤维素的例子是本领域中熟知的(在USP中列出)，包括烷基化纤维素，羟基烷基化的纤维素和烷基化的羟基烷基化纤维素，例如，甲基纤维素，羟基乙基纤维素，羟基丙基纤维素，羟基丙基甲基化的纤维素等等。在另一实施方案中，局部的或切开的凝胶可包含约0至20％重量的具有50,000至约700,000的分子量的纤维素衍生物。在一优选实施方案中，纤维素衍生物以约2％至8％的重量存在，具有约80,000至约240,000的分子量范围。优选的纤维素衍生物为羟基丙基甲基化的纤维素，甲基纤维素，羧甲基纤维素，羟基乙基纤维素。
当增稠剂加入到注射制剂中时，为其最佳的稳定性可以加入或者从制剂中去除上面详述的盐和缓冲剂。例如，可以增加柠檬酸盐浓度。例如，优选浓度为约10mM至约500mM的柠檬酸盐，更优选地为约10mM至约50mM的柠檬酸盐，最优选地为约10mM至20mM的柠檬酸盐。此外，在冻干制剂中可减少蔗糖的量到约0至约5％蔗糖的范围。
增稠剂可直接加入到根据本发明的液体冻干制剂中，然后冻干。或者，根据本发明的冻干制剂可通过加入合适的稀释剂，最优选地为加入含有溶解在其中的增稠剂的水重构。通过喷雾施用这些增稠的制剂。
根据本发明，一种优选的增稠KGF-2多肽溶液的例子包括通过混合下列物质所形成的产品(1)一种局部有效量的KGF多肽，优选地为KGF-2A33；(2)约10mM至约500mM的柠檬酸钠盐缓冲液；(3)约0.01至约150mM的NaCl；(4)约0.75至约1.27mM，优选地为约1ml的EDTA；(5)约0.1％至约7％的蔗糖，或约2.0％甘氨酸和约0.5％蔗糖的组合体；(6)约0.75至约1.5％(w/w)的羧甲基纤维素，或约0.5至约1.5％的羟基丙基甲基纤维素，或者约0.25至约0.75％的羟基乙基纤维素，或者约0至1％的carbomer，或者任何它们的组合体。
这样一种制剂的pH最优选地为pH6.2。
2)凝胶剂本发明的另一方面涉及KGF-2多肽的凝胶制剂。凝胶剂可以添加至本发明的可注射制剂中以提供一种在室温下保持液体的制剂，并且当施用到皮肤的表面时(在约37℃)可以凝固。这些制剂对局部用药是有用的，这些局部用药的地方在控制药物释放，粘附到创伤外面或者避免流失掉可能是重要的。这些凝胶的制剂被用于局部用途，如创伤愈合，治疗皮肤病或任何其它的通过局部施用一种KGF-2的药物组合物能够治疗的用途。
根据本发明的KGF-2多肽凝胶制剂包含
(1)一种局部有效量的KGF多肽；(2)一种缓冲液；(3)一种药物学上可接受的稀释剂，优选地为水；和(4)一种形成凝胶的高分子量化合物。
本发明的凝胶制剂的粘度在室温下为约1至约10,000cps的范围，最优选地为室温下约20至约100cps。利用一个旋转纺锤粘度计测定粘度。
本发明中使用的形成凝胶的高分子量化合物典型地是水溶性的能够形成粘性水溶液的聚合物，或者非水溶性的，遇水膨胀的也能形成粘性溶液和一旦与皮肤接触即形成凝胶的聚合物(例如胶原蛋白)。
有用的形成凝胶的高分子量化合物可选自乙烯基聚合物，聚氧化乙烯-聚氧化丙烯共聚物，多糖，蛋白，聚(乙烯氧化物)，丙烯酰胺聚合物及其衍生物，和/或它们的盐。在美国专利5,427,778中可以发现能够用来制造药物凝胶制剂、用于治愈创伤的其它化合物，本文充分予以一并参考。
有用的乙烯聚合物(或者替代聚乙烯)包括多丙烯酸，多甲基丙烯酸，聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯乙醇。有用的多糖包括纤维素衍生物，粘多糖，琼脂，果胶，褐藻酸，葡聚糖，α-直链淀粉，支链淀粉，壳聚糖。有用的粘多糖包括透明质酸，软骨素，4-硫酸软骨素，硫酸乙酰肝素，肝素。粘多糖与任何其它凝胶形成聚合物，例如，胶原蛋白，明胶，纤连蛋白一起结合可用来提高创伤愈合。丙烯酰胺聚合物可以是聚丙烯酰胺或者聚甲基丙烯酰胺。
优选的高分子量凝胶形成混合物是聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物，尤其是那些在贸易上指定为PLURONICS(BASF)或者POLAXAMERS(BASF)的嵌段共聚物。
在一优选的实施方案中，本发明的凝胶按重量比可以包含约10至约60％的具有平均分子量为约500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物。在一更加优选的实施方案中，本发明的凝胶按重量比可以包含约14至约18％的具有分子量范围为1,000至15,000的嵌段共聚物。本发明的优选嵌段共聚物是Pluronic F108和Pluronic F127。
聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物(Pluronic或者Poloxamer)在局部药物传送系统的应用中具有很大的潜力，因为它们表现出可逆的热凝胶化行为，具有很好的药物释放特征以及较低的毒性。当溶液加热即形成凝胶。因此，凝胶在室温下是一种低粘性的水溶液，但当它接触哺乳动物身体时，被体温温暖，粘度随着溶液形成凝胶而增加。例如，Pluronic凝胶可用于KGF-2多肽控制传输到创伤以及其它需要局部传输药物的位点。KGF-2多肽可与Pluronic以液态方式结合，并施用到创伤处。凝胶化作用发生并有效地减少多肽释放至创伤的速率，进而以延长多肽和创伤位点之间的接触。利用这样的凝胶制剂的益处包括保持创伤湿润，持有在形状上合适于创伤或其它可施用化合物的位点的药物化合物。
根据本发明的KGF-2多肽的优选凝胶制剂包含柠檬酸盐缓冲液和Pluronic。该制剂可以包括一定量的柠檬酸酸或者其药物学上可接受的盐。
根据本发明的凝胶制剂也可包括螯合剂，稳定量的抗氧剂或者巯基类。凝胶制剂包含以一定量形成凝胶的高分子量化合物，如Pluronic，或者水溶性乙醚化的纤维素，等等。在根据本发明的凝胶制剂中，KGF-2多肽优选地为约0.01mg/ml至约10mg/ml的浓度。
