专利名称：一种白眉蝮蛇类凝血酶基因及其应用的制作方法国内外大量文献报道，在蝮亚科蛇毒中存在一种与血液凝固相关的蛋白酶，通常称为“类凝血酶”(Thrombin-like Enzyme,简称TLE)。类凝血酶与血液中的凝血酶(Thrombin)作用相似，可以将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，纤维蛋白凝结起到止血作用。到目前为止，已在30多种蝮科蛇毒中发现有TLE成分，许多研究人员也通过分子生物学方法克隆得到了 TLE基因，并得到了相对应的蛋白。、我国地大物博，蛇种类繁多，有7科174种之多，蛇毒资源丰富，我国也是蛇毒用于医疗最早的国家。目前已得到的蛇毒类凝血酶基因其来源各不相同，有尖吻蝮蛇毒腺组织、白眉蝮蛇毒腺组织、竹叶青蛇毒腺组织、乌苏里蝮蛇毒腺组织等，基本采用RT-PCR方法，长度均在230个氨基酸左右，并且这些基因及对应的氨基酸序列同源性均很高。杜道林等人从长白蝮蛇毒腺中克隆得到一个全长为708个核苷酸的类凝血酶基因，编码236个氨基酸，推测其活性中心为 His43，Asp88 和 Ser182，二硫键为 Cys7-Cys141, Cys28-Cys44, Cys76-Cys234,Cys120-Cys188, Cys152-Cys167 和 Cys178-Cys203,也是一种新型类凝血酶基因。
本发明的目的在于提供一种利用分子生物学方法得到的白眉蝮蛇类凝血酶基因及其作为止血/出血性疾病药物及血栓性疾病药物的应用。本发明的白眉蝮蛇类凝血酶基因是根据从中国长白山白眉蝮蛇心毒中分离得到的类凝血酶氨基酸序列，通过分子生物学手段获得，该种凝血酶基因由714个核苷酸组成，编码238个氨基酸，经生物信息学分析得知，是一种新型的蛇毒类凝血酶基因，该蛇毒天然类凝血酶基因及酶工程产品均可开发成为药物用于临床。其中，由该种白眉蝮蛇类凝血酶基因序列构成的蛇毒类凝血酶分子量为36kDa，等电点为6-7，可使含枸橼酸钠的人血浆在Imin内凝固；凝块在体内纤溶酶的作用下很快溶解，从而使血浆内的纤维蛋白原浓度降低，可用于治疗血栓性疾病。本发明以我国白眉蝮蛇毒为原料，利用生物化学方法分离纯化得到类凝血酶，再根据C、N端序列设计引物，以毒腺组织中Total RNA为模板，用RT-PCR方法克隆得到cDNA序列，测序结果显示该类凝血酶基因长714bp，经生物信息学分析得知，我们得到了一种新型的蛇毒类凝血酶基因，与其它白眉蝮蛇类凝血酶基因同源性超过90%。此外，本发明还提供了此蛇毒类凝血酶的分离纯化、克隆方法，具体如下 一、分离纯化 I )、白眉蝮蛇蛇毒用缓冲液浸泡、溶解过夜，离心去除沉淀，得上清液； 2)蛇毒上清液经SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析，上样结束后，用pH6. O的PBS缓冲溶液I进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用pH6. O含O. 2MNaCl的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；
3)将类凝血酶粗提液用pH8.O的PBS缓冲溶液III透析；
4)透析后样品经BenzamidineSepharose 6B亲和层析，上样结束后，用ρΗ8· O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行pH梯度洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集挂柱峰，得到单一组分的类凝血酶；
5)类凝血酶活性鉴别。_■、基因克隆
1)、引物设计；
2)、毒腺组织TotalRNA提取；
3)、以TotalRNA为模板，反转录得到类凝血酶cDNA ；
4)、将得到的cDNA连接载体，转化疋coli感受态细胞，筛选阳性克隆；
5)、对阳性克隆进行基因测序，测序结果进行生物信息学分析；
其中，步骤I)引物是根据分离纯化得到的类凝血酶蛋白C、N端序列设计，并在引物的5’端添加限制性酶切位点，方便后续试验操作。步骤3)反转录过程需要不断摸索变性、退火、延伸温度，以找到最合适的RT-PCR条件。步骤4)筛选阳性克隆我们选择的是蓝白斑筛选法，得到的白色菌落需要培养、提取质粒、双酶切进一步确认后，进行基因测序。本发明得到的白眉蝮蛇类凝血酶纯品比活约为4000U/mg，SDS-PAGE呈单一条带，HPLC分析纯度可达90%以上，收率可达80%以上。本发明获得的白眉蝮蛇类凝血酶活性良好,可制成各种止血药和治疗血栓性疾病的药物，如，稀释到规定的酶浓度后，添加合适的辅料，去除病毒、检验合格后分装，制成医用止血制剂，用于治疗手术等各种临床出血症状。


图I为白眉类凝血酶SDS-PAGE图，其中，Y :白眉类凝血酶，M :分子量Marker ;
