专利名称：用于检测结直肠癌pik3ca基因热点突变位点的试剂盒的制作方法结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是最常见的恶性肿瘤之一，随着人们生存环境及生活方式的改变，CRC的发病率呈现逐年上升的趋势，全球毎年新增病例约ー百万，约五十万患者因其死亡。人类恶性肿瘤的发生与多种因素有关，具有复杂的分子基础，是多步骤、多基因改变的复杂过程。癌基因PIK3CA的发现为我们研究肿瘤的发生发展提供了新的方向，进ー步认识癌基因PIK3CA突变作用对于掲示结肠癌发生发展的分子机制具有重要的意义。PIK3CA是ー种体细胞突变癌基因，PIK3CA基因突变导致的PIK3CA过度表达可以导致PI3K的催化活性增强，促使细胞癌变，有致癌的功能。对PI3K家族全部成员的激酶结构域外显子编码区域进行序列分析显示，PIK3CA是唯一一个可以发生体细胞突变引起致癌的基因，在结肠癌中突变率达32%。PIK3CA基因是由Volinia在1994年利用原位杂交技术检测到的，其定位于3q26. 3，长34kb，包含20个外显子，编码1068种氨基酸，该组氨基酸产生ー组长124kD的蛋白。PIK3CA编码PI3Ks的pi 10催化亚单位，即PI3Kpll0a。近年来随着结肠癌发病率的增高，深入研究结肠癌的发生发展机制，做到早预见、早发现、早诊断、早治疗成为结肠癌防治的重点。大量数据表明PIK3CA中约90%突变发生在螺旋区(exon9)和激酶区(eXon20)这两个热点区域。这两个突变热点均能增强PI3K的脂质激酶活性，因此，检测PIK3CA蛋白不仅可以做到结肠癌的早期诊断及判断预后，对于结肠癌患者选择合理的化疗药物提高化疗效果亦具有重要的临床意义。 目前，PIK3CA基因突变现有的检测方法包括普通测序法、焦磷酸测序法以及荧光定量PCR法等。在实际应用中，用于检测结直肠癌PIK3CA基因突变的方法主要为直接测序法，尽管该法为金标准，但是如果突变率低于15%，会发生漏检的现象，且试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，因而一定程度上限制了该法的应用。焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是ー种新的序列分析技术,是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要。在这种情况下，Sanger法未必是最合适的DNA序列分析技木。而焦磷酸测序技术是目前最适合这些应用的DNA序列分析技木。其特点是操作简便、大通量、自动化，适合大量样本的快速检测，根据峰值对序列的突变位点进行判读，从而实现PIK3CA基因突变位点的定点检测
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供用ー种快速，准确，高通量的PIK3CA基因热点突变(E542K、E545K和H1047R)检测试剂盒。用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水こ醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX ;检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX，其序列为9F Biot i n-CAGAGTAACAGACTAGCTAGAG, 9R GTTTAAAAATCATGTAAATTCTGC,9RCX CCACAGAAAATCTTTCTCCT ；20F BiOt in-CTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTAT,20R TTTCTGTTCTTGCTGTAAATTC,20RCX :GTTGTCCAGCCACCA。进ー步地，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(I)采集待测血液样本，提取DNA ；(2)以该DNA为模板，用权利要求I所述用于扩增样本DNA中PIK3CA基因的对应PCR引物9F、9R、20F、20R进行扩增，得到PCR反应产物；(3)对PCR反应产物用测序引物9RCX、20RCX进行焦磷酸测序，确定是否存在突变。优选地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 5min ；98°C 30s,58°C 30s、68°C 30s, 35 个循环；最后 68°C 5min。本发明根据PIK3CA基因热点突变位，分别设计了外显子9和20PCR扩增引物以及焦磷酸测序引物。表I.外显子9-20引物序列本发明公开了用于检测结直肠癌PIK3CA基因热点突变位点的试剂盒，包括红细胞裂解液、全血DNA抽提试剂、无水乙醇、PCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品以及焦磷酸测序反应液，其特征在于所述试剂盒包括检测9外显子目的基因上下游引物9F-Biotin、9R、测序引物9RCX；检测20外显子目的基因上下游引物20F-Biotin、20R、测序引物20RCX。可检测出与结直肠癌相关的PIK3CA基因热点突变位点(E542K、E545K和H1047R)多态性，特异性好，准确度高。