Mek1基因突变的快速检测方法[0002]MEKl基因位于人染色体15q22.1-22.33，基因全长约104kb，转录后mRNA长2603bp，编码一个由393个氨基酸残基组成的丝裂原活化蛋白激酶激酶，是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。[0003]MEKl蛋白参与MAPK级联信号传导，其受MAPKKK激活，活化后的MEKl通过共价修饰即双位点磷酸化激活MAPK。MAPK活化后，磷酸化下游底物(转录因子、蛋白激酶、酶、结构蛋白等)，以此调控细胞的生长、增殖、分化、凋亡和粘附、迁移等过程，继而影响肿瘤的发生、侵袭、转移以及耐药性。[0004]MEKl基因的突变与多种肿瘤的发生发展相关。其突变位点分布广泛，热点突变位点集中于外显子2和外显子3，如图1所示。Estep等研究显示，卵巢癌中易发生外显子2上D67N的突变。Marks等研究显示，在肺癌中存在外显子2上K57N突变。Murugan等研究显示，在结肠癌中存在D67N突变，在黑素瘤中存在K57N突变。这些结果显示，针对MEKl基因突变的检测对多种肿瘤的预防和早期诊断有重要意义。 [0005]高分辨率熔解曲线(HRM)是传统的熔解曲线分析的延伸:它要求特殊的荧光染料、高性能的荧光定量PCR与专门的分析算法。使我们可以不必测序直接筛查PCR扩增产物中是否存在遗传学变异(SNPs, mutations)。[0006]SYBRTM Green I 对 PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料，又因为它是非饱和态结合，染料在熔解过程中可重新结合，使其无法适用于HRM。[0007]罗氏开发了一种新的适用于HRM的染料ResoLight或LC Green,它有三个优点:饱和染料毒性低；高浓度可以使DNA达到饱和；降低了染料位置重组的可能。[0008]而，PCRPCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应产物的高分辨率溶解曲线HRM的要求:[0009]仪器:高分辨率高均一性的仪器，确保结果差异仅受DNA模板的影响
[0010]试剂:稳定可靠的PCR与HRM染料，确保获取高分辨率熔解曲线
[0011]软件:高分辨率熔解曲线分析专用软件
[0012]罗氏突光定量PCR系统LightCycler Nano System具有光源好、温控好、检测好、加热快的优点，完全能满足检测的要求，这台仪器也于近期通过了国家药监局的审批，适用于临床诊断检测。
[0013]LightCycler Nano System是LightCycler 480 System 的缩小版,ightCyc ler?480在HRM领域发表的文献是当前发表文献最多的实时定量PCR
[0014]系统:应用领域包括人类疾病、植物、微生物、病毒、药理、毒理、生理、诊断等；影响因子 10 分以上 5 篇，包括 Nature, Nature Methods, Nature Genetics,影响因子 5 — 10分10篇，5分以上文章占总数的18%逐年上升趋势明显，已经成为当前qPCR扩展应用的热点目前常常使用测序法来检测是否存在突变，但是总结下来，现有的测序法有三个缺点:
[0015]第一:灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；
[0016]第二:耗时长，一般需要2-3天；
[0017]第三:成本高。
[0018]鉴于以上的问题，一种灵敏度高、耗时短、成本低、可操作性能更高的实MEKl基因突变的快速检测方法的发明是势在必行的。

[0019]本发明要解决的技术问题主要是:现有的测序法有三个缺点:
[0020]第一:灵敏度不高，低比例突变(< 20%)无法检测；
[0021]第二:耗时长，一般需要2-3天；
[0022]第三:成本高。
[0023]为了解决以上问题，本发明提供了一种丝裂原活化蛋白激酶I (MitogenActivated protein Kinase Kinase 1，MEK1/MAPKK1)基因突变的快速检测方法,本发明技术在突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物，两者分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型(Tm的不同):PCR产物的Tm取决于GC含量.[0024]高Tm G: C>A: T>G: G>G: T=G: A > T:T=A: A>T:C>A: OC: C 低 Tm
[0025]纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；当然，包括野生型纯合子或突变纯合子。