图2为白眉蝮蛇类凝血酶cDNA琼脂糖凝胶电泳图，其中，M DL2000 Marker7Y =RT-PCR产物；
图3为cDNA核苷酸及相应的氨基酸序列图。

I、蛇毒类凝血酶的分离纯化
(1)将白眉蝮蛇蛇毒用pH6.O的50 mm PBS缓冲溶4°C浸泡、溶解过夜，4500rpm离心15min,去除沉淀,得上清液；
(2)蛇毒上清液经SPSepharose Fast Flow阳离子交换层析，上样结束后，用pH6. O的PBS缓冲溶液I进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用pH6. O含O. 2MNaCl的PBS缓冲溶液II直线洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集活性峰，得到类凝血酶粗提液；
(3)将类凝血酶粗提液用pH8.O的PBS缓冲溶液III透析；
(4)透析后样品经BenzamidineSepharose 6B亲和层析,上样结束后，用ρΗ8· O的PBS缓冲溶液III进行洗脱，紫外检测仪280nm检测，至读数达到基线后，再用梯度混合仪进行pH梯度洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集挂柱峰，得到单一组分的类凝血酶，见图I。实施例2
白眉蝮蛇类凝血酶鉴别
取实施例I中类凝血酶蛋白，加水制成每Iml中含Img的溶液，作为供试品溶液。取人-枸橼酸血浆[取枸橼酸钠38g，加水IOOOml溶解，按枸橼酸钠溶液-人血(I 9)比例 混合，3000转/min离心30min。取上清液分装成每支Iml,冷冻干燥,使用前加水Iml,摇勻，三小时内使用]0. 3ml，加400IU/ml肝素钠溶液O. 05ml，37 °C保温，Imin内，血浆应凝固，力口入1%三氯醋酸溶液1ml，振荡，凝块完全溶解，呈澄清透明溶液。取白眉蝮蛇类凝血酶，加水制成每Iml中含血凝酶100 μ g的溶液，为供试品溶液；取小试管，加入人-枸橼酸血浆O. 3ml，置37±0. 5°C水浴中保温2min，加供试品溶液
O.1ml，置37°C水浴中观察，血浆应在30s内凝固。实施例3
白眉蝮蛇毒腺Total RNA提取
a)取新鲜蛇毒腺组织，剪碎，置于I.5ml Ependorf管中，加入适量的RNAiso Plus试齐U，用一次性研磨件研磨组织，直至组织被研磨碎，添加RNAiso Plus到Iml,整个过程在冰上完成，温静直5min ；
b)将匀浆液转移至离心管中，室温静置5min；
c)12000 g 4。。离心 5 min ；
d)小心吸取上清液，移入新的离心管中(切勿吸取沉淀)；
e)向上述步骤中的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAisoPlus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15 s (氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心Ependorf管盖突然弹开)，待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5min ；
f)12000g 4。。离心 15min ；
g)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相，吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层);
h)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15-30°C下静置IOmin ；
i)12000g 4°C离心lOmin，一般在离心后，试管底部会出现沉淀；
j)RNA沉淀的清洗；小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇Iml (切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12000 g 4°C离心5 min后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)；k)RNA的溶解；室温干燥沉淀2-5 min (不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解)，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80°C保存。用I X TAE (用DEPC处理的水配制)制I. 0%的琼脂糖凝胶，电泳槽先用蒸馏水冲洗，然后用DEPC处理的水冲洗或浸泡一会，120V电泳25-30分钟。实施例4
反转录得到类凝血酶基因 反转录反应
I组分 阵积(μ ) I
MgCl2 2 I.
