专利名称：D-氨基酸氧化酶抑制剂预防和/或逆转阿片耐受的制作方法阿片受体激动剂(又称阿片激动剂、阿片、阿片类物质和阿片类药物)如吗啡等是一类麻醉性止痛剂，当使用相对高剂量时或者虽然剂量低却长期重复使用时会产生很强的药物耐受性，从而导致止痛剂的止痛效果降低。因而，麻醉性止痛剂应以增加的剂量使用，以便获得所需的止痛效果。这种麻醉性止痛剂的剂量增加，导致不同的副作用，对人具有严重的毒性，并产生严重的临床问题和吸毒等国际范围的严重社会问题，所以急需开发用于治疗、预防、干预和阻断阿片耐受的药剂。疼痛是临床上最常见的症状之一，很多疾病或病症都会出现疼痛症状，并严重影响患者的生活质量，治疗疼痛已经成为健康护理和疾病治疗中最多考虑的因素之一。因此疼痛已获得医药界越来越多的关注，2000-2010已被称为疼痛年代。疼痛是与急性或潜在的组织破坏相关联的不愉快的感觉和情感体验，促使人们避开所述破坏情形，从而保护身体并避免破坏的进一步发生。大多数疼痛在疼痛刺激消除以后随即消失，但有时尽管刺激已经消除并且身体明显恢复但疼痛仍然持续。此外，有时尽管检测不到任何刺激、破坏或疾病，但仍出现疼痛。疼痛可分为急性疼痛和慢性疼痛。慢性疼痛是当今国际疼痛研究的热点，根据发生的原因不同，可分为免疫炎症痛、神经源性痛、肿瘤(癌症)痛、糖尿病疼痛和腰背痛等。慢性疼痛和急性疼痛的区别，在于不完全是末梢神经受刺激引起的一些非损害性刺激，如轻触、温热等刺激也可引起病变区的强烈疼痛。慢性疼痛常在损伤后一段时间发生，这种疼痛带有自发性，随机性和持久性，而且服用常用镇痛药多无效，并往往终生不愈。慢性疼痛涉及复杂的形成机理，外周的异位放电及中枢敏感化(centralsensitization)是目前广泛认可的慢性疼痛包括神经源性疼痛和肿瘤疼痛形成的主要机制(Basbaum et al. Cell139 :267-284，2009)。慢性疼痛发病率较高，约占总人群的10%，并随年龄增大和原发病程延长而增高(如55岁以上发病率可达13%，再如在糖尿病诊断初期为8%，而在诊断25年后可闻达50% )。疼痛(如各种形式的慢性疼痛包括癌症疼痛、神经源性痛等)治疗不充分在病房、重症监护室(ICU)、急诊等中普遍存在。可以使用药物、精神疗法、物理疗法以及传统医学疗法等来治疗疼痛。目前临床上治疗慢性疼痛主要包括三环抗抑郁药如阿米替林(amitriptyline),抗癫痫药如加巴喷丁和普瑞巴林,局部麻醉药如利多卡因(Lidocaine),阿片类药(如吗啡、二氢吗啡酮、芬太尼和丁丙诺啡)，肾上腺素受体拮抗剂如可乐定，以及5-HT再摄取抑制剂如度洛西汀和齐考诺肽等。但是由于对慢性疼痛较低的认知度，市场上现有的多数产品并不专门针对慢性疼痛，对大部分患者无效或只能适度缓解疼痛，或会引起许多不良反应，或给药不方便。例如，目前对癌痛等疼痛的临床治疗采用三级止痛阶梯疗法，即轻度癌性疼痛采用以阿斯匹林和消炎痛等为代表的非留体类抗炎镇痛药，中度癌性疼痛采用曲马多、可待因、羟考酮等弱阿片类中度镇痛剂，而剧烈癌性疼痛则须采用吗啡、度冷丁等强阿片受体激动剂的麻醉药品，这类强阿片受体激动剂在对剧烈疼痛有效控制的同时，带来药物耐受性的严重临床问题和吸毒等国际范围的严重社会问题。另外，原治疗剧痛的高剂量麻醉药物，具有抑制呼吸、导致呕吐、导致内脏平滑肌痉挛等显著的副作用，而其导致内脏平滑肌痉挛的副作用须联用阿托品等药物方可获得改善，否则将成为加重胆绞痛、肾绞痛等常见内脏剧痛的病因，这也是其镇痛效果时间持续短的原因之一。 止痛剂是抑制或缓解急性疼痛常用的医疗性药物。止痛剂通常分为麻醉性和非麻醉性两类。临床上使用麻醉性止痛剂治疗晚期癌症患者的急性疼痛，因为它们对内脏疼痛具有优异的止痛效果。然而，当麻醉性止痛剂以相对高剂量给药或者虽然剂量低却长期重复给药时，会导致止痛剂的习惯性用药以及发生对止痛剂的渴望。此外，当使用者反复地使用规定量的麻醉性止痛剂时，其对止痛剂的耐受性迅速发展，导致止痛剂的止痛效果降低。因而，麻醉性止痛剂应以增加的剂量使用，以便获得所需的止痛效果。这种麻醉性止痛剂的剂量的增加，导致不同的副作用，因而对人具有严重的毒性。作为代表性实例，已知阿片激动剂是最常用的一类麻醉性止痛剂，其中吗啡、芬太尼类等是目前临床上常用的阿片激动剂类止痛剂，例如吗啡约占市场80 %份额。然而，反复给予阿片激动剂如吗啡等会导致其止痛效果逐步降低，并最终导致发生阿片止痛作用的耐受性。由于这些原因，尽管其具有优异的功效，吗啡等阿片激动剂在临床领域的应用受到限制。因此，为了利用阿片激动剂如吗啡等作为止痛剂，保持阿片激动剂最初的止痛效果又不在重复使用时降低其止痛效果是非常重要的。该目的可以通过抑制对阿片激动剂的耐受性的发生来实现。阿片耐受(opioid tolerance)是指长时间使用阿片类药物(阿片激动剂)后，药物镇痛作用逐渐减退甚至消失，或者若要得到相同程度的镇痛效应必须逐渐增加阿片类药物的剂量，除表现出药物镇痛效应减弱、药物需要剂量增加之外，还会导致更严重的痛觉过敏(hyperalgesia)。阿片类药物耐受(阿片耐受)的产生是一个复杂的生化过程，大量实验研究结果证实，阿片受体脱敏与内吞(Gainetdinov et al. , Ann Rev Neurosci27 :107-144，2004)、受体后信号转导(Raval et al. ,J Neurosci 27 :107-144，2004)及引起神经兀可塑性变化的转录因子(Miyabe and Miletic, NeurosciLett 38 :80-85, 2005)均参与了阿片类药物耐受的形成。因此，迫切需要一种预防和/或逆转阿片耐受的方法，以及能够预防和/或逆转阿片耐受的药物。此外，还希望获得代替阿片激动剂的用于预防和/或治疗疼痛的其他类药物。


[10]发明人意外地发现，D-氨基酸氧化酶抑制剂包括CBI0，AS057278和苯甲酸钠等能够预防和/或逆转阿片激动剂治疗时所产生的耐受性。[11]发明人还意外地发现，与根据现有技术的预测相反，D-氨基酸氧化酶抑制剂本身即能够显著地预防和/或疼痛。[12]基于以上意外发现，发明人完成了本发明，并得到了以下一系列技术方案。[13]在一个方面中，本公开内容提供了一种预防和/或逆转阿片耐受的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制剂。[14]在一个实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗因阿片耐爱使得其治疗功效降低的病症，这些病症能够通过抑制D-氨基酸氧化酶达到预防和/或阿片耐受从而得到预防和/或治疗。具体来说，所述病症可以是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌症疼痛。[15]在一个具体实施方案中，所述因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症选自慢性疼痛，癌症性疼痛，神经性疼痛，慢性腰背痛，头痛，偏头痛，三叉神经痛，丛集性头痛，纤维肌痛综合征，关节痛，炎性疼痛，关节炎疼痛，骨关节炎疼痛，类风湿性关节炎疼痛，肿瘤 疼痛，癌症疼痛，内脏痛，躯体痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，颈痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓损伤引起的疼痛，手术疼痛，术后疼痛，急性疼痛，或与感染、镰状细胞贫血、自身免疫病、多发性硬化或炎症相关的疼痛，由损伤或手术造成的疼痛，或它们的组合。