专利名称：基于奶的预防性饮食添加剂的制作方法图1，图形显示纵轴为糖尿病发病率(1.0＝100％)结果。对照饮食是“Prosobee”(TM)，它是一种大豆制品，在实验室中用作大鼠的食物。在对照鼠群中自发性糖尿病发病率是约38％。喂“Prosobee”(TM)加上10％混合酪蛋白(即A1和A2)的大鼠发病率约27％。喂“Prosobee”(TM)加上10％A1型酪蛋白的大鼠发病率约20％。根据WO96/14577的说明，A1组糖尿病发病率比对照组高。如果A2酪蛋白(或其粉碎产品)单纯是“中性”物质，那么A2组的糖尿病发生率约和对照组相同，因为不存在β-酪蛋白吗啡肽7的不良作用。事实上A2组的糖尿病发病率显著下降，而且是各组中最低的。因此，本发明人提出，β-酪蛋白吗啡肽9对I型糖尿病的发病率具有有益作用。猜想它起到了免疫调节剂的作用。一种动物的奶的酪蛋白片段对至少是人类和易感性实验啮齿类动物胰脏β-胰岛细胞的抗体具有作用，这种作用的机制不知道，但观察到酪蛋白参与了细胞结构以及小肽(如酪蛋白吗啡肽)可能起到了胞内信使的作用。实验2比较正常(SWR/J)小鼠和NOD(糖尿病易感)小鼠的结果，研究了衍生自β-酪蛋白的两种肽的作用。这两种肽是β-酪蛋白吗啡肽-7，它是A1β-酪蛋白，而不是A2变体的酶消化产物；或β-酪蛋白吗啡肽-9，它是A2β-酪蛋白，而不是A1变体的消化产物。从断奶开始，雌性30日龄小鼠就用无奶蛋白的饮食喂养。每组10只动物。第30日，用10毫克以佐剂(弗氏完全佐剂)配制的卵清蛋白和1毫克一种或另一种肽注射动物。接下来的10日中，每日重复注射肽。在7和11日从动物采血，分析抗卵清蛋白的IgG和IgM抗体。结果NOD小鼠的特征是7日时与对照动物比较IgM和IgG应答较低。就IgM而言这持续到11日，但IgG不这样。对卵清蛋白的平均免疫球蛋白应答7日时正常小鼠，不论给予β-酪蛋白吗啡肽-7或9都比盐水处理对照小鼠高，而11日时不这样。(表1)表1正常小鼠盐水对照的平均δOD 两种肽都加速早期免疫应答，β-酪蛋白吗啡肽-9可能比β-酪蛋白吗啡肽-7效果更强。另一方面，抗体应答的这种早期肽强化作用在7日时的NOD小鼠中未见，仅在11日看到BCM的IgG应答(表2)。表2NOD小鼠盐水对照的平均δOD 这些实验确定糖尿病模型(NOD小鼠)对胃肠道外给予抗原的早期抗体应答有缺陷，这种缺陷不能被任何一种奶肽所纠正。然而，SWR/J动物中，β-酪蛋白吗啡肽-9对于IgG水平的早期刺激作用比NOD小鼠中更好的保留。能产生β-酪蛋白吗啡肽-9的奶可能改善这种早期抗体应答缺陷(NOD/SWR/J比＝0.36)，优于产生β-酪蛋白吗啡肽-7的奶(NOD/SWR/J比＝0.05)。β-酪蛋白吗啡肽-9的这种轻微“进步”可能反映了糖尿病的致病机制。当然这些实验是基于注射的，而不是小肠接触的抗原。
实验3图2总结了该实验的结果回顾性调查信息，寻找一些选定的疾病的发病率与人群中每人饮奶量之间的关系，更具体的，与每人摄取A1β-酪蛋白量的关系。采用某国家内各品种奶用牛的A1β-酪蛋白比例和各国奶品科学文献中组成各品种的国内牧群比例计算出该数据。从FAO网址获得了奶蛋白的消耗量。糖尿病的发病率数据限于白人人群，以减少I型糖尿病中由于人种的遗传差异产生的混淆。哮喘流行率的数据是基于“喘鸣12个月流行”(如儿童哮喘和过敏症国际研究会发表的)。从1990年左右的癌症登记数据获得了多发性骨髓瘤的发病率数据。该实验是一种生态学研究，将会有所有伴随的限制。我们发现在整个国家(1980年左右)人均食物供应中的A1酪蛋白与下列显著相关的(1)同时期儿童糖尿病的发病率，(2)1990年成人局部缺血性心脏病死亡率，(3)1990年男性和女性多发性骨髓瘤的发病率，以及这些疾病的发病率也彼此相关(可能骨髓瘤的生物学基础与A1奶β-酪蛋白吗啡肽7抑制淋巴细胞相关)。尽管发现了一些统计学上显著的关联，这并不证明是原因，虽然增加了可能性。而且，必须解释所有奶和A1β-酪蛋白之间的相关性对于1型(IDDM)糖尿病和局部缺血性心脏病((CHD))的改变值和显著性。我们还注意到如果将β酪蛋白B与A1一起加到食物中时，这种相关性变弱。该研究加上两次动物实验支持了本发明对奶或奶制品能赋予健康性能的权利要求，这些奶或奶制品含有很低的或不含A1型β-酪蛋白，甚至没有组I添加剂的特别的赋予健康的性能。