优选地，凝胶制剂的形成通过混合(1)一种KGF-2多肽，优选地为KGF-2Δ33，以最终计算的0.01mg/ml至约10mg/ml的浓度；(2)一种有效量的缓冲剂；(3)约10％至约60％，或者更优选地为约14％至约18％的重量的平均分子量为约500至50,000的聚氧化乙烯-聚氧化丙烯嵌段共聚物；和(4)一种药物学上可接受的稀释剂，优选地为水。
另一个优选的凝胶制剂包含(1)一种药物学上具活性量的KGF-2多肽；(2)约10mM至约500mM柠檬酸钠盐；(3)约0.01mM至约150mMNaCl；(4)约1mM EDTA；
(5)约0.1％至约7％蔗糖或者约2.0％甘氨酸和约0.5％蔗糖；(6)约14％至约18％Pluronic F127；和(7)水，其中制剂的pH约为pH6.2。
最优选地，凝胶制剂包含(1)一种KGF-2多肽，优选地KGF-2Δ33，在约为0.01mg/ml至约10mg/ml(w/v)的浓度范围，更优选地约0.1mg/ml至约3mg/ml的浓度范围，最优选地为约0.2mg/ml的浓度；(2)浓度范围约5mM至20mM的柠檬酸钠；(3)约10％至约25％(w/v)，优选地为约15至约25，最优选地为约16％的Pluronic127或者Poloxaxner407；(4)约6.7％至约7.3％的蔗糖，优选地为约7％蔗糖或者约2.0％甘氨酸和约0.5％蔗糖；和(5)加水至体积。
凝胶制剂还可以包含下列的一种或多种(6)浓度范围约0.1mM至约10mM的EDTA。
(7)浓度范围约0.01mM至约125mM的NaCl。凝胶制剂的优选pH范围从约pH5.0至约pH8.0，优选地为pH6.2，产生的凝胶制剂应该是等渗的。
3)附加的稳定剂本发明的所有前述的制剂可从抗氧化剂，金属螯合剂，含巯基类混合物和其它通用的稳定剂中受益。这样的稳定剂的例子包括，但不限于(a)约0.5％至约2％w/v的甘油，(b)约0.1％至约1％w/v的甲硫氨酸，(c)约0.1％至约2％w/v的单巯基甘油，(d)约1mM至约10mM的EDTA，(e)约0.01％至约2％w/v的抗坏血酸，(f)0.003％至约0.02％w/v的多山梨酸酯80，(g)0.001％至约0.05％w/v的多山梨酸酯20，
(h)精氨酸，优选的浓度在约0.5％至约2.5％，最优选地在约1.7％，(i)肝素或者肝素类似物(带负电荷的)，(j)葡聚糖硫酸盐，浓度优选地在约0.05％和0.5％，(k)环化糊精或者硫酸盐环化糊精，(1)阴离子或者多阴离子种类[肝素类似物]，(m)赖氨酸，优选地为10％的浓度，(n)羟基丙基-σ-环化糊精，优选地在约2至10％的浓度，(o)硫酸盐-σ-环化糊精，优选地在约0.1％和10％的浓度，最优选地在约1％，或者(p)它们的组合体。KGF-2多肽的施用本发明的KGF-2多肽制剂可以使用熟知的在药物组合物中有用的合适的药物稀释剂。这样的稀释剂包括但不限于盐水，缓冲液盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，以及它们的组合。该制剂应该适宜于施药的模式。优选地，根据本发明上述指定的方法调制药物组合物。水是优选的稀释剂。
具有KGF-2活性的多肽以药物组合物的方式与一种或多种药物学上可接受的赋形剂施用。不言而喻的是当施药给一个患者时，本发明的药物组合物的每日总使用剂量将由出诊医生在其正确的判断范围内作出决定。对任一特定病人的特定疗效剂量水平将取决于多种因素，包括欲达成的反应类型和程度；特定的组合物，包括是否使用另一种药剂(如果有的话)；年龄，体重，一般健康，性别和病人的饮食；施药的时间，施药的途径，和组合物分泌的速率；治疗持续的时间；与特定的组合物一起使用或同时使用的药物(如一种化疗剂)；以及医学领域熟知的同类因素。在Remington的药物科学中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以发现本领域熟知的合适的制剂。因此，通过这样的考虑确定用于本文目的的“有效量”的KGF-2。
本发明的药物组合物可以以一种方便的形式进行施药，如通过口服，直肠给药，局部给药，静脉注射，腹膜内注射，肌内注射，皮下注射，关节内施药，鼻内施药，吸入，眼内施药，以及皮内途径施药。肠胃外的和局部施药是优选的用药途径。如本文所使用的“肠胃外的”指包括静脉注射，肌内注射，腹膜内注射，胸骨内注射，皮下注射以及关节内注射和灌输的用药方式。
药物组合物以一定量的、有效治疗和/预防特定指征的方式施药。在大多数情况下，考虑到用药途径，症状等，KGF-2剂量从每日约1μg/kg至约30mg/kg体重。然而，剂量可以低至0.001g/kg。例如，在特定的局部施药的情况下，优选施药剂量从每平方厘米约0.01g至9mg。在鼻内和眼内用药的情况下，优选的用药剂量从约0.001μg/kg至约10mg/ml，更优选地从约0.05mg/ml至约4mg/ml。
作为一个一般性建议，肠胃外施用的KGF-2多肽总的药物有效量的范围在病人体重的1μg/kg/天至10mg/kg/天，虽然，如上面提到的，这将取决于疗效而定。如果连续不断地施药，KGF-2多肽典型地以一个约1μg/kg/小时至约50μg/kg/小时的计量速率施药，例如，使用一个微型泵，通过每天1-4次注射或者通过皮下灌输。也可使用一种静脉注射的袋装溶液或瓶装溶液。
如果连续施药不长于一定的最低天数，KGF-2多肽影响纤维蛋白系统的一个疗程似乎是最佳的，对小鼠来说为7天。需要观察治疗后产生反应的变化和间隔，治疗的时间随着需要的效果而定。
对于肠胃外施药，在一实施方案中，一般通过把所需纯度的KGF-多肽、以一个单位剂量的可注射形式(溶液，悬浮液，或乳化液)与一个药物学上可接受的载体(即使用的剂量和浓度对受体为无毒的，并且与制剂中的其它成分具相容性的载体)相混合配制KGF-2多肽制剂。例如，制剂优选地不包括氧化剂和其它已知对多肽有害的化合物。
一般地，通过把KGF-2多肽与液体载体或细小的分开的固体载体或两者均一地和密切地相互接触调制制剂。如果必要的话，产品可制成所需的制剂。优选地，载体为肠胃外的一种载体，更优选地为一种与受体血液等渗的溶液。这些载体工具的例子包括水，盐水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的载体工具如固定油，乙基油酸以及脂质体也是有用的。在Remington的药物科学中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以发现本领域熟知的合适的制剂。