[16]在另一个具体实施方案中，所述因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症选自与以下有关的疼痛糖尿病性神经痛，外周神经痛，疱疹后神经痛，腰或颈的神经根痛，纤维肌痛，舌咽神经痛，反射交感性营养不良，灼痛，丘脑综合征，神经根撕脱，幻肢痛，开胸术后的疼痛，癌症，化学损伤，毒素，营养缺乏，病毒或细菌感染，颞下颌关节紊乱综合征，纤维肌痛综合征，骨质疏松，骨转移或其他未知原因引起的骨痛，痛风，纤维组织炎，肌筋膜痛，胸廓出口综合征，背痛或腰痛，骨盆痛，心脏性胸痛，非心脏性胸痛，脊髓损伤相关性疼痛，中枢性中风后疼痛，癌症痛，AIDS痛，抗肿瘤药物致神经疼痛，镰状细胞痛，老年痛，或它们的组合。[17]在另一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBI0(5-chlorobenzo[d]isoxazol-3-ol, Ferraris et al. , J Med Chem51 3357-3359，2008 ；Hashimoto et al.，Biol Psychiatry 65 :1103-1106，2009 ；Horioet al.，Open Clin Chem J 2 :16-21,2009 ；Gong et al.，J PharmacolExp Ther 336 282-293，2011)， AS057278(5-methylpyrazoIe-3-carboxylicacid, Adage et al. ， EurNeuropsychopharmacol 18 :200-214,2008 ；Gong etal. ， J Pharmacol Exp Ther 336 282-293,2011)，Compound 8 (4H~thieno[3,2-b]pyrrole-5-carboxylic acid，Sparey etal.，Bioorg MedChem Lett 18 :3386-3391，2008 ；Smith et al.，J Pharmacol Exp Ther328 :921-930, 2009 ；Gong et al.，J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293, 2011), Compound2 (3-hydroxyquinolin-2-(IH) -one,Duplantier et al. ,J MedChem 52 :3576-3585,2009 ；Gong et al.，J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)和苯甲酸钠(Vanoni et al.，Biochemistry 36 :5624-5632,1997 ；Gong et al. ， J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)等及其衍生物。D-氨基酸氧化酶抑制剂可用于防止和抑制反复施用吗啡而带来的吗啡耐受性，同时又不影响单独给药时吗啡的止痛作用。[18]在另一个实施方案中，所述对象表现出对选自以下一种或多种阿片类物质的耐受阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多或其衍生物。例如，所述阿片类物质可以是吗啡或其衍生物。[19]在再一个实施方案中，当所述方法用于预防和/或治疗因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症时，所述方法还包括向所述对象施用另外的治疗剂。例如，当用于预防和/或治疗疼痛时，还可以向所述对象施用疼痛治疗剂，包括但不限于镇痛剂如阿片类镇痛齐U，或它们的组合。
[20]在一个具体实施方案中，所述另外的治疗剂选自阿片类物质，例如选自以下一种或多种阿片类物质阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone>二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、轻苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多或其衍生物。例如，所述阿片类物质可以是吗啡或其衍生物。在一个具体实施方案中，所述阿片激动剂可以是吗啡类药物，如吗啡、二氢吗啡酮、芬太尼、丁丙诺啡和叔丁啡等。[21]在本发明方法的另一个实施方案中，在施用阿片类物质之前、同时或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。[22]在另一个实施方案中，通过口服或胃肠外途径施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂，例如包括皮下注射，脊髓施用，脑内施用、肌肉注射，经鼻腔施用，静脉内施用和/或腹腔内施用。[23]在第二方面，本公开内容提供一种预防和/或治疗疼痛的方法，其包括向有此需要的对象阿片类物质和D-氨基酸氧化酶抑制剂。[24]具体来说，可以分开和/或一起施用阿片类物质和D-氨基酸氧化酶抑制剂。此外，可以在施用阿片类物质之前、同时和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。[25]在一个实施方案中，所述阿片类物质选自以下一种或多种阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多、其衍生物以及它们的任意混合物。[26]在另一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8、Compoun d 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。[27]在另一个实施方案中，所述疼痛是急性疼痛和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌症疼痛。具体来说，例如所述疼痛可以选自以下一种或多种慢性疼痛，神经性疼痛，慢性腰背痛，头痛，偏头痛，三叉神经痛，丛集性头痛，纤维肌痛综合征，关节痛，炎性疼痛，关节炎疼痛，骨关节炎疼痛，类风湿性关节炎疼痛，肿瘤疼痛，癌症疼痛，内脏痛，躯体痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，颈痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓损伤引起的疼痛，手术疼痛，术后疼痛，急性疼痛，或与感染、镰状细胞贫血、自身免疫病、多发性硬化或炎症相关的疼痛，由损伤或手术造成的疼痛，糖尿病性神经痛，外周神经痛，疱疹后神经痛，腰或颈的神经根痛，纤维肌痛，舌咽神经痛，反射交感性营养不良，灼痛，丘脑综合征，神经根撕脱，幻肢痛，开胸术后的疼痛，癌症，化学损伤，毒素，营养缺乏，病毒或细菌感染，颞下颌关节紊乱综合征，纤维肌痛综合征，骨质疏松，骨转移或其他未知原因引起的骨痛，痛风，纤维组织炎，肌筋膜痛，胸廓出口综合征，上背部痛，下腰痛，骨盆痛，心脏性胸痛，非心脏性胸痛，脊髓损伤相关性疼痛，中枢性中风后疼痛，癌症痛，AIDS痛，抗肿瘤药物致神经疼痛，镰状细胞痛，老年痛，或它们的组合。