实施本发明的最佳方法本发明提出了由占优势的A2型酪蛋白等组成的各种奶组合。实施例A是一种强化的饮食添加剂，它包括有效量的添加的叶酸，以及B6和钴胺素，已知它们对tHcy起作用；添加剂根据普通奶添加。实施例B为“受控制的酪蛋白组合物”。预计如果对血管壁和已知的或未怀疑糖尿病或高胱氨酸血症的病人在病理生理学作用水平上不能实际协同，(A)和(B)的组合(实施例C)将显示额外的效果。可治愈这些疾病。
实施例A通常只用于最大程度减少除了糖尿病外的其他疾病，本文称为“VaD”的影响。在这些情况下，本发明受控制的酪蛋白实施例(B)至少没有不良作用，而且可能实际上降低了危险个体中糖尿病的发生。注意，在患有血管病的病人中“未怀疑的糖尿病”的发病率惊人的高。
说明性实施例(A)该实施例描述了用有效量的选自三甲基甘氨醛、钴胺素、叶酸和维生素B6的至少一种化合物强化商业化生产的奶，来降低tHcy。根据已知的“推荐每日量”(RDA)和关于tHcy的文献，以及典型消费者每日可能饮用的强化奶或奶制品量确定了这些强化物质的优选用量(加入的物质的LD50系数高)。相关的“数量确定”文献包括(A)Lobo等(1999)，Ohio发现每日1毫克叶酸(与B6和钴胺素联用)对降低tHcy不比400微克更好，(95位平均年龄为61岁的病人)，(B)为了降低北爱尔兰年轻人的tHcy，Ward等(1997)发现400微克不比200微克更好，但是200比100微克更有效(30个志愿者，经过26周)，(C)Br?nstrup等(1998)在年轻德国妇女中发现400微克叶酸和钴胺素(6或400微克)对于tHcy水平明显比单独用叶酸更有效。另外，为了避免神经管缺陷，叶酸的推荐每日用量是每日约400微克。人们可总结出叶酸的有效添加剂量大约是每日400微克，但这些实验用的是普通人，而没有涉及其他完全无叶酸的环境。所以我们推荐每日摄取300-500微克叶酸是适合成年人的每日剂量(如果含有一种加入的化合物)。假定每日饮用400毫升奶，这相当于每毫升奶约1微克叶酸或其等价物。
对于确定钴胺素量的优选范围(不论是否是加入一种化合物)能得到的证据不太清除。现在我们推荐每日4-7微克。5微克相应于每毫升0.012微克钴胺素(假定接受者没有吸收缺陷)。类似的，吡哆素的优选范围是每日1.5-4毫克。每日400毫升奶内的2毫克相应于每毫升牛耳内5微克吡哆素或其等价物。
还已知三甲基甘氨醛能降低tHcy。优选有效的日摄取量高达每日1克；更优选每日约100毫克，优选和其他指定的化合物一起被服用。所有这些组分的类似物是药物领域熟知的，而且可规定相应的有效量。优选上述化合物的两种或多种的混合物，因为有证据显示效力增加(例如见Br?nstrup等(1998))，而且对于每一种，假定量与它们分别使用的量相同。注意如果施用叶酸，应摄取与平均每日需要(5微克)相似量的钴胺素。当以上述剂量给予钴胺素可能不足的个体(如老年人，具有吸收缺陷)时，该量将防止叶酸的不良作用(如对于大脑功能)。
优选在制备能服用或进一步制造奶制品之前通过本领域技术人员熟悉的测量线路进料方法加入这些维生素强化剂。虽然钴胺素和B6可被光降解，它们对热的敏感性不显著，在常规的巴氏消毒法中将保存下来。事实上，它们将在广泛的加工(如干燥)中保存下来。优选在服用前用本领域技术人员熟悉的方法分析这些奶/奶制品，证实维生素添加物。这种强化的液态奶可以是任何奶的商品形式，但不限于脱脂奶、超加热处理奶或巴氏灭菌消毒的奶。本发明方法还可应用于前述的“奶制品”。