KGF-2多肽也可以液体，滴剂，或增稠的液体，凝胶施用到眼中治疗动物和人体的泪腺损伤，失调和病变。
KGF-2多肽也可以液体滴剂或喷雾的形式通过在鼻内施药到鼻腔粘膜上治疗动物和人体的鼻腔粘膜和鼻窦上皮的失调，损伤和病变。
一般地，通过把KGF-2多肽与液体载体或细小的分开的固体载体或两者均一地和密切地相互接触调制制剂。如果必要的话，产品可制成所需的制剂。优选地，载体为肠胃外的一种载体，更优选地为一种与受体血液等渗的溶液。这些载体工具的例子包括水，盐水，林格溶液和葡萄糖溶液。非水溶性的载体工具如固定油，乙基油酸以及脂质体也是有用的。在Remington的药物科学中(最近的版本，Mack出版公司，Easton，PA)可以发现本领域熟知的合适的制剂。
载体也可以包含少量的合适的添加剂，如提高等渗性和化学稳定性物质。这样的物质所使用的剂量和浓度对受体是无毒的，包括缓冲液如磷酸，柠檬酸，琥珀酸，醋酸，以及其它的有机酸或者它们的盐；抗氧剂如抗坏血酸；低分子量的多肽(不到10个残基)，即多精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或者免疫球蛋白；亲水性的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸或精氨酸；单糖，双糖，和其它的碳水化合物，包括纤维素及其衍生物，葡萄糖，甘露糖，或者糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或者山梨醇；平衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如多山梨酸酯，poloxamers，或者PEG。
KGF-2典型地以这种载体制成的制剂在浓度约为0.01μg/ml至50mg/ml，优选地为0.01μg/ml至10mg/ml，pH为约5至8，优选地约6至约7，最优选地约pH6.2。不言而喻的是使用某种前述的赋形剂，载体，或稳定剂将导致KGF-2盐的形成。
用于治疗用药的KGF-2可以是无菌的。通过无菌过滤膜(例如，0.2微米的膜)以过滤的方式容易完成无菌处理。治疗的KGF-2组合物可置于一个具有无菌出口的容器中，例如，一个静脉注射的溶液袋或通过皮下注射针头可刺穿的塞子的药水瓶。
KGF-2平常地保存于单位或多剂量的容器中，例如，密封的安瓿或药瓶，作为一种水溶液或一个供重新恢复其水分的冻干制剂。作为一个冻干制剂的例子，3ml的药水瓶注入1ml的过滤灭菌1％(w/v)的KGF-2水溶液，产生的混合物再冷冻干燥。通过利用注射用水(可选择性包括一种或多种抗氧化剂)重构冻干的KGF-2制备灌输溶液。
用药剂量也可以以患者特定的方式进行安排，以便在血液中提供KGF-2活性的一种所预定的、例如，如同通过RIA技术所测定的浓度。因此，可以调整病人的用药剂量以便达到有规律的、正在通过血液的浓度，如RIA所测定的、从50ng至1000ng/ml，优选地为150至500ng/ml的浓度级别进行剂量用药。
KGF-2也可适当地借助于持续释放系统用药。持续释放的组合物的合适的例子包括半渗透的已成型的物件形式的聚合物基质，例如，薄膜，或微胶囊。持续释放的基质包括多聚乳酸(美国专利3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物(U.Sidman等，生物聚合物22547-556(1983))，多聚(2-羟基乙基异丁烯酸)(R.Langer等.J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)，R.Langer.Chem.Tech.1298-105(1982))，和乙烯乙烯基醋酸(R.Langer，出处同上)或多聚-D-羟基丁酸(EP133,988)。持久释放的KGF-2组合物也包括脂质体包载的KGF-2。包含KGF-2的脂质体用本质上已知的方法制备DE3,218,121；Epstein，等，美国国家科学院院报823688-3692(1985)；Hwang等，美国国家科学院院报774030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949；EP142,641；日本专利申请83-118008；美国专利4,485,045和4,544,545；以及EP102,324。
一般地，脂质体为小的(约200-800埃)单层脂质体类型，其中脂的含量大于约30mol百分比的胆固醇，所选择的比例调整为最理想的KGF-2疗法。
本发明也提供了包含一个或多个装有一种或多种本发明药物组合物组分的容器的药物包或试剂盒。与这些容器相关联的是政府机构以表格形式规定的布告，控制药物或生物产品的制造，使用和销售，该布告反应生产机构的批准，以及供人类施药的用途和销售。另外，本发明的多肽，拮抗剂和拮抗物可与其它治疗化合物连同使用。
当本发明者检查按本发明制剂制备的KGF-2多肽的生物活性和稳定性时，惊奇地发现单巯基甘油的使用可以稳定KGF-2多肽，并且在创伤治愈中作为KGF-2多肽的一种增效剂。用于单巯基甘油增效的最适浓度范围为0.1％至2％w/v。KGF-2多肽KGF-2刺激上皮细胞和表皮角质细胞，但不是间质细胞如成纤维细胞的增生。这样，“具有KGF-2蛋白样活性的多肽”包括在下面和美国申请08/910,875陈述的在角质细胞增生试验中表现KGF-2活性，并且能与FGF受体异构体1-iiib和2-iiib结合的多肽。虽然活性程度不必与KGF-2蛋白质的活性相同，优选地，与KGF-2蛋白质相比，“具有KGF-2蛋白样活性的多肽”表现出实质上相似的活性(即，相对于参照KGF-2蛋白质而言，候选多肽表现出更大的活性，或不超过十倍的活性，优选地，不大于约两倍的活性)。