[28]在第三方面，本公开内容提供一种治疗慢性疼痛尤其是癌症疼痛的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制剂。[29]在一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。[30]基于本公开内容的上述发现，还提供一种鉴定能够预防和/或逆转阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步骤提供测试化合物，使所述测试化合物与D-氨基酸氧化酶相接触，和测定所述D-氨基酸氧化酶的活性；如果所述测试化合物能够抑制D-氨基酸氧化酶的活性，那么所述测试化合物可用作预防和/或逆转阿片耐受的化合物。例如，根据上述方法鉴定的化合物可用于预防和/或治疗因阿片耐受而使得其治疗功效降低的病症。在一个具体实施方案中，所述病症是疼痛，尤其是慢性疼痛。[31]另一方面，本公开内容还提供另一种鉴定能够预防和/或逆转阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步骤提供测试化合物和阿片类物质，在施用阿片类物质之前、同时和/或之后向测试对象施用所述测试化合物，和测定施用所述测试化合物之后所述阿片类物质在测试对象中的活性；与未施用所述测试化合物和/或施用所述测试化合物之前的阿片类物质活性相比较，如果在施用所述测试化合物之后所述阿片类物质活性水平增强，则所述测试化合物可用作预防和/或逆转阿片耐受的化合物。例如，根据上述方法鉴定的化合物可用于预防和/或治疗因阿片耐受而使得其治疗功效降低的病症。在一个具体实施方案中，所述病症是疼痛，尤其是慢性疼痛。[32]在第六方面，本公开内容还提供D-氨基酸氧化酶抑制剂在制备用于预防和/或逆转阿片耐受的药物中的用途。在所述用途的各种实施方案中，尤其包括与上述第一方面所述方法所涉及各实施方案相对应的技术方案。[33]在第七方面，本公开内容还提供D-氨基酸氧化酶抑制剂与阿片类物质联合在制备用于预防和/或治疗疼痛的药物中的用途。在所述用途的各种实施方案中，尤其包括与上述第二方面所述方法所涉及各实施方案相对应的技术方案。[34]在第八方面，本公开内容还提供D-氨基酸氧化酶抑制剂，其用于预防和/或逆转阿片耐受，或者与阿片类物质联合用于预防和/或治疗疼痛。在所述D-氨基酸氧化酶抑制剂的各种实施方案中，尤其包括与上述第一和第二方面所述方法所涉及各实施方案相对应的技术方案。[35]在第九方面，本公开内容还提供用于制备药物的D-氨基酸氧化酶抑制剂，所述药物用于预防和/或逆转阿片耐受，或者与阿片类物质联合用于制备预防和/或治疗疼痛的药物。在所述D-氨基酸氧化酶抑制剂的各种实施方案中，尤其包括与上述第一和第二方面所述方法所涉及各实施方案相对应的技术方案。
[36]本公开内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本公开内容中具体记载一样。[37]将结合附图以及以下进一步的详细说明来举例说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。


[38]图I示出，单次或连续皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO对吗啡耐受的预防和逆转作用。A为小鼠福尔马林I相急性疼痛反应，B为II相慢性疼痛反应。与相应的生理盐水组比较，a代表P < 0. 05 ;与相应的吗啡镇痛组比较，b代表P < 0. 05。[39]图2示出，连续7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂AS057278 (40mg/kg)和苯甲酸钠(400mg/kg)对吗啡耐受的预防作用。A为小鼠福尔马林I相急性疼痛反应，B为II相慢性疼痛反应。与相应的生理盐水组比较，a代表P < 0. 05 ;与相应的吗啡镇痛组比较，b代表P < 0. 05。[40]图3示出，脊髓鞘内单次注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBI0(30iig)、AS057278 (100 U g)和苯甲酸钠(300 U g)及活性氧(Reactive oxygenspecies, R0S)清除齐[JPBN(Img)对吗啡在大鼠福尔马林疼痛模型耐受的逆转作用。a表示与吗啡耐受组比较P< 0. 05。[41]图4示出，单剂量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO，AS057278和苯甲酸钠在小鼠热板甩尾(A、B、C)和热板(D、E、F)疼痛模型中立即逆转吗啡耐受的量效关系。[42]图5示出，单剂量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO，AS057278和苯甲酸钠在小鼠甩尾(A)和热板(B)疼痛模型中逆转吗啡耐受的量效关系以及与抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性的相关性的分析(C和D)。[43]图6不出，胚骨接种Walker 256细胞对Sprague Dawley大鼠机械性痛阈(A)和热辐射痛阈的影响(B) (n = 6)。
[44]图7示出，连续7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO (10mg/kg)对吗啡耐受的预防作用(A)。B为第8日给予吗啡(5mg/kg)刺激后骨癌痛大鼠痛阈值的变化。[45]图8示出，D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO对神经源疼痛大鼠的镇痛作用。[46]图9示出，骨癌痛大鼠脊髓胶质细胞GFAP表达的变化。[47]图10示出，骨癌痛大鼠脊髓D-型氨基酸氧化酶mRNA表达和蛋白表达的变化。[48]图11示出，皮下注射CBIO对大鼠骨癌痛痛觉过敏抑制作用。[49]图12示出，鞘内给CBIO对骨癌痛镇痛作用的量效曲线和时效曲线。

