专利名称：Pi3k抑制剂和mek抑制剂的组合的制作方法促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号级联放大转导肿瘤细胞内的多种增殖和分化信号。已鉴别出四种MAPK途径胞外信号调节激酶(ERK)、C-JunNH2-末端激酶(JNK)、p38激酶和 ERK5 (Johnson and Lapadat, Science2002; 298 (5600) : 1911-2)。不同的细胞外信号可刺激这些途径中的一种或多种。在RAS/RAF/MAPK/ERK途径在应答多种细胞外信号时在介导细胞生长和分化中发挥重要作用。Ras-GTP激活Raf激酶，所述Raf激酶随后激活MEK/ERK途径并推动细胞增殖(Downward, Nat Rev Cancer. 2003; 3 (I) : 11-22)。为了调节细胞增殖，激活的 ERK 易位到细胞核并通过激活数种重要的转录因子而调节基因表达。RAS/RAF/MEK/ERK途径的异常调节助长了失控增殖、侵入、转移、血管发生和凋亡减少。预期在高度依赖来自RAS/RAF/MEK/ERK信号传导途径的增殖信号的肿瘤中，MEK抑制剂是最有效的。EGFR突变和/或过表达以及KRAS、NRAS和BRAF致癌基因突变在多种癌症中激活该途径。在所有实体瘤的约30%中，RAS为突变的(Wellcome Trust SangerInstitute，COSMIC数据库)。在胰腺癌(90%)、结肠直肠癌(30%-50%)和非小细胞肺癌(30%)中以高发生率发现致癌 KRAS 突变(Johnson et al. , Nature 2001;410:1111-1116)。已在多种恶性肿瘤中鉴别出B-RAF致癌基因(例如，B-RAFv6cicie)中激活的体细胞突变，其中在恶性黑素瘤(60%-80%)、甲状腺乳头状癌(35%-70%)、结肠直肠癌(约10%)和子宫内膜癌(10%-20%)中的发生率最高。被B-RAFv6qqeR化的癌细胞对MEK抑制特别敏感。因此，MEK抑制剂在黑素瘤和隐匿B-RAFv6we突变的其它肿瘤中可具有特别的临床用途(Solit，Nature2006 ；441:424-30)。磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase) (PI3K)信号传导途径是刺激细胞增殖、促进存活和抑制凋亡的受体酪氨酸激酶的主要下游效应因子，例如人表皮生长因子-2(HER2)、表皮生长因子受体(EGFR)和胰岛素样生长因子_1受体。已在大量癌症类型中鉴别出该重要信号传导途径的异常调节(通过多种机制发生)。所述途径在多种肿瘤类型中被肿瘤抑制基因磷酸酶(tumor suppressor phosphatase)和张力蛋白同源体(tensinhomolog) (PTEN)(抵抗PI3K激酶活性的磷酸酶)的缺失组成性激活(Li et al. , Science1997;275:1943-7 ；Steck et al.，Nat Genet 1997;15:356-62)。AKT(PI3K 的下游靶标)在一些肿瘤类型中过表达(Staal, Proc Nat Acad Sci USA 1987;84(14) :5034-7 ；Cheng et al. , Proc Nat Acad Sci USA 1992;89(19):9267-71 ;Bellacosa et al. , IntJ Cancerl995; 64 (4) : 280-5)并且已被证明为转化的(Aoki et al. , Proc Nat Acad SciUSA1998; 95 (25) : 14950-5)。已在多种不同肿瘤类型中观察到PI3K- a (属于PI3K家族 IA 类)的激活突变(Bachman et al. , Cancer Biol Ther 2004; 3:772-5 ;Samuels etal., Science 2004;304:554)。经证明，这些激活突变促进癌细胞的生长和侵入，而这些作用被PI3K抑制剂抑制。综上所述，这些数据为开发PI3K途径信号传导的抑制剂作为人癌症治疗策略提供强有力理论。多种癌症(例如，黑素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌)具有、高且重叠频率的激活RAS和PI3K途径的致癌突变。此外，在肿瘤细胞中，抑制一种经激活的途径可导致另一种途径的激活；此外，对RAS和PI3K途径都抑制代表了一种新的抗癌策略。因此，联合抑制MEK和PI3K为有前景的治疗癌症的方法。