本发明的制剂中使用的KGF-2多肽可以有，也可以没有N-末端的甲硫氨酸，优选地，多肽将缺乏N-末端的甲硫氨酸。
KGF-2 cDNA克隆于1994年十二月年十六日，以ATCC保藏号75977保藏于美国典型培养物保藏中心，专利保藏处(10801 University，Manassas，VA 20110-2209)。此外，插入到表达载体pHE4-5、编码KGF-2Δ33的cDNA于1998年一月九日，以ATCC保藏号209575保藏于美国典型培养物保藏中心。
当涉及图1的多肽(SEQ ID NO2)或保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”，“衍生物”和“类似物”是指本质上保留与这种多肽一样的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括通过切割前蛋白部分以产生有活性的、成熟的多肽方式被激活的前蛋白。
本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或者合成多肽，优选地为重组多肽。
图1(SEQ ID NO2)的多肽片段，衍生物或者类似物，或者由保藏的cDNA所编码的多肽可以是(i)一种多肽，在其中一个或多个氨基酸残基被保守的或非保守的氨基酸残基(优选地为保守的氨基酸残基)所替代，这种替代的氨基酸残基可以是也不一定是遗传密码所编码的，或(ii)一种多肽，在其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或(iii)一种多肽，在其中成熟的多肽与另一种混合物相融合，如一种增加多肽的半保留期的混合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)一种多肽，在其中附加的氨基酸与成熟多肽相融合，如一个引导或分泌序列、或者一个用于纯化成熟多肽的序列、或者一个前蛋白序列。这样的片段，衍生物或者类似物被认为在本领域技术人员所掌握的范围之内。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同意的(如同一般所公认的)，每个术语可按上下文的需要相互交换使用，表示一条通过肽键偶联的至少两个氨基酸的链。本文的单词“多肽”用于含有十个氨基酸以上的链。本文所有的寡肽或多肽公式或序列都以从左到右和由氨基端到羧基端的方向书写。
本领域所公认的是KGF-2多肽的某些氨基酸序列的变化对该蛋白质的结构或者功能没有显著的影响。如果注视序列中的这些变化，应该牢记的是在蛋白质上将有决定其活性的关键区域。一般来说，如果使用执行相似功能的残基，取代形成三级结构的氨基酸残基是可能的。在其它实例中，如果氨基酸残基的改变发生在蛋白质的非关键区域，这种残基的类型可能是完全不重要的。
本发明的多肽优选地是一种分离的形式。分离的“多肽”是指从其天然环境中分离的多肽。因此，产生的多肽或包含于一个重组宿主细胞内的多肽被认为是为本发明的目的而分离的。部分地或实质上从一个重组宿主细胞或一个天然来源中纯化的多肽也是指这种含义。
本发明的药物制剂包含SEQ ID NO2的KGF-2多肽(尤其是成熟多肽)及其缺失突变体，以及一些与SEQ ID NO2多肽具有至少90％，95％，96％，97％，98％，99％相似性(更优选地至少90％，95％，96％，97％，98％，99％同源性)的多肽和它们的缺失突变体，还包括具有这样的多肽部分它们一般地包含至少30个氨基酸和更优选地至少50个氨基酸这样的多肽部分(如下面描述的缺失突变体)。
如本领域所熟知的，通过把一种多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代序列与第二种多肽氨基酸序列相比较确定两种多肽之间的“相似性”。
两种多肽的“％相似性”是指使用Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix第8版本，遗传学计算机小组，大学研究公园，575 ScienceDrive，Madison，WI 53711)，通过比较两种多肽的氨基酸序列和比较用于测定相似性的欠缺背景所产生的相似性分值。Bestfit程序利用Smith和Waterman的局部同源性算法(应用数学进展2482-489，1981)寻找两种序列之间的最佳同源片段。
例如，具有与KGF-2多肽的参照氨基酸序列至少95％“同源性”的氨基酸序列的一种多肽是指除多肽序列可以包括多达5个氨基酸的改变(KGF-2多肽参照氨基酸的每100个氨基酸)之外，多肽的氨基酸序列与参照序列是相同的。换句话说，为了获得氨基酸序列与一个参照氨基酸序列具有至少95％的同源性的多肽，参照序列中的多达5％的氨基酸残基可以被缺失或用另外的氨基酸取代，或者参照序列中多达5％的总氨基酸残基数量的氨基酸可以插入到参照序列中。参照序列的这些改变可以发生在参照氨基酸序列的氨基端或羧基端位置上，或者介于这些末端位置的其它任何地方，要么单独地散布于参照序列的残基中或者分布在参照序列内的一个或多个相邻基团上。
作为一个实用的物质，任何特定的多肽是否与图1[SEQ ID NO2]中表示的氨基酸序列，或与保藏的cDNA克隆编码的氨基酸序列具有至少90％，95％，96％，97％，98％或者99％的同源性可用已知的计算机程序如Bestfit程序(威斯康星序列分析软件包，Unix第8版本，遗传学计算机小组，大学研究公园，575 Science Drive，Madison，WI 53711)进行常规测定。当使用Bestfit或者任何其它序列对比程序来确定一种特定的序列与根据本发明的参照序列是否具有同源性，例如95％的同源性时，当然要设置参数，在参照氨基酸序列的整个长度范围上计算同源性的百分率，并允许参照序列中氨基酸残基总数有多达5％的同源性缺口。