I3.Q^C. I Ojxdfi
IOxRTBufferι I
—30min
RNaseFreedH2O3.75.V …，
■ 5mm1 Cyde
DNTP Mixture (各 1—QfpM)I
5—XJ 5min
Rhiase Inhibitor0.25」
Reverse Transcriptase0.5
Oligo dT-Adaptor Primer0.5
Positive Control RNAI
Total10
I...........................................................................................................................................i..............................................................j
PCR反应
组分体积(μ!).~
__9412. 2min
SxPCR Buffer 10 17____94°Q 45sec I
灭菌蒸馏水 28.75 —IT—~ f30 c^des _;__60. 30sec
Ek Taq 0.25 , , I_Z__12 , liran
F-I0.5
R-10.5
Total40
其中，DL2000 Marker和RT-PCR产物的类凝血酶cDNA琼脂糖凝胶电泳图，见图2。实施例5
连接载体、转化宿主、筛选阳性克隆
将实施例4中得到的cDNA片段纯化，成份按照T-vector I μ I，cDNA 3 μ I，dH20 I μ I，Solution I 5μ I的体积要求加入PCR管中，16°C 12h。
重组质粒转化万.co7i JM109感受态细胞，操作如下
a)E.coli JM109感受态细胞置于冰上解冻，100 μ I转移至灭菌的PCR管内，加入重组质粒，轻轻混匀，冰上放置30min ；
b)42°C放置45-60s，冰上放置2-3min，加入37°C预热的800μ I SOC培养基，37°C震荡培养Ih ；
c)2000rpm离心2min,留取少量上清,混勻沉淀,全部涂布于Amp、X_gal、IPTG平板，37 °C过夜培养；
d)挑取白色菌落，37°C摇瓶培养过夜；
e)提取质粒，双酶切进一步验证； f)阳性重组质粒进行基因测序，具体见图3。实施例6 生物信息学分析
为了验证我们得到的蛇毒类凝血酶基因序列是否与Gene Bank发表的序列为相同序列，测序结果经生物信息学软件进行分析，结果显示，本发明得到的白眉蝮蛇类凝血酶基因与Gene Bank中序列同源性超过90%，为一种新型的类凝血酶基因。实施例7
白眉蝮蛇类凝血酶与尖吻蝮蛇、矛头蝮蛇毒类凝血酶体外凝血活性比较标准品溶液的制备取降纤酶标准品，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7. 4)制成每Iml中含20、10、5、2. 5单位的溶液。供试品溶液的制备取本品适量，用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(PH7. 4)(取三羟甲基氨基甲烷2. 42g与氯化钠O. 585g，加水适量溶解，用lmol/L盐酸溶液调节pH值至7. 4，加水稀释至500ml)制成标准曲线范围内浓度的溶液。测定法取试管(101^10011)4支，各精密加入0.4%纤维蛋白原溶液；取纤维蛋白原，用上述三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Ph7. 4)制成O. 4%可凝蛋白溶液]O. 2ml，置(37±0. 5) °C水浴中保温2分钟，依次精密量取4种浓度的标准品溶液各O. 2ml，迅速加入上述各试管中，立即摇匀，同时计时，于(37±0. 5) °〇水浴中观察纤维蛋白原的初凝时间，每种浓度测5次，求平均值(5次测定最大与最小值之差不得超过平均值的10%，否则重测)。在双对数坐标纸上以标准品单位数(U)为横坐标，初凝时间为纵坐标计算回归方程(相关系数应大于O. 99)。取三种蛇毒类凝血酶溶液按上法测定，用直线回归方程求得每Img的单位数，白眉蝮蛇类凝血酶、尖吻蝮蛇类凝血酶、矛头蝮蛇类凝血酶比活力分别为3700U/mg、3100U/mg、3200U/mg。实施例8
白眉蝮蛇类凝血酶与尖吻蝮蛇、矛头蝮蛇类凝血酶体内凝血活性比较将40只昆明小鼠，体重(19. 5±1. 5)g，随机分成4组，实验组和对照组，每组10只，雌雄各半。实验组按0.5 U/kg剂量、O. I ml/10g给药体积于小鼠尾静脉注射，对照组注射生理盐水。末次给药后30 min，取小鼠置于固定器中，使其尾部垂直，距尾尖5 mm处剪断，每隔30 s左右用滤纸轻触尾部断处，直至停止出血为止，记录断尾至停止出血的时间即为尾出血时间。结果显示，实验组小鼠尾部出血时间明显短于对照组，白眉蝮蛇类凝血酶的小鼠尾部出血时间明显短于其他试验组，白眉蝮蛇类凝血酶可使小鼠尾部在20 min左右停止出血。
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不同来源的类繼Il酶对小鼠尾部出血时间的影响
组别丨 齐懂(U-kg-Q出血对网(mm)
变白对■!§ i =35 O ±3.94
白β·蛇突凝血_ O- 520 6 ± 2.95
尖吻蠛蛇类礙倉_ O 5271 2-98
矛头蠖蛇类礙血_ O 529.0 ± 3.50


一种白眉蝮蛇类凝血基因从中国长白山白眉蝮蛇(Gloydiusussuriensi)毒中分离得到的类凝血酶氨基酸序列，通过分子生物学手段获得，该种凝血基因由714个核苷酸组成，编码238个氨基酸，经生物信息学分析得知，是一种新型的蛇毒类凝血酶基因，该蛇毒天然类凝血基因及酶工程产品均可开发成为药物用于临床。