[60]发明人意外地发现，D-氨基酸氧化酶抑制剂包括CBI0，AS057278和苯甲酸钠等能完全预防或立即完全阻断吗啡等阿片受体激动剂在治疗疼痛过程中产生的耐受，其作用部位在脊髓，与脊髓D-氨基酸氧化酶活性抑制呈正性相关。D-氨基酸氧化酶抑制剂预防或阻断阿片耐受。[61]在一个方面中，本公开内容提供了一种预防和/或逆转阿片耐受的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制剂。[62]在一个实施方案中，所述方法用于预防和/或治疗因阿片耐爱使得其治疗功效降低的病症，这些病症能够通过抑制D-氨基酸氧化酶达到预防和/或阿片耐受从而得到预防和/或治疗。具体来说，所述病症可以是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌症疼痛。[63]在一个具体实施方案中，所述因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症选自慢性疼痛，癌症性疼痛，神经性疼痛，慢性腰背痛，头痛，偏头痛，三叉神经痛，丛集性头痛，纤维肌痛综合征，关节痛，炎性疼痛，关节炎疼痛，骨关节炎疼痛，类风湿性关节炎疼痛，肿瘤疼痛，癌症疼痛，内脏痛，躯体痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，颈痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓损伤引起的疼痛，手术疼痛，术后疼痛，急性疼痛，或与感染、镰状细胞贫血、自身免疫病、多发性硬化或炎症相关的疼痛，由损伤或手术造成的疼痛，或它们的组合。[64]在另一个具体实施方案中，所述因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症选自与以下有关的疼痛糖尿病性神经痛，外周神经痛，疱疹后神经痛，腰或颈的神经根痛，纤维肌痛，舌咽神经痛，反射交感性营养不良，灼痛，丘脑综合征，神经根撕脱，幻肢痛，开胸术后的疼痛，癌症，化学损伤，毒素，营养缺乏，病毒或细菌感染，颞下颌关节紊乱综合征，纤维肌痛综合征，骨质疏松，骨转移或其他未知原因引起的骨痛，痛风，纤维组织炎，肌筋膜痛，胸廓出口综合征，背痛或腰痛，骨盆痛，心脏性胸痛，非心脏性胸痛，脊髓损伤相关性疼痛，中枢性中风后疼痛，癌症痛，AIDS痛，抗肿瘤药物致神经疼痛，镰状细胞痛，老年痛，或它们的组合。[65]在另一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO(5-chloroben zo[d]isoxazol-3-ol, Ferraris et al. , J Med Chem51 3357-3359, 2008 ;Hashimoto et al. , Biol Psychiatry 65 :1103-1106,2009 ;Horioet al. , Open Clin Chem J 2 :16-21,2009 ；Gong et al. , J PharmacolExp Ther 336 282-293,2011), AS057278(5-methylpyrazoIe-3-carboxylicacid, Adage et al. , EurNeuropsychopharmacol 18 :200-214,2008 ;Gong etal. , J Pharmacol Exp Ther 336 282-293,2011), Compound 8(4H-thieno[3,2-b]pyrrole-5-carboxylic acid, Sparey etal. , Bioorg MedChem Lett 18 :3386-3391,2008 ；Smith et al. , J Pharmacol Exp Ther328 :921-930,2009 ；Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011), Compound2 (3-hydroxyquinolin-2-(IH)-one, Duplantier et al. , J MedChem 52:3576-3585,2009;Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)和苯甲酸钠(Vanoni et al.，Biochemistry 36 :5624-5632,1997 ；Gong et al. , J Pharmacol Exp Ther 336 :282-293,2011)等及其衍生物。D-氨基酸氧化酶抑制剂可用于防止和抑制反复施用吗啡而带来的吗啡耐受性，同时又不影响单独给药时吗啡的止痛作用。[66]在另一个实施方案中，所述对象表现出对选自以下一种或多种阿片类物质的耐受阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多或其衍生物。例如，所述阿片类物质可以是吗啡或其衍生物。[67]在再一个实施方案中，当所述方法用于预防和/或治疗因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症时，所述方法还包括向所述对象施用另外的治疗剂。例如，当用于预防和/或治疗疼痛时，还可以向所述对象施用疼痛治疗剂，包括但不限于镇痛剂如阿片类镇痛齐U，或它们的组合。[68]在一个具体实施方案中，所述另外的治疗剂选自阿片类物质，例如选自以下一种或多种阿片类物质阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone>二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、轻苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多或其衍生物。例如，所述阿片类物质可以是吗啡或其衍生物。在一个具体实施方案中，所述阿片激动剂可以是吗啡类药物，如吗啡、二氢吗啡酮、芬太尼、丁丙诺啡和叔丁啡等。[69]在本发明方法的另一个实施方案中，在施用阿片类物质之前、同时或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。[70]在另一个实施方案中，通过口服或胃肠外途径施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂，例如包括皮下注射，脊髓施用，脑内施用、肌肉注射，经鼻腔施用，静脉内施用和/或 腹腔内施用。[71]在第二方面，本公开内容提供一种预防和/或治疗疼痛的方法，其包括向有此需要的对象阿片类物质和D-氨基酸氧化酶抑制剂。[72]具体来说，可以分开和/或一起施用阿片类物质和D-氨基酸氧化酶抑制剂。此外，可以在施用阿片类物质之前、同时和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。[73]在一个实施方案中，所述阿片类物质选自以下一种或多种阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替啶、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多、其衍生物以及它们的任意混合物。[74]在另一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。[75]在另一个实施方案中，所述疼痛是急性疼痛和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌症疼痛。