本发明的蛋白质可以是天然存在的，重组产生的，或者使用本领域熟知的技术化学合成的(例如，参见Creighton，1983，蛋白质结构和分子原则，W.H.Freeman和Co.，N.Y.，以及Hunkapiller.M.等，自然310105-111(1984))。例如，对应于本发明的KGF-2多肽的一个片段的多肽可通过使用多肽合成仪合成。而且，如果需要的话，还可向KGF-2多肽序列中引入非传统的氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加。非传统的氨基酸包括，但不限于，普通氨基酸的D-型同分异构体，2，4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，4-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，t-丁基甘氨酸，t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，氟基-氨基酸，设计的氨基酸如β-甲基氨基酸，Ca-甲基氨基酸，Na-甲基氨基酸，一般的氨基酸类似物。而且，氨基酸可以是D(右旋的)或者L(左旋的)。
非天然存在的变异体可使用本领域已知的突变技术产生，这些突变技术包括，但不限于，寡核苷酸介导的突变，丙氨酸扫描，PCR突变，点指导的突变(参见，例如，Carter等，核酸研究134331(1986)；和Zoller等，核酸研究106487(1982))，盒式突变(参见，例如，Well等，基因34315(1985))，限制性选择突变(参见，例如，Well等，Philos.Trans.R.Soc.London SerA 317415(1986))。
另外，本发明包括在翻译期间或之后差异修饰的KGF-2多肽，例如，通过糖基化，乙酰化，磷酸化，酰胺化，通过已知的保护/封阻基团衍生化，蛋白质的水解切割，与一个抗体分子或其它细胞配体形成键合，等等。通过已知的技术可以进行任何的化学修饰，这些技术包括，但不限于，通过溴化氰，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，木瓜蛋白酶，V8蛋白酶，NaBH4的化学切割，乙酰化作用，甲基化作用，氧化作用，还原作用，以及在衣霉素存在时的代谢合成，等等。
本发明包括的附加的翻译后修饰包括，例如N-连接的或O-连接的碳水化合物链，N-末端或C-末端的加工，化学部分与氨基酸主键的附着，以及由于原核宿主细胞表达而产生的N-末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。多肽也可用一个可检测的标记修饰，如酶的，荧光的，同位素的或亲和标记以便于蛋白质的检测和分离。
本发明还提供了化学修饰的KGF-2的衍生物，这些衍生物可提供一些另外的优点，如增加的可溶性，稳定性和多肽的循环时间，或者减少免疫原性(参见美国专利4,179,337)。供衍生化的化学部分可选自水溶性的聚合物，如聚乙二醇，乙二醇/丙二醇共聚合物，羧甲基纤维素，葡聚糖，聚乙烯醇等等。多肽可在分子内的随机位置或分子内的预定位置修饰，并且一种，两种，三种或多种连接的化学部分。
聚合物可以具有任何分子量，可以是分支的或不分支的。对聚乙二醇，优选的的分子量在约1kDa和约100kDa之间(术语“约”指在聚乙二醇的制备物中，某些分子比规定的分子量将更重一些，某些分子比规定的分子量将更轻一些)以便于处理和制造。也可以使用其它分子量大小的聚乙二醇，取决于所需的治疗外观(例如所需的持续释放的时间，影响效果，如果对生物活性有任何影响的话，处理的便利，抗原性的程度或者缺乏以及聚乙二醇对用于治疗的蛋白质或者类似物的其它已知的影响)。例如，聚乙二醇的平均分子量约为200，500，1000，1500，2000，2500，3000，3500，4000，4500，5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10,000，10,500，11,000，11,500，12,000，12,500，13,000，13,500，14,000，14,500，15,000，15,500，16,000，16,500，17,000，17,500，18,000，18,500，19,000，19,500，20,000，25,000，30,000，35,000，40,000，50,000，55,000，60,000，65,000，70,000，75,000，80,000，85,000，90,000，95,000，或者100,000kDa。
如同上面所指出的，聚乙二醇可以有一个分支结构。分支的聚乙二醇曾有过描述，例如，在美国专利5,643,575；Morpurgo等，应用生物化学和生物技术5659-72(1996)；Vorobjev等，核酸182745-2750(1999)；以及Caliceti等，Bioconjug.Chem.10638-646(1999)，各自公开的内容在此一并参考。
考虑到对蛋白质的功能或抗原结构域的影响，聚乙二醇分子(或其它的化学部分)应该附着在蛋白质上。有一些对本领域的技术人员于可供使用的附着方法，例如，EP 0401 384，本文一并参考(PEG偶联到G-CSF上)，也参见Malik等，Exp.Hematol.201028-1035(1992)(利用tresyl氯化物报告GM-CSF的锚定作用)。聚乙二醇经反应基团，如一个游离的氨基或羧基，通过氨基酸残基可以共价地结合。反应基团是活化的聚乙二醇分子可以结合的那些基团。具有一个游离的氨基基团的氨基酸残基包括赖氨酸残基和N-末端的氨基酸残基；具有一个游离的羧基基团的氨基酸残基包括天冬氨酸残基，谷氨酸残基和C-末端的氨基酸残基。巯基基团也可用作附着聚乙二醇分子的一个反应基团。优选地用于治疗用途的是附着在氨基基团上，如附着在N-末端上或赖氨酸基团上。
如上面所建议的，聚乙二醇通过键合到任何一些氨基酸残基上可附着在蛋白质上。例如，聚乙二醇通过共价键结合到赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸残基上可连接到蛋白质上。可使用一种或多种化学反应把聚乙二醇附着在蛋白质特定的氨基酸残基上(例如，赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，或半胱氨酸)或者附着到蛋白质的不止一种类型的氨基酸残基上(如，赖氨酸，组氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，半胱氨酸和它们的组合体)。