在人群中广泛采纳这种“自己施用”方法以降低tHcy的一个障碍是一些人由于过敏性反应等原因不能喝奶(或食用奶制品)，一些社区由于文化、得不到或宗教原因不喝奶。因此本发明提议提供给这些人或社区几种强化液体的选择，这些液体是常常代替奶饮用的。因此本发明还包括(1)强化的豆奶等，(2)“茶/咖啡添加剂”，可能是水或一种强化的甜味剂，(3)一种强化的碳酸饮料和(4)瓶装强化饮用水，各含有至少一种选自组I的化合物；优选至少是叶酸和钴胺素，具有给予大多数使用者足够的每日剂量的浓度。
说明性实施例(B)本发明的该方面在预防VaD上采用有关预防1型和2型糖尿病的信息补充了实施例A的说明，提供基本没有这些蛋白质(酪蛋白)的牛奶或奶制品，这些蛋白质在受体哺乳动物(包括人)肠内消化后，能产生β-酪氨酸吗啡肽-7或其他更长的含有β-酪氨酸吗啡肽-7序列的肽。这可通过以下步骤完成a)选择仅产生A2变体β酪蛋白的牛来提供这种奶-这些奶在肠消化后不产生β-酪蛋白吗啡肽-7或相关的肽。现存的牛产生混合形式的A1、A2或B酪蛋白，反映了表达的蛋白质是几种共显性基因存在的结果，并可选择奶业领域中熟知的方法用于(1)选择性饲养只提供A2酪蛋白的动物(公牛的选择是通过人工授精，实现迅速改变牛群基因组成的一条捷径)(2)从杂交牛群中挑选出纯合表达A2的动物，提供了对产品的质量保证。
b)(任选)用物理、化学或酶方法除去奶中所有的或基本上所有的β-酪蛋白，或仅除去A1和B型β-酪蛋白，留下A2酪蛋白。
c)(任选的)遗传上改变奶来源的牛，从而在消化后不产生β-酪蛋白吗啡肽-7或相关的肽。这些遗传改变可完全除去特定的或全部β-酪蛋白的基因序列。
选择产生所需奶的牛涉及通过测定个体奶样品中的各种β-酪蛋白对牛作鉴定，和仅用产生A2β-酪蛋白的牛。可用凝胶电泳或其他本领域技术人员熟悉的方法鉴定β-酪蛋白变体。
我们相信本发明可用下列发现作理论解释。
第一部分可能触发糖尿病的饮食性环境因素的性质先前的研究已显示饮用液体奶的量和1型糖尿病(Scott等)之间具有流行病学上的关联，该关联的可能原因可进一步分摊到奶的A1和B型β-酪蛋白成分(Elliott等，1999，Laugesen等(未发表))。不知道其他奶蛋白是否与糖尿病相关。特别是，β-酪蛋白的A2变体似乎是无害的。其他研究显示至少在一些人群中1型糖尿病与高水平的抗A1抗体之间有关联，但与A2β-酪蛋白无关(Elliott等，1999)。
Virtanen等(2000)已显示，当考虑糖尿病的遗传倾向性时，发生糖尿病的儿童比不发生糖尿病的儿童喝更多奶。具有对糖尿病的遗传倾向性但在婴儿时期食用不含牛奶的饮食的婴儿，比食用牛奶的婴儿较不可能产生影响体内胰岛素生成细胞的早期疾病症状(Akerblorn等，1999)。Bennett等显示早期饮用牛奶和2型糖尿病之间的关联。因此，在人类中，饮用奶看来是引发两种糖尿病的环境触发因素，而且至少在1型糖尿病中这似乎与奶中的A1和Bβ-酪蛋白成分有关-但与A2β-酪蛋白无关。
A1和Bβ-酪蛋白通过肠内消化酶消化后产生β-酪蛋白吗啡肽-7，而A2β-酪蛋白不产生。β-酪蛋白吗啡肽-7在动物(包括人)中对于肠迁移时间具有阿片样作用，而且对人肠淋巴细胞还具有免疫抑制作用(Elitsur 1992)。这种阿片样作用可恶化对1型和2型糖尿病的遗传易感性。
第二部分冠心病与糖尿病的(已知)关系。1型和2型糖尿病使冠心病的危险增加了5-10倍。见图2。在一些社区，40岁以上的成年人中有10％以上存在2型糖尿病，在这些社区中，糖尿病是冠心病的主要原因。1型糖尿病对人群的冠心病发生率作用较小。糖尿病(两种类型)发病率在全世界急剧增加。
第三部分冠心病与饮用液体奶，特别是含有β-酪蛋白A1和B变体的奶的关系。上述(见图2)的几种流行病学研究显示，饮用液态奶和冠心病死亡率之间有关联，这似乎是由于奶的蛋白质成分而不是脂肪成分。如可预期的那样，鉴于糖尿病与心脏病的关联，饮用A1β-酪蛋白看来与冠心病死亡率的关系比牛奶中任何其他成分更加密切。