本发明涉及用4-(2_(lH-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-I-基)甲基)噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-基)吗啉(I)(也称作⑶C-0941)或(S)-I-(4-((2-(2-氨基嘧啶-5-基)-7-甲基-4-吗啉代噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基)甲基)哌嗪-I-基)-2-羟基丙-I-酮(II) (US 2008/0076768 ；W0 2006/046031) (二者都抑制 PI3K)与本申请描述的MEK抑制剂的组合治疗患有局部晚期实体瘤或转移性实体瘤的患者的方法。本发明进一步涉及I或II与MEK抑制剂的联合疗法，其中所述抑制剂为[3，4- 二氟-2- (2-氟-4-碘-苯基氨基)-苯基]-((S)-3-羟基-3-哌啶-2-基-氮杂环丁烷-I-基)-甲酮(也称作GDC-0973/XL-518)(III)。本发明进一步涉及可用在联合疗法中的I或II和III的剂量和用于实施用I或II和III进行的联合疗法的给药方案。图I显示针对⑶C-0941和⑶C-0973所观察到的体外协同作用。将⑶C-0941和⑶C-0973在黑素瘤细胞系组和NSCLC细胞系组中的联合指数(Cl)作图。每个点代表一个单独的细胞系。根据 Chou and Talalay (1984) (Adv. Enz. Regul. 198422:27-55)方法，联合指数〈O. 3表明强协同作用，联合指数〈O. 7表明协同作用。图2 显示⑶C-0973 和⑶C-0941 在 NCI-H2122 (NSCLC, K-Rasci2c)突变体异种移植物模型中的联合。将NCI-H2122细胞(lOxlO6，于Hanks平衡盐溶液(HBSS)+基质胶(matrigel)中)接种到裸小鼠(nu/nu)中并使肿瘤长至平均体积为 240mm3。然后开始处理，给药媒介物(空心圆，小虚线，n=10) > GDC-0941 (50mg/kg,每天一次，口服给药；半实心方形，虚线，n=5)、⑶C-973(5mg/kg,每天一次，口服给药；实心三角形，大虚线，n=5)或⑶C-0941和⑶C-0973的组合(实心菱形，实线，n=5)。在整个研究过程中，每3_4天用测径器测量动物的肿瘤并测量动物体重，计算肿瘤体积(TV= [Lx (W2)]/2)并作图+/-SEM。通过计算每个处理组相对于媒介物对照的曲线下面积(AUC)来计算肿瘤生长抑制百分比(%)。对第21天的数据进行Student’ s t检验,从而通过p_值确定显著性。图3 显示⑶C-0973 与( C-0941 在 A2058 (黑素瘤，B-RafV600E, PTENnul1)突变体异种移植物模型中的联合。将A2058细胞(lOxlO6，于Hanks平衡盐溶液(HBSS) +基质胶中)接种到裸小鼠(nu/nu)中并使肿瘤长至平均体积为 190mm3。然后开始(A)处理，给药媒介物(空心圆，小虚线，n=7)、⑶C-0941 (30mg/kg,每天一次，口服给药；半实心方形，虚线，n=7)、⑶C-973(6mg/kg,每天一次，口服给药；实心三角形，大虚线，n=7)或⑶C-0941与⑶C-0973的组合(实心菱形，实线，n=7)。然后开始(B)处理，给药媒介物(空心圆，小虚线，n=7),⑶C-0941 (100mg/kg，每天一次，口服给药；半实心方形，虚线，n=7),⑶C-0973(10mg/kg,每天一次，口服给药；实心三角形，大虚线，n=7)或⑶C-0941与⑶C-0973的组合(实心菱形，实线，n=7)。在整个研究过程中，每3_4天用测径器测量动物的肿瘤并测量动物体重，计算肿瘤体积(TV=[L x(ff2)]/2)并作图+/-SEM。通过计算每个处理组相对于媒介物对照的曲线下面积(AUC)来计算肿瘤生长抑制百分比(%)。对第21天的数据进行Student’ s t检验,从而通过p_值确定显著性。图4显示⑶C-0941和⑶C-0973在(A) FaDu (咽下鳞状上皮细胞癌)异种移植物模型和(B)SK0V-4(卵巢癌)异种移植物模型中的联合。对于(A ) FaDu (咽下鳞状上皮细胞癌)异种移植物模型，然后开始(A)处理,给药媒介物(空心圆))、⑶C-0941 (100mg/kg，每天一次，口服给药；实心三角形)、⑶C-973(5mg/kg,每天一次，口服给药；实心方形)或GDC-0941和GDC-0973的组合(实心菱形，实线，n=7)。对于(B) SK0V-4 (卵巢癌)异种移植物模型，然后开始处理，给药媒介物(空心圆)、⑶C-0941 (100mg/kg,每天一次，口服给药；实心三角形)、⑶C-0973 (10mg/kg,每天一次，口服给药；实心方形)或⑶C-0941和⑶C-0973的组合(实心菱形)。