具体来说，例如所述疼痛可以选自以下一种或多种慢性疼痛，神经性疼痛，慢性腰背痛，头痛，偏头痛，三叉神经痛，丛集性头痛，纤维肌痛综合征，关节痛，炎性疼痛，关节炎疼痛，骨关节炎疼痛，类风湿性关节炎疼痛，肿瘤疼痛，癌症疼痛，内脏痛，躯体痛，肌肉骨骼痛，骨痛，腰骶痛，颈痛或上背痛，糖尿病性疼痛，脊髓损伤引起的疼痛，手术疼痛，术后疼痛，急性疼痛，或与感染、镰状细胞贫血、自身免疫病、多发性硬化或炎症相关的疼痛，由损伤或手术造成的疼痛，糖尿病性神经痛，外周神经痛，疱疹后神经痛，腰或颈的神经根痛，纤维肌痛，舌咽神经痛，反射交感性营养不良，灼痛，丘脑综合征，神经根撕脱，幻肢痛，开胸术后的疼痛，癌症，化学损伤，毒素，营养缺乏，病毒或细菌感染，颞下颌关节紊乱综合征，纤维肌痛综合征，骨质疏松，骨转移或其他未知原因引起的骨痛，痛风，纤维组织炎，肌筋膜痛，胸廓出口综合征，上背部痛，下腰痛，骨盆痛，心脏性胸痛，非心脏性胸痛，脊髓损伤相关性疼痛，中枢性中风后疼痛，癌症痛，AIDS痛，抗肿瘤药物致神经疼痛，镰状细胞痛，老年痛，或它们的组合。[76]在第三方面，本公开内容提供一种治疗慢性疼痛尤其是癌症疼痛的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制剂。[77]在一个实施方案中，所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8、Compound 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。[78]基于本公开内容的上述发现，还提供一种鉴定能够预防和/或逆转阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步骤提供测试化合物，使所述测试化合物与D-氨基酸氧化酶相接触，和测定所述D-氨基酸氧化酶的活性；如果所述测试化合物能够抑制D-氨基酸氧化酶的活性，那么所述测试化合物可用作预防和/或逆转阿片耐受的化合物。例如，根据上述方法鉴定的化合物可用于预防和/或治疗因阿片耐受而使得其治疗功效降低的病症。在一个具体实施方案中，所述病症是疼痛，尤其是慢性疼痛。 [79]另一方面，本公开内容还提供另一种鉴定能够预防和/或逆转阿片耐受的化合物的方法，其包括以下步骤提供测试化合物和阿片类物质，在施用阿片类物质之前、同时和/或之后向测试对象施用所述测试化合物，和测定施用所述测试化合物之后所述阿片类物质在测试对象中的活性；与未施用所述测试化合物和/或施用所述测试化合物之前的阿片类物质活性相比较，如果在施用所述测试化合物之后所述阿片类物质活性水平增强，则所述测试化合物可用作预防和/或逆转阿片耐受的化合物。例如，根据上述方法鉴定的化合物可用于预防和/或治疗因阿片耐受而使得其治疗功效降低的病症。在一个具体实施方案中，所述病症是疼痛，尤其是慢性疼痛。[80]我们对这些D-氨基酸氧化酶抑制剂进行体内抑制活性研究，发现脊髓和皮下给予D-氨基酸氧化酶抑制剂包括CBIO，AS057278和苯甲酸钠能够几乎完全预防或逆转吗啡耐受。[81]本发明将通过以下实施例进行进一步说明，其不应以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。本申请中所有引用的参考文献的全部内容(包含文章参考、授权的专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)均明确地通过引用并入本文。以下实施例中，若未具体指出，所用试剂和材料是能够商业获得的至少分析纯或与此相当级别的产品。实施例实施例I单次或连续7日皮下注射DAO抑制剂CBIO对吗啡耐受作用的影响[82]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯莱克实验动物责任有限公司)，自由饮水、进食，分为10组，每组4只。3组小鼠分别皮下注射生理盐水(10ml/kg)，每天两次，连续7 天,第 8 天分别给予生理盐水(10ml/kg)、CBIO (10mg/kg,来源于 Maybridge Chemicals,Cornwall, U.K.)或吗啡(5mg/kg,来源于东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；2组小鼠分别皮下注射CBI0(10mg/kg)或吗啡(10mg/kg),每天两次,连续7天,第8天分别给予CBI0(10mg/kg)或吗啡(5mg/kg) ;2组小鼠分别皮下注射CBI0(10mg/kg)或吗啡(IOmg/kg)，每天两次，连续7天,第8天分别给予吗啡(5mg/kg)或CBIO (10mg/kg) ；2组小鼠分别皮下注射CBI0(10mg/kg)或CBI0(10mg/kg)+吗啡(10mg/kg),每天两次,连续7天，第8天分别给予生理盐水(10ml/kg)或吗啡(5mg/kg) ;1组小鼠皮下注射吗啡(10mg/kg),每天两次，连续7天(共14次)，第14次给药同时给予CBI0(10mg/kg),第8天给予吗啡(5mg/kg)。第8天给药20分钟后，小鼠右后足背注射IOiU 5%福尔马林致痛，观察福尔马林注射后0-5分钟(I相急性反应)和20-40分钟(II相慢性反应)小鼠持续舔足时间作为疼痛指标。实验结果如图IA和IB所示，表明在7日连续皮下注射生理盐水的对照小鼠中，单剂量注射吗啡(5mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛均有抑制作用，抑制率分别为92. 7%和100%;单剂量注射CBI0(10mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛不影响，但能有效抑制小鼠福尔马林II相慢性疼痛，抑制率为 64. 3% ;连续7日皮下注射CBI0(10mg/kg)不产生明显耐受性，即连续7日给药后单剂量注射CBI0(10mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛不影响，但仍能有效抑制福尔马林II相慢性疼痛，抑制率为62. 8% ;连续7日皮下注射吗啡产生明显耐受性，即连续7日给药后单剂量注射吗啡(5mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为0%和20. 7% ;连续7日皮下注射CBI0(10mg/kg)，单剂量注射吗啡(5mg/kg)能有效抑制福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛，抑制率分别为88. 4%和100%，说明CBIO对吗啡不产生交叉耐受；连续7日皮下注射吗啡(5mg/kg)，单剂量注射CBI0(10mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛不影响，能有效抑制福尔马林II相慢性疼痛，抑制率为57. 1%，说明吗啡对CBIO不产生交叉耐受；连续7日给予CBIO(IOmg/kg)不发生药物蓄积，第8天不产生镇痛作用；CBI0和吗啡联用7日后，能完全预防吗啡产生的耐受作用，单剂量注射吗啡对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为81. 5%和100% ;连续7日皮下注射吗啡，第14次吗啡后给予单剂量CBIO后，能完全逆转吗啡已产生的耐受，单剂量注射吗啡对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为65. 7%和100%。结果表明，CBIO与吗啡联用，对吗啡镇痛作用的耐受性均有预防作用，单剂量CBIO亦能完全逆转吗啡耐受性。