人们可以期望尤其在N-末端被化学修饰的蛋白质。利用聚乙二醇作为本发明组合物的说明，人们可以从各种各样聚乙二醇分子(按分子量，分支，等等)中，从反应混合物中的聚乙二醇分子与蛋白质(或多肽)的比例，从所使用的锚定反应的类型，以及从获得选择的N-末端被锚定的蛋白质的方法中选择。获得N-末端被锚定的制剂(即，如果必要的话，从其它单锚定的部分中分离该部分)的方法可通过从锚定的蛋白质分子群体中提纯N-末端锚定的物质。通过还原烷基化作用可获得在N-末端修饰位置上的经化学修饰的选择性蛋白质，该还原烷基化作用利用在一特定的蛋白质中不同类型的可供衍生化的一级氨基酸基团(赖氨酸对N-末端)的差别反应性。在合适的反应条件下，在蛋白质的N-末端用一个含羧基的聚合物可完成实质上选择性的衍生化。
如同上面所表明的，本发明的蛋白质的锚定可通过任何一些方式完成。例如，聚乙二醇可直接地或通过一个介入的接头附着在蛋白质上。对聚乙二醇附着在蛋白质上的无接头系统在以下参考文献中有过描述Delgado等，Crit.V.Thera.Drug Carrier Sys.9249-304(1992)；Francis等，国际血液学杂志.681-18(1998)；美国专利4,002,531；美国专利5,349,052；WO 95/06058；和WO 98/32466，每篇文献的公开的内容在此一并参考。
无须介入的接头把聚乙二醇直接地附着在蛋白质的氨基酸残基上的一个系统使用三氟乙磺酸化(tresylated)MPEG(使用三氟乙磺酰氯(ClSO2CH2CF3)，通过单甲氧基聚乙二醇(MPEG)的修饰而产生的)。蛋白质与三氟乙磺酸化MPEG反应，聚乙二醇直接地附着在蛋白质的蛋白质的胺基团上。因此，本发明包括通过本发明的蛋白质与具有2，2，2-三氟乙磺酰基团的一个聚乙二醇反应而产生的蛋白质-聚乙二醇缀合物。
用一些不同的介入接头，聚乙二醇也可附着在蛋白质上。例如，美国专利5,612,460，其整个说明书本文一并参考，公开了用于连接聚乙二醇和蛋白质的氨基甲酸乙酯接头。蛋白质-聚乙二醇缀合物(其中聚乙二醇通过一个接头附着在蛋白质上)也可以通过蛋白质与化合物(如MEPG-琥珀酸琥珀酰亚氨基酯，用1，1’羰基二咪唑活化的MPEG，MPEG-2，4，5-三氯penyl碳酸盐，MPEG-p-氮苯基碳酸盐，和各种各样的MPEG-琥珀酸酯衍生物)反应产生。一些另外的聚乙二醇衍生物和把聚乙二醇附着在蛋白质上的反应化学在WO 98/32466中描述过，其整个说明书本文一并参考。用本文陈述的反应化学所产生的锚定的蛋白质产物包括在本发明的范围之内。
附着在本发明的每种蛋白质上的聚乙二醇部分的数量(即，取代的程度)也是可以变化的。例如，本发明的锚定蛋白质可连接到平均1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，12，15，17，20，或更多的聚乙二醇分子上。类似地，在这些范围内如每个蛋白分子上有1-3，2-4，3-5，4-6，5-7，6-8，7-9，8-10，9-11，10-12，11-13，12-14，13-15，14-16，15-17，16-18，17-19，或18-20聚乙二醇部分的平均取代程度。测定取代程度的方法，例如在Delgado等，Crit.Rev.Thera.Drug Carrier Sye.9249-304(1992)中有过描述。KGF-2缺失突变体天然的KGF-2在含水的状态下是相对不稳定的，并且在加工和保存期间经历化学和物理降解，导致生物活性的丧失。天然的KGF-2在含水的溶液中在温度提高时也倾向于聚集，并且在酸性条件下被灭活。
特别优选的KGF-2多肽是如下所显示的缺失突变体(数字起始于蛋白质的第一个氨基酸(Met)Thr(残基36)--Ser(残基208) Gly(41)--Ser(208)Cys(37)--Ser(208) GIn(42)--Ser(208)Gln(38)--Ser(208) Asp(43)--Ser(208)Ala(39)--Ser(208) Met(44)--Ser(208)Leu(40)--Ser(208) Val(45)--Ser(208)Ser(46)--Ser(208)Pro(47)--Ser(208)Glu(48)--Ser(208)Ala(49)--(Ser208)Thr(50)--Ser(208)Asn(51)--Ser(208)Ser(52)--Ser(208)Ser(53)--Ser(208)Ser(54)--Ser(208)Ser(55)--Ser(208)Ser(56)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(200)Phe(57)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ala(199)Ser(59)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Ser(198)Ser(62)--Ser(208)Met(I)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(197)Ala(63)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Asn(196)Gly(64)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(195)Arg(65)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(194)Val(67)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