在整个研究过程中，每3-4天用测径器测量动物的肿瘤并测量动物体重，计算肿瘤体积(TV= [Lx(W2)]/2)并作图+/-SEM。通过计算每个处理组相对于媒介物对照的曲线下面积(AUC)来计算肿瘤生长抑制百分比(%)。对第21天的数据进行Student’ s t检验,从而通过p-值确定显著性。图5显示⑶C-0941和⑶C-0973在(A)M0LM_16 (急性髓细胞性白血病)异种移植物模型和(B)MX-I (三阴性乳癌)异种移植物模型中的联合。对于(A)M0LM-16(急性髓细胞性白血病)异种移植物模型，将##A2058细胞(lOxlO6，于Hanks平衡盐溶液(HBSS) +基质胶中)接种到裸小鼠(nu/nu)中并使肿瘤长至平均体积为 190mm3。然后开始(A)处理，给药媒介物(空心圆))、⑶C-0941(100mg/kg，每天一次，口服给药；实心三角形)、⑶C-973 (10mg/kg，每天一次，口服给药；实心方形)或⑶C-0941和⑶C-0973的组合(实心菱形，实线，n=7)。对于⑶MX-I(三阴性乳腺癌)异种移植物模型，然后开始处理，给药媒介物(空心圆)、⑶C-0941 (100mg/kg,每天一次，口服给药；实心三角形)、⑶C-0973 (5mg/kg,每天一次，口服给药；实心方形)或⑶C-0941和⑶C-0973的组合(实心菱形)。在整个研究过程中，每3-4天用测径器测量动物的肿瘤并测量动物体重，计算肿瘤体积(TV= [Lx(ff2)]/2)并作图+/-SEM。通过计算每个处理组相对于媒介物对照的曲线下面积(AUC)来计算肿瘤生长抑制百分比(%)。对第21天的数据进行Student’ s t检验，从而通过p-值确定显著性。图6a和6b显示用于⑶C-0973和⑶C-0941组合的给药方案。
现在要详细提及本发明的一些实施方案，其实例在随附结构和式中说明。尽管结合所列举的实施方案对本发明进行描述，但应当理解的是它们并不是将本发明限制为这些实施方案。相反，本发明预期涵盖可包括在本发明范围内的所有可选择物、变化和等同物。本领域技术人员会识别出与本申请描述的那些方法和物质类似的可用于实施本发明的多种方法和物质。本发明绝不限于所描述的方法和物质。在所引用的文献、专利和类似材料中的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术等)，以本申请为准。当短语〃包含(comprise)〃、〃 包含(comprising) 〃、〃 包括(include) 〃 和〃包括(including) 〃用在该说明书和权利要求书时，其预期具体说明存在所指出的特征、整数、组分或步骤，但它们不排除还存在或添加一个或多个其它特征、整数、组分、步骤或它们的组。术语〃治疗(treat) 〃和〃处理(treating) 〃既指治疗性处理又指预防性或防御性措施，其中防止或减慢(减轻)受试者发生不期望的生理变化或障碍，例如癌症的生长、发展或扩散。对于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病的严重程度、稳定(即，不恶化)疾病的状态、延迟或减慢疾病进展、改善或缓和病症和消退(包括部分或全部)，这些结果为可检测的或不可检测的。〃治疗〃和〃处理〃也可指与未 接受处理的预期存活相比延长存活。需要处理的受试者包括已患有所述病症或障碍的受试者也包括倾向于患有所述病症或障碍的受试者或所述病症或障碍待被预防的受试者。术语〃局部晚期实体瘤或转移性实体瘤〃包括黑素瘤，非小细胞肺癌("NSCLC")，结肠直肠癌、胰腺癌、乳癌和卵巢癌。〃代谢物〃为特定化合物或其盐通过体内代谢产生的产物。可使用本领域已知的常规技术识别化合物的代谢物，并且用例如本申请描述的那些试验确定它们的活性。所述产物可由所给予化合物的例如氧化、还原、水解、酰胺化、脱酰胺化、酯化、脱酯化、酶剪切等产生。因此，本发明包括本发明化合物的代谢物，包括通过以下方法产生的化合物使本发明化合物与哺乳动物接触足以得到其代谢产物的一段时间。
本申请使用的短语〃药用盐〃是指本发明化合物的药用有机或无机盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、枸橼酸盐、乙酸盐、草酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式枸橼酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐“甲磺酸盐(mesylate) ”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和扑酸盐(pamoate)(即，1，I’-亚甲基-二 - (2-羟基-3-萘甲酸盐))。