实施例2连续7日皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂AS057278和苯甲酸钠对吗啡耐受的预防作用[83]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯莱克实验动物责任有限公司)，自由饮水、进食，分为5组，每组4只。2组小鼠分别皮下注射生理盐水(10ml/kg)，每天两次，连续7天，第8天分别给予生理盐水(10ml/kg)或吗啡(5mg/kg) ;3组小鼠分别皮下注射吗啡(IOmg/kg)、AS057278 (40mg/kg,来源于 Sigma-Aldrich, St Louis, MO)+吗啡(10mg/kg)或苯甲酸钠(400mg/kg,来源于国药集团，上海，中国)+吗啡(10mg/kg),每天两次,连续7天,第8天分别给予吗啡(5mg/kg)。第8天给药20分钟后，小鼠右后足背注射10 u I 5%福尔马林致痛，观察福尔马林注射后0-5分钟(I相急性反应)和20-40分钟(II相慢性反应)小鼠持续舔足时间作为疼痛指标。如图2A和2B所示，实验结果表明在连续7日皮下注射生理盐水的对照小鼠中，单剂量注射吗啡(5mg/kg)对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛均有抑制作用，抑制率分别为84. 8%和100% ;连续7日皮下注射吗啡产生明显耐受性，单剂量注射吗啡对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为12. 2%和12. 4% ；AS057278和吗啡联用7日后，能预防吗啡耐受作用，单剂量注射吗啡对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为76. 1%和100% ;同样苯甲酸钠和吗啡联用7日后，亦能预防吗啡产生的耐受作用，单剂量注射吗啡对福尔马林I相急性疼痛和II相慢性疼痛的抑制率分别为69. 8%和89. 1%。结果表明，AS057278和苯甲酸钠与吗啡联用，均能有效预防吗啡镇痛作用的耐受性。实施例3脊髓鞘内单次注射0-氨基酸氧化酶抑制剂0810(301^)43057278(1001^)和苯甲酸钠(300 iig)及活性氧(Reactive oxygen species, R0S)清除剂PBN(Img)对吗啡耐受作用的影响[84]雄性Wistar大鼠(体重150_170g，上海斯莱克实验动物责任有限公司)，分为5组，每组4只。鞘内注射吗啡(50 u g/10 Ul/大鼠)，每天一次，连续5天，第5次注射同时分别给予生理盐水(IOiil/大鼠)、CBI0(30ii g)、AS057278(100ii g)、苯甲酸钠(300 u g)和活性氧(Reactiveoxygen species, R0S)清除剂PBN(Img),第6天分别给予吗啡(5 ii g/10U I/大鼠)，30分钟后大鼠右后足背注射50 ill 5%福尔马林致痛，在福尔马林注射后0-90分钟间，每隔十分钟观察I分钟内大鼠抬脚或抖脚次数作为疼痛指标。实验结果如图3所示，大鼠鞘内连续给予吗啡(50 y g/10 Ul/大鼠)5天后产生明显耐受性。脊髓鞘内单剂量 给予 CBIO (30 u g)、AS057278 (100 y g)、苯甲酸钠(300 u g)和 PBN(Img)，均能几乎完全逆转吗啡已产生的耐受，即单剂量注射吗啡对这些大鼠福尔马林I相急性疼痛抑制率分别为70. 8%,69. 3%,79. 5%和 54. 3% ；11 相慢性疼痛的抑制率分别为 92. 6%,95. 6%,94. 9%和92. 3%。结果表明，单次脊髓鞘内给予CBI0、AS057278、苯甲酸钠和PBN能完全逆转吗啡耐受性，说明D-氨基酸氧化酶抑制剂阻断吗啡耐受作用部位在脊髓。实施例4单剂量皮下注射D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO，AS057278和苯甲酸钠立即逆转吗啡耐受的量效关系，以及与抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性的相关性[85]根据D’ Aniello检测D-氨基酸氧化酶纯酶活性方法检测不同浓度CBIO(0，
0.003,0. 01,0. 03,0. 1,0. 3,l,3uM)，AS057278 (0，0. 1,0. 3,1,3,10，100, 300 u M)和苯甲酸钠(0，3，10，30，100，300，1000，3000，10000 u M)抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性作用，进行量效关系研究，计算半数抑制量(IC50)和最大抑制率(Emax)。实验结果表明，D-氨基酸氧化酶抑制剂CBIO，AS057278和苯甲酸钠均能100%抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性，IC50 分别为 I. 3，83. 5 和 290. 2 ii M(Gonget al.，JPET 336 :282-293, 2011)。[86]雄性Swiss小鼠(20 25g，上海斯莱克实验动物责任有限公司)，自由饮水、进食，分为15组，每组4只。2组小鼠皮下注射生理盐水(10ml/kg)，每天两次，连续7天，第8天给药前检测小鼠甩尾和热板疼痛阈值，然后给予生理盐水(10ml/kg) ; 13组小鼠皮下注射吗啡(10mg/kg),每天两次,连续7天,第8天给药前检测小鼠甩尾和热板疼痛阈值,然后分别给予 1、3 和 10mg/kg CBIO, 3,10 和 100mg/kg AS057278 以及 10、30、100 和 300mg/kg苯甲酸钠。在给予生理盐水或D-氨基酸氧化酶抑制剂15分钟后，检测所有小鼠甩尾和热板疼痛阈值，再给予吗啡(5mg/kg),分别于0. 5,1和2小时检测小鼠甩尾和热板疼痛阈值。比较各药物不同剂量对小鼠甩尾和热板疼痛的影响，并计算阈值净值和2小时内曲线下面积(AUC)。实验结果如图4所示，连续7日皮下注射吗啡产生明显耐受性，单剂量注射吗啡对小鼠甩尾和热板疼痛均不产生镇痛作用；单剂量皮下注射CBI0，AS057278和苯甲酸钠能剂量依赖式地逆转吗啡耐受。量效关系分析表明CBI0，AS057278和苯甲酸钠阻断吗啡耐受作用的最大阻断率均可达100%，其ED50在小鼠甩尾疼痛模型中分别为I. 0,2. 5和40. 5mg/kg，在小鼠热板疼痛模型中分别为I. 1,7. 4和50. 4mg/kg(图5A和图5B)。进一步分析表明，CBIO，AS057278和苯甲酸钠在小鼠甩尾和热板疼痛模型中抑制吗啡产生耐受性的作用与其抑制大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶活性呈正性相关(图5C和图5D)。结果表明，单剂量给予D-氨基酸氧化酶抑制剂(CBI0，AS057278和苯甲酸钠)均能立即有效逆转吗啡镇痛耐受性，并与D-氨基酸氧化酶活性抑制作用呈正性相关。实施例5骨癌痛模型的建立[87]复苏Sprague Dawley大鼠乳腺癌Walker 256细胞(上海医药工业研究院)，使用RPMI 1640培养液(含有10%胎牛血清)，在5% C02、37°C条件下培养。