[0026]杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.[0027]本发明分别设计了 MEKl第2号外显子(MEK1-E2)和第3号外显子(MEK1-E3)的野生型引物和突变型引物，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段，不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。
[0028]即，为解决上述技术问题，本发明提供了一种MEKl基因突变的快速检测方法，其包括如下实现步骤:
[0029]在MEKl基因突变位点两端设计一对野生型引物，并在突变位点上设计一对突变引物；
[0030]分别设计了 MEKl第2号外显子(MEK1-E2)和第3号外显子(MEK1-E3)的野生型引物和突变型，引物分别扩增出野生型模板和突变型模板，再用野生型引物对两种模板进行PCR扩增，分别扩增对应的野生型目的片段和突变型目的片段；
[0031]不同比例混合这两种片段，用HRM方法进行区分。
[0032]所述PCR产物的高分辨率熔解曲线基于HRM的基因分型-Tm的不同，PCR产物的Tm取决于 GC 含量；所述高 Tm G: OA: T>G: G>G: T=G: A>T:T=A: A>T:C>A: OC: C低Tm。
[0033]所述纯合子包括野生型纯合子或突变纯合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到相似峰形的熔解曲线；杂合子样品的扩增产物进行熔解曲线，得到不同峰形的熔解曲线.[0034]所述不同比例混合这两种片段，使突变型目的片段的含量为1/10、1/100、1/1000和0，最后用HRM方法进行区分。
[0035]所述的一种MEKl基因突变的快速检测方法，其包括如下步骤:
[0036]样本处理:取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀,4°C保存；
[0037]DNA提取:取200 μ L抗凝血用QIAmp DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；
[0038]qPCR-HRM检测，包括:对照孔的设立和检测重复孔；10 μ L反应体系构成；在八连管中依照次序加入各试剂，混合均匀；所有样本混合完后，将八连管置于罗氏荧光定量PCR系统-LightCycler Nano仪器中进行程序性检测；
[0039]结果分析及判定:在高分辨率熔解曲线分析方法中，以阳性对照孔为分界线，样本孔与基线差异大于阳性对照孔的判定为突变型，差异小于阳性对照孔的判定为野生型。
[0040]所述qPCR-HRM检测的程序包括:95°C变性10分钟；95°C变性10秒钟；退火采用探底式，设置探底退火温度为55-65 °C，每个循环降低1°C，时间为10秒钟；72°C延伸30秒钟；重复第2步到第四步45个循环；95°C变性60秒钟；40°C
[0041]变性60秒钟；设置高分辨率熔解温度从60°C到95°C，缓变率是0.05°C /s)。
[0042]所述MEK1-E2突变型目的片段的获取包括:利用带有突变位点的突变引物(MEK1-E2 L42F F，MEK1-E2 L42F R)获得突变位点前后两段突变片段；将这两段突变片段连接起来，构成MEK1-E2突变型目的片段。
[0043]所述MEK1-E2突变型目的片段的获取包括:
[0044]突变第一步PCR:以稀释后的野生型目的片段为模板，分别以MEK1-E2 F+MEK1-E2L42F R, MEK1-E2 L42F F+MEK1-E2 R为引物进行两组实验，获得两个条带单一的片段；
[0045]突变第一步产物稀释:将突变第一步获得的两段PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为IOng/ μ L ；
[0046]突变第二步PCR:以稀释后的第一步两段产物为模板，以ΜΕΚ1-Ε2 F+MEK1-E2R为引物进行第二步PCR，获得条带单一的片段；
[0047]突变第二步产物稀释:将突变第二步获得的PCR产物稀释I万-10万倍，终浓度约为 IOng/μ L ；
[0048]所述M/W = 1/10、1/100、1/1000阳性对照模板的获取包括:混合9 μ L野生型模板和IyL突变型模板，配制10 μ L突变型/野生型(M/W) =1/10的混合模板，作为检测用1/10阳性对照模板；将此模板用野生型模板作10倍稀释，分别获得突变型/野生型(Μ/W) =1/100、1/1000的混合模板，作为检测用1/100、1/1000阳性对照模板。
[0049]所述野生型目的片段的获取包括:以已知未突变基因组为模板，ΜΕΚ1-Ε2F+MEK1-E2 R为引物进行实验，获得条带单一的特异性野生型目的片段；将目的片段稀释至
I万-10万倍，终浓度约为IOng/μ L，作为检测野生型阴性对照模板用。
[0050]所述IOyL反应体系构成如下:
[0051]