药用盐可涉及包含另一种分子例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。所述抗衡离子可使母体化合物上的电荷稳定的任意有机或无机部分。此外，药用盐可在其结构中具有不止一个带电原子。在多个带电原子为药用盐的部分的情况下，所述药用盐可具有多个抗衡离子。因此，药用盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。如果本发明化合物为碱，则期望的药用盐可通过本领域可用的任意适当方法制备，例如用无机酸或有机酸处理游离碱，所述无机酸为例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，所述有机酸为例如乙酸、马来酸、琥珀酸、扁桃酸、富马酸、丙二酸、丙酮酸、草酸、轻基乙酸、水杨酸、卩比喃糖基酸(pyranosidyl acid)如葡萄糖醒酸或半乳糖醒酸、a-羟基酸如枸橼酸或酒石酸、氨基酸如天冬氨酸或谷氨酸、芳族酸如苯甲酸或肉桂酸、磺酸如对甲苯磺酸或乙磺酸等。通常被认为适于由碱性药物化合物形成药学有用的或可接受的盐的酸由例如以下文献讨论Stahl et al, Camille (eds. )Handbook ofPharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002)Zurich:ffiley-VCH ；Bergeet al, Journal of Pharmaceutical Sciences(1977)66 (I)I 19 ；Gould, InternationalJ. of Pharmaceutics(1986)33 201 217 ；Anderson et al, The Practice of MedicinalChemistry (1996) , Academic Press,New York ;Remington’ s PharmaceuticalSciences, 18th ed. , (1995)Mack Publishing Co. , Easton PA ；and in The OrangeBook (Food & Drug Administration, Washington, D. C.，参见其网站)。若本发明化合物为酸，则期望的可药用盐可通过本领域可用的任何合适方法来制备，例如用无机或有机碱(如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等)处理游离酸。合适盐的示例性实例包括但不限于从以下物质得到的有机盐氨基酸如甘氨酸和精氨酸、氨、伯胺、仲胺和叔胺以及环状胺如哌啶、吗啉和哌嗪；以及从以下物质得 至IJ的无机盐钠、隹丐、钾、镁、猛、铁、铜、锌、招和锂。短语〃药用的〃表示所述物质或组合物必须与制剂包含的其它成分和/或用其治疗的哺乳动物在化学上和/或毒理学上是相容的。〃溶剂化物〃是指一种或多种溶剂分子与本发明化合物的物理性缔合或络合。本发明化合物可按非溶剂化和溶剂化形式存在。形成溶剂化物的溶剂的实例包括但不限于水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMS0、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。术语〃水合物〃是指当溶剂分子是水时的络合物。该物理性缔合牵涉不同程度的离子和共价键合，包括氢键键合。在一些情况下能够分离出所述溶剂化物，例如当一个或多个溶剂分子结合在结晶固体的晶格中时。溶剂化物的制备通常是已知的，例如Caira et al, J. PharmaceuticalSci.，93(3)，601611 (2004)。溶剂化物、半溶剂化物、水合物等的类似制备由van Tonder etal, MPS PharmSciTech. ,5(1), article 12(2004) ；and Bingham et al, Chem. Commun. , 603604(2001)描述。一种常见的非限制方法包括在高于环境温度将本发明化合物溶解在期望量的期望溶剂(有机的或水或它们的混合物)中，并以足以形成晶体的速度冷却所述溶液，然后通过标准方法分离所述晶体。分析技术例如LR.光谱法证明在所述晶体中存在溶剂(或水)，其为溶剂化物(或水合物)。尽管近来在人类肿瘤分布和小分子以及大分子药物设计上的进展导致发现靶向治疗法(该靶向治疗法改变了疾病最初要发展的历史)，但靶向药物在肿瘤学中的总成功率仍很低，这可能部分归因于多种癌症的异质性以及所述靶标发挥作用的复杂途径(牵涉多重多余途径和多种分子途径间的互扰)。解决该问题的一种方法为用靶向药物的组合来治疗肿瘤，例如既靶向MAPK/ERK途径又靶向PI3K/AKT/mT0R途径。