待其生长至对数生长期时收集，用无菌磷酸缓冲液洗涤2次、计数，调整密度在I X 107个/ml。以Walker256细胞腹腔接种幼年^0_80g)雌性Sprague Dawley大鼠制备腹水瘤细胞，以0. 5ml/只的剂量接种。6-7天后接种的Sprague Dawley大鼠出现明显的腹水症状,抽取含有Walker256细胞的腹水并提取肿瘤细胞。用无菌磷酸缓冲液调整细胞密度在8X 107个/ml，冰上放置备用。 [88] Sprague Dawley雌性大鼠(150_180g,上海斯菜克实验动物责任有限公司)用戍巴比妥钠(50mg/kg, i. p.)麻醉,在距胚骨头下0. 5cm处沿胚骨方向上下暴漏胚骨并钻孔。钻孔时不损坏对侧胫骨骨髓腔面。然后换用灭菌的25 u I微量注射器将5 u I准备好的上述Walker 256细胞悬液注射到骨髓腔内，用无菌骨腊封孔，以免细胞外漏。右侧胫骨注射磷酸缓冲液作对照，其它操作痛左侧。术后将动物放置37°C恒温垫上复温，待其苏醒后，放回动物房饲养。于术前及术后第5，10，15，20，25，32天检测机械性痛觉阈值和热辐射痛觉阈值。[89]实验结果如图6所示，手术后第10天大鼠骨癌侧机械性痛觉阈值开始降低，15天时，痛阈降低至Sg左右m ;而热辐射痛觉阈值在整个检测过程中没有显著的变化(6B)。本研究随后采用机械性痛觉阈值作为大鼠骨癌痛模型指标。实施例6单次或连续I日皮下注射DAO抑制剂CBIO对骨癌痛大鼠吗啡耐受作用的影响[90]选取造模成功的骨癌痛大鼠(200_220g，上海斯莱克实验动物责任有限公司)，自由饮水、进食，分为4组，每组6只。大鼠分别皮下注射生理盐水(lml/kg)、CBIO(10mg/kg,来源于 Maybridge Chemicals, Cornwall, U. K.)、吗啡(5mg/kg,来源于东北制药集团沈阳第一制药有限公司)或CBI0(10mg/kg) +吗啡(5mg/kg),每天两次,连续7天，于第一天给药前以及每天给药后I小时检测大鼠患侧足机械性痛阈的变化。第8天分别皮下给予各组大鼠吗啡(5mg/kg)，于给药前及给药后I小时检测大鼠患侧足机械性痛阈的变化。[91]实验结果如图7A和7B所示，表明在7日连续皮下注射生理盐水的对照大鼠中，连续7日皮下注射CBI0(10mg/kg)不产生明显耐受性，连续7日给药后单剂量注射吗啡(5mg/kg)产生较强镇痛作用，即CBIO对吗啡在骨癌痛大鼠不产生交叉耐受；连续7日皮下注射吗啡产生明显耐受性，即连续7日给药后单剂量注射吗啡(5mg/kg)对骨癌痛大鼠不产生镇痛作用；CBI0和吗啡联用7日后，能完全预防吗啡产生的耐受作用，第8天单剂量注射吗啡对骨癌痛大鼠产生较强镇痛作用。结果表明，CBIO与吗啡联用，对吗啡镇痛作用的耐受性有预防作用。
实施例7 CBIO对大鼠神经源性疼痛的影响
雄性Wistar大鼠(体重150_170g)，动物适应环境3天。用戊巴比妥(i. p.，50mg/kg)麻醉大鼠。在髂骨位置脊髓插入PE-10导管到要脊髓膨大处，并对大鼠左侧进行L5/6脊神经结扎。[92]待大鼠恢复3-7天后，使用IITC CE220检测大鼠左侧脚掌机械性痛觉阈值；挑选左侧机械性痛觉阈值< Sg的大鼠，为造模成功的大鼠。并对大鼠进行随机分组，分为Vehicle组(50% DMSO生理盐水，10 yl/大鼠)和CBIO (60 y g/大鼠)组，每组4只。此外两组大鼠Vehicle组(70% DMSO生理盐水，10 iil/ 大鼠)和CBIO (100 y g/大鼠)组，每组4只。给药后，分别在0. 5、1、2和4小时检测大鼠左侧机械性痛觉阈值。[93]实验结果如图8所示，与对照组相比，CBIO无论60 ii g(图8A)或IOOyg(图8B)对大鼠神经源性疼痛均无明显镇痛作用。专利申请公开(WO 2005/089753A2 ；US2005/0143434A1)描述了 CBIO的化学结构，专利申请公开US 2005/0143434A1同时披露了D-型氨基酸氧化酶抑制剂治疗神经源性疼痛，但未提供具体实施例。出乎意料之外，我们证明给予CBIO对神经源性疼痛治疗无效。[94]在上述意外发现的基础上，发明人进一步研究了 CBIO对疼痛的作用。[95]通过皮下注射研究了 CBIO对大鼠蜜蜂毒疼痛模型中引起的自发痛和机械痛的影响。结果发现，皮下注射CBI0(10mg/kg)后,大鼠蜜蜂毒诱导的疼痛反应与生理盐水基本保持一致，4小时时机械疼痛达到峰值，而后逐渐恢复。实验结果表明，CBIO对蜜蜂毒诱发的机械痛敏没有抑制作用。[96]在另一项研究中发现，与生理盐水组相比，角叉菜胶模型大鼠给予吗啡后
0.5小时镇痛作用较明显，且致痛足与对照足痛阈值均显著升高，说明吗啡有镇痛作用，随着时间的延长，其镇痛作用减弱，两小时后镇痛作用消失。而CBIO组大鼠痛阈值随着时间的延长与生理盐水组大鼠基本保持一致，说明CBIO对角叉菜胶引起Wistar大鼠痛觉超敏反应没有影响。[97]此外，在皮下注射CBIO对小鼠醋酸扭体疼痛模型中发现，吗啡能有效降低小鼠腹腔注射醋酸所致的内脏疼痛，而CBIO (皮下或尾静脉注射)对小鼠腹腔注射醋酸所致的内脏疼痛亦无明显的镇痛作用。[98]在另外的研究中还发现，CBIO对小鼠腹腔注射醋酸所致的内脏疼痛亦无明显的镇痛作用，CBIO对小鼠热水甩尾实验和热板实验的痛阈值无明显影响，CBIO对急性疼痛也没有显著影响。[99]根据以上结果分析，DAO氧化酶抑制剂对疼痛(如慢性疼痛和急性疼痛)并不具有一致的作用。实施例8骨癌痛大鼠脊髓性状胶质细胞标记蛋白GFAP mRNA表达的变化
将Sprague Dawley大鼠分为两组(n = 5-6)进行手术，一组在左侧胫骨注射磷酸缓冲液作为对照组，另一组给左侧胫骨注射Walker256细胞。手术后第18天选取造模成功的骨癌痛大鼠，检测PWT值。大鼠断头处死后，取出脊髓腰膨大部位，放入准备好的
1.5ml离心管中，并标记。按照IOOmg组织加入Iml Trizol试剂,加入相应体积的Trizol试剂。检测0D260/0D280和核酸电泳检测提取的RNA质量。使用逆转录酶，在相应的逆转录条件下，将IygS RNA逆转录成cDNA。逆转录产生的CDNA为模板，以GAPDH为内参。用荧光定量PCR检测对照组与骨癌痛大鼠脊髓性状胶质细胞标记蛋白GFAP mRNA表达的变化。
结果(图9)表明GFAP (星状胶质细胞标记蛋白)基因mRNA表达量显著升高(70% ) (P < 0. 05)，提示胶质细胞肿瘤自发痛中被激活。实施例9骨癌痛大鼠脊髓D-氨基酸氧化酶mRNA和蛋白表达的变化
将Sprague Dawley大鼠分为两组(n = 5-6)进行手术，一组在左侧胫骨注射磷酸缓冲液作为对照组，另一组给左侧胫骨注射Walker256细胞。手术后第18天选取造模成功的骨癌痛大鼠，检测PWT值。大鼠断头处死后，取出脊髓腰膨大部位，放入准备好的
I.5ml离心管中，并标记。按照IOOmg组织加入Iml Trizol试剂,加入相应体积的Trizol试剂。检测0D260/0D280和核酸电泳检测提取的RNA质量。使用逆转录酶，在相应的逆转 录条件下，将I U g总RNA逆转录成cDNA。逆转录产生的cDNA为模板，以GAPDH为内参。用荧光定量PCR检测对照组与骨癌痛大鼠脊髓目的基因D-氨基酸氧化酶的表达量的变化情况，用2-A ACt方法计算目的基因D-氨基酸氧化酶的表达变化。实验结果如图IOB所示，脊髓D-氨基酸氧化酶基因mRNA表达量降低(20% ) (P < 0. 05)。