(193)Ser(69)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Thr(192)Val(77)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(191)Arg(80)--Ser(208)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(188)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--His(207)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Arg(187)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(206)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Lys(183)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Val(205)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Met(204)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Pro(203)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Leu(202)Met(1)，Thr(36)，或Cys(37)--Phe(201)优选的实施方案包括N-末端缺失Ala(63)--Ser(208)(KGF-2Δ28)和Ser(69)--Ser(208)(KGF-2Δ33)。其它优选的的N-末端与C-末端缺失突变体包括Ala(39)--Ser(208)；Pro(47)--Ser(208)；Val(77)--Ser(208)；Glu(93)--Ser(208)；Glu(104)--Ser(208)；Val(123)--Ser(208)；和Gly(138)--Ser(208)。其它优选的C-末端缺失突变体包括Met(1)，Thr(36)，或者Cys(37)--Lys(153)。
本发明还包括从N-末端和C-末端两者都缺失的氨基酸的缺失突变体。这样的突变体包括所有以上描述的N-末端缺失突变体与C-末端缺失突变体的组合，例如，Ala(39)--His(200)，Met(44)--Arg(193)，Ala(63)--Lys(153)，Ser(69)--Lys(153)，等等。利用本领域的技术人员所熟知的重组技术可以产生这些组合。
因此，供本发明的药物制剂使用的优选KGF多肽包括N-末端缺失突变体，包括那些含有图1(Seq ID NO2)中显示的氨基酸序列，但除了至少第一个38个N-末端氨基酸残基的缺失之外(即，图1(Seq ID NO2)中的至少Met(1)-Gln(38)但不超过其第一个147个N-末端的氨基酸残基的缺失)。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个38个N-末端氨基酸残基(即至少Met(1)-Gln(38)的缺失)但不超过其第一个147个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个46个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个62个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq IDNO2)中的至少第一个68个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个76个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个92个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq ID NO2)中的至少第一个103个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含具有一种缺失(该缺失将包括图1(Seq IDNO2)中的至少第一个122个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个137个N-末端的氨基酸残基)的突变体。
除含有以上描述的N-末端缺失突变体范围的KGF-2突变体的制剂之外，本发明还针对具有所有上述描述范围的制剂，即图1(Seq ID NO2)中的至少第一个62个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个62个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个62个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个62个氨基酸残基但不超过其第一个103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个68个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个76个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个68个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个92个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个68个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个103个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个46个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个62个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个46个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个68个N-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少第一个46个N-末端氨基酸残基但不超过其第一个76个N-末端氨基酸残基的缺失；等等。