这些途径为独立的，在多种肿瘤中共同推动增殖，并且在肿瘤中被多种基因组事件激活。该方法具有双重益处其具有增加肿瘤中由多种致癌事件推动的初始肿瘤应答率的潜力以及降低单独用任一种药物会发生的获得性抗性的几率。这是由于抑制了激活的补偿途径，该抑制随后会使组合的活性延长，超过单独用任一种药物所见到的活性。PI3K-AKT途径激活已牵涉在数种类型的癌症中(Ward et al.，ChemBio12003;10:207-13 ;Cantley，In: The Harvey Lectures, Series 100，2004-2005.Hoboken: John Wiley and Sons Inc.，2006:103-22)。通常在肿瘤中发现 PI3KpllO a 亚单兀中的激活和转化突变(Bachman et al. , Cancer Biol Ther 2004 ;3:772-5 ;Samuels etal. , Science 2004; 304:554 ；Karakas et al. , Br J Cancer2006 ;94:455_9)。此外，所述途径在多种类型癌症中被受体酪氨酸激酶信号传导、RAS突变或磷酸酶PTEN的缺失激活(Cantley, Science2002;296:1655-7)。单独靶向这些途径中的任一种可削弱信号传导并已被证明在一些动物模型中是有效的(Folkes et al. , J Med Chem 2008; 51:5522-32 ;Hoeflich et al. , Clin CancerRes, 200915 (14) : 4649-4664))。然而，在多种肿瘤中，细胞增殖和存活由多重效应因子途径推动，例如在RAS和PI3K途径共同激活的肿瘤中(如经常在黑素瘤，肺癌和结肠直肠癌中所见到的那样)。在这些情况下，非临床性靶向这两种途径已被证明明显比单独靶向任一种途径更有效。例如，MEK和PI3K抑制剂在肺癌或乳癌的KRAS突变小鼠模型中表现出与 单独药物相比提升的组合效力(Engelman et al. , Nat Med 2008; 14:1351-6 ；HoefIich etal. , Clin Cancer Res, 200915 (14) : 4649-4664))。证明 MEK 抑制剂和 PI3K 抑制剂体外和体内组合效力的非临床数据在本申请和US2009/0098135中描述，将US2009/0098135的内容并入本申请作为参考。由于非临床模型表明对PI3K和MEK途径都抑制导致效力提升(特别是在RAF和RAS突变基因型中)，因此MEK抑制剂(例如GDC-0973)和PI3K抑制剂(例如⑶C-0941)的组合在患有局部晚期实体瘤或转移性实体瘤的RAS/RAF突变患者中是特别有益的。本发明涉及用组合形式的4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲基磺酰基)哌嗪-I-基)甲基)噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-基)吗啉- (I)(也称作⑶C-0941)或
(S)-I-(4- ((2- (2-氨基嘧啶-5-基)-7-甲基-4-吗啉代噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基)甲基)哌嗪-I-基)-2-羟基丙-I-酮(II) (US 2008/0076768 ；W0 2006/046031) ( 二者都抑制PI3K)和US2009/0156576中描述的MEK抑制剂治疗患有局部晚期实体瘤或转移性实体瘤的患者的方法，将US2009/0156576的全部内容并入本申请作为参考。
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(I)、N NH2 (n)⑶C-0941或 II 可按照 US 2008/0076768，US2008/0207609, US2008/0207611 和US2009/0131429(将它们的全部内容并入本申请作为参考)中描述的方法制备。用于与⑶C-0941 (PI3K抑制剂)联合以如本申请的方法中所述治疗患有局部晚期实体瘤或转移性实体瘤的患者的所述MEK抑制剂(包括GDC-0973/XL-518 (III))列在下面的表I中。表I的MEK抑制剂(包括⑶C-0973/XL-518)可按US2009/0156576中描述的方
法制备。


本发明涉及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶或PI3K)抑制剂和促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制剂的组合治疗患有局部晚期实体瘤或转移性实体瘤的患者的方法。