将Sprague Dawley大鼠分为两组(n = 5-6)进行手术,一组在左侧胚骨注射磷酸缓冲液作为对照组，另一组给左侧胫骨注射Walker256细胞。手术后第18天选取造模 成功的骨癌痛大鼠。迅速断头处死大鼠，取脊髓腰膨大部位，按照20mg组织加入150 Ul裂解液，用匀浆器将组织匀浆，40C I, OOOrpm离心，取上清，加入等体积的上样buffer，加热煮沸5分钟，进行电泳。转膜，室温封闭I小时，一抗孵育(I 500)2小时，磷酸缓冲液洗涤3次，10分钟/次；二抗孵育(I 1000) I小时，磷酸缓冲液洗涤3次，10分钟/次；TAB显色。进行光密度扫描。
结果显示如图10C，骨癌痛组大鼠比对照组大鼠D-氨基酸氧化酶蛋白表达水平显著降低。上述结果表明，骨癌疼痛造成脊髓胶质细胞活化，同时下调脊髓DAO基因和蛋白表达。此结果与前期研究结果相反，后者证明脊髓神经结扎可引起神经源性疼痛，并上调D-氣基酸氧化酶水平(Zhao et al.，2010)。实施例10皮下注射CBIO对大鼠骨癌痛模型的抑制作用
选取造模成功的骨癌痛大鼠，分7组生理盐水(10ml/kg)，l，3，10，30，100mg/kg CBIO剂量组(n = 5-6),吗啡组(n = 3)。皮下给药,检测给药前及给药后0. 5,I，2，4小时时间点的机械性痛阈的变化。检测的机械性痛阈呈明显的量效关系和时效关系。
实验结果如图11所示，皮下注射CBIO不影响大鼠正常肢体机械性痛觉阈值(图11A)，但抑制患侧足机械性痛觉阈值，I小时时达到最高峰，2小时时镇痛作用降低，4小时时机械性痛阈降低至初始值范围(图11B);并且CBIO呈剂量依赖式抑制骨癌痛痛觉超敏，最大抑制率Emax为45. 5%, ED50为8mg/kg(图11C)。实施例11脊髓注射CBIO对大鼠骨癌痛模型的抑制作用
选取造模成功的骨癌痛大鼠，分4组生理盐水(IOiil/大鼠)，l，3，10iig/大鼠CBIO剂量组(n = 6)。脊髓给药，检测给药前及给药后0. 5，1，2，4小时时间点的机械性痛阈的变化。[10]如图12所示，鞘内注射CBIO不影响大鼠正常肢体机械性痛觉阈值(图12A)，但抑制患侧足机械性痛觉阈值，0. 5小时时，CBIO已发挥作用，I小时时达到最高峰，2小时时镇痛作用降低，4小时时机械性痛阈降低至初始值范围(图12B);并且CBIO镇痛作用呈剂量依赖式，Emax和
[11]专利申请公开(WO 2005/089753A2 ；US 2005/0143434A1)描述了 CBIO 的化学结构，专利申请公开US 2005/0143434A1同时披露了 D-氨基酸氧化酶抑制剂治疗神经源性疼痛，但未提供具体实施例。但出乎意料之外我们证明给予全身或脊髓给予CBIO对福尔马林慢性疼痛和肿瘤疼痛有效(最大抑制率达45-65%)，但对神经源性疼痛治疗无效(见实施例 7)。福尔马林慢性疼痛(Coderre et al. Pain 54 :43-50,1993 ;Jett etal. Pain69 :161-169,1997)，神经源性疼痛(Jett et al. Pain 69 :161-169，1997)和肿瘤疼痛(Yanagisawa et al. Mol Pain 2010 ;6 :38_50，2010)都涉及到中枢敏感化，但 CBIO对慢性疼痛和肿瘤疼痛与神经源性疼痛具有不同作用难以用此机制解释，但可能与我们发现神经源性疼痛能诱导脊髓DAO表达升高(Zhao et al. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332 248-254，2010)，而肿瘤疼痛模型中脊髓DAO表达降低有关。[12]本发明已通过各个具体实施例作了举例说明。但是，本领域普通技术人员能够理解，本发明并不限于各个
，普通技术人员在本发明的范围内可以作出各种改动或变型，而仍不背离本发明的精神和范围。这样的改动和变型均在本发明的范围之内。

1.一种预防和/或逆转阿片耐受的方法，其包括向有此需要的对象施用有效量的D-氨基酸氧化酶抑制剂。
2.权利要求I的方法，其中所述方法用于预防和/或治疗因阿片耐受使得其治疗功效降低的病症。
3.权利要求2的方法，其中所述病症是疼痛，包括但不限于急性和/或慢性疼痛，尤其是慢性疼痛，例如癌症疼痛。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8, Compound 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述对象表现出对选自以下一种或多种阿片类物质的耐受阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、 二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻 丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替唳、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替唆、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替啶、丙氧芬、舒芬太尼、替利定和曲马多。
6.前述权利要求任一项的方法，其中在施用阿片类物质之前、同时或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。
7.一种预防和/或治疗疼痛的方法，其包括向有此需要的对象分开和/或一起施用阿片类物质和D-氨基酸氧化酶抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中在施用阿片类物质之前、同时和/或之后施用所述D-氨基酸氧化酶抑制剂。
9.权利要求7或8的方法，其中所述阿片类物质选自以下一种或多种阿芬太尼、烯丙罗定、阿法罗定、阿尼利定、苄吗啡、苯腈米特、丁丙诺啡、布托啡诺、氯尼他秦、可待因、去氧吗啡、右吗拉米、地佐辛、地恩丙胺、diamorphone、二氢可待因、二氢吗啡、地美沙多、美沙醇、甲嗯丁胺、吗苯丁酯、哌美散痛、依他佐辛、依索庚嗪、乙甲噻丁、乙基吗啡、乙氧硝唑、埃托啡、双氢埃托啡、芬太尼及衍生物，二氢可待因酮、氢吗啡酮、羟哌替唆、异美沙酮、凯托米酮、左啡烷、左芬啡烷、罗芬太尼、哌替啶、美普他酚、美他佐辛、美沙酮、氢甲吗啡酮、吗啡、麦罗啡、narceine、尼可吗啡、羟啡烷、去甲美沙酮、烯丙吗啡、纳布啡、去甲吗啡、诺匹哌酮、阿片、羟可待酮、羟吗啡酮、阿片金碱、喷他佐辛、苯吗庚酮、羟苯乙吗喃、非那佐辛、苯哌利定、匹米诺定、氰苯双哌酰胺、propheptazine、三甲利定、异丙哌替唳、丙氧芬、舒芬太尼、替利定、曲马多以及它们的任意混合物。
10.权利要求7-9中任一项的方法，其中所述D-氨基酸氧化酶抑制剂选自以下一种或多种CBIO、Compound 8, Compound 2、AS057278、苯甲酸钠及其衍生物。
11 权利要求7-10中任一项的方法，其中所述疼痛