在另一实施方案中，本发明提供了包含C-末端缺失突变体的制剂。优选地，所说的C-末端缺失突变体的N-末端氨基酸残基是图1(Seq ID NO2)中的第1个氨基酸残基(Met)，第36个氨基酸残基(Thr)，或者第37个氨基酸残基(Cys)。除了不包含至少最后的C-末端氨基酸残基(Ser(208)但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基的缺失(即图1(Seq ID NO2)中的氨基酸残基Glu(154)-Ser(208)的缺失)之外，包含突变体的这些制剂包含那些包含图1(Seq ID NO2)中所显示的氨基酸序列。或者，该制剂包含一种具有突变(该突变将包括图1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸残基但不超过最后的65个C-末端氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含一种具有突变(该突变将包括图1(Seq ID NO2)中的至少最后10个C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含一种具有突变(该突变将包括图1(Seq ID NO2)中的至少最后30个C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含一种具有突变(该突变将包括图1(Seq ID NO2)中的至少最后40个C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基)的突变体。或者，该制剂包含一种具有突变(该突变将包括图1(Seq IDNO2)中的至少最后50个C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基)的突变体。
除包含以上描述的C-末端缺失突变体范围的KGF-2突变体的制剂，本发明还针对具有所有上述描述范围的制剂，即图1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的10个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(seq ID NO2)中的至少最后的C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq IDNO2)中的至少最后的10个C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的20个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少最后的10个C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的30个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少最后的10个C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的40个C-末端氨基酸残基的缺失；图1(Seq ID NO2)中的至少最后的20个C-末端氨基酸残基的缺失，但不超过其最后的30个C-末端氨基酸残基的缺失；等等。
在另一实施方案中，KGF-2多肽可以是一个具有从N-末端和C-末端两者都缺失的氨基酸的缺失突变体。这样的突变体包括所有以上描述的N-末端缺失突变体与C-末端缺失突变体的组合。除图1(Seq ID NO2)中的至少第一个46个N-末端氨基酸残基但不超过第一个137个N-末端氨基酸残基的缺失和至少最后的C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基的缺失之外，这种突变体包括那些含有图1(Seq ID NO2)中表示的氨基酸序列。或者，一种缺失可包括图1(Seq ID NO2)中的第一个62个，68个，76个，92个，103个或122个N-末端氨基酸残基但不超过第一个137个N-末端氨基酸残基以及图1(Seq ID NO2)中的至少最后的10个，20个，30个，40个或50个C-末端氨基酸残基但不超过最后的55个C-末端氨基酸残基的缺失。还包括所有上述所描述的范围的组合。KGF-2取代突变体有用的KGF-2多肽包括那些具有氨基酸取代的多肽。天然的成熟KGF-2包含44个带电残基，其中32个带有正电荷。取决于这些残基在蛋白质的三维空间结构中的位置，用带负电荷或中性电荷的氨基酸取代一个或多个这些成簇的残基可以改变相邻氨基酸的静电相互作用，并且对增加蛋白质的稳定性和减少其凝聚作用可能是有用的。蛋白质的凝聚作用不仅仅导致其活性的丧失，当配制药物制剂时也成问题，因为它们可以具有免疫原性(Pinckard等，Clin.Exp.ImmuNOl.2331-340(1967)，Robbins等，糖尿病36838-845(1987)，Cleland等，Grit.Rev.Therapeutic DrugCarrier System 10307-377(1993))。任何修饰应该考虑到在蛋白质分子的三级结构中最大限度地减少电荷排斥。因此，具有特别兴趣的是用另一种电荷和用中性的或带负电荷的氨基酸取代