第四部分是否在tHcy和糖尿病之间存在着实际联系？Hoogeveen(2000)报道了tHcy与5-年死亡率的关系，与其他主要危险因素无关，而且与非糖尿病病人相比，tHcy看来是2型糖尿病病人死亡率的更强的危险因素(1.9倍)。
第五部分tHcy升高与心血管病死亡率升高之间的关系。本说明书的综述文献使人们得出结论降低高tHcy的最有效的方法可能是提供所有三种维生素和三甲基甘氨醛。导致VaD危险降低可能是通过减少血管阻力和溶血趋势的机制起作用。这种添加剂(特别是叶酸)的另一有用结果(虽然无关)是减少了神经管闭合缺陷脊柱裂和相关缺陷的发生，如果这些维生素添加剂在早孕期间饮用的话。
第六部分可能的免疫学机制。酪蛋白的一种特定肽β-酪蛋白吗啡肽9似乎由于其免疫学性质是有益的，而A1和B型β-酪蛋白的β-酪蛋白吗啡肽7似乎是一些奶的有害成分。酪蛋白吗啡肽的一种特征是改变脯氨酸残基将“保护”毗邻的肽键不受内切肽酶的攻击。酪蛋白碰巧含有重复交替的脯氨酸-X残基序列。仅有一条保留的序列-在残基60-68，虽然另一条pro-tyr-pro-glu序列在残基180。另一种解释是根据以下发现β-酪蛋白吗啡肽9与牛β-酪蛋白A2的氨基酸残基号60-68匹配(见图3)。该肽的组合物赋予了对用内肽酶切割作进一步消化的抗性。该肽在消化含有该酪蛋白变体的奶过程中被释放入小肠内。
据信β-酪蛋白吗啡肽-9具有免疫保护作用或至少一种免疫调节作用，这些作用与I型糖尿病有关，饮用含有β-酪蛋白A2的奶(基本上无β-酪蛋白A1和β-酪蛋白B)结果将导致糖尿病发病率降低到对照人群的发病率以下。现在将描述一些为了显示β-酪蛋白吗啡肽9免疫学活性的实验。
说明实施例(A)+(B)其他强化饮食添加剂的例子包括1.一种液态奶，含有A2型酪蛋白组合物；基本没有A1型或B型酪蛋白，还加入了组I的化合物(见定义)。优选至少加入两种化合物，利用相互作用，而每日摄取的优选量是可接受的人每日需要量，即约400微克叶酸、5微克钴胺素和2微克B6。假定奶的平均每日饮用量是400毫升，每100毫升A2型酪蛋白但没有A1型酪蛋白的奶以100微克叶酸、1.25微克钴胺素、和0.5毫克B6浓度补充了该摄取。注意，我们知道特别的病例，如吸收少需要额外钴胺素补偿的老年人。对于这些特别的病例，可提供具有额外的钴胺素或内在因子的特别强化的奶制品。可对其他成分进行调节。
2.提供了一种添加了叶酸或其类似物的小麦面粉。可加入能降低tHcy的其他物质；然而，以这种方式提供钴胺素可能是浪费。一些人不能食用小麦面粉或至少对谷蛋白耐受。
3.一种代替品(对于确保可靠每日摄取的目标)是一种含有本发明的额外化合物的强化早餐谷物，以提供上述的每日摄取，与合适保存A2-酪蛋白奶的容器一起作为“药盒部件”一起出售。这可能包含在小袋中的一定量的“UHT”或其他保存期长的奶，可联合出售或分散为一次谷物或对应奶的“现成”早餐量。
4.用A2型酪蛋白奶制备的强化冰淇淋、酸奶等。
5.其他食品，其种类并显然不是由奶品制成，但含有酪蛋白。
6.婴儿奶，适用于甚至非常年幼的婴儿，可以强化到较低程度，用A2型酪蛋白奶制备。
7.为年轻人可接受而设计的奶制品，用维生素强化，用A2型酪蛋白奶制备(未察觉其已怀孕的有脊柱裂损伤危险的年轻女性-这常常发生在胚胎发育的早期)。年轻人中不会不知道动脉病变。
8.所有可食用奶为基础的产品的任何一种，如奶粉、奶巧克力、奶酪等，用本发明的化合物强化，用A2型酪蛋白奶制备。
水、小麦面粉、奶似乎是一般西方饮食的三种最可预测的成分。谷物常常是标准的早餐。所以我们选择这些组分，因此无需特别努力(不需要记得服药丸等)就能达到充分的每日摄取。最可能的是本说明书中建议的各种产品将作为“有益于心脏的”或其他代用品提供销售。
天然叶酸的热稳定性不好，但人造的叶酸或组合将能耐受巴氏消毒(例如，损失很少)。奶中钴胺素(和B6)的光稳定性不好。所以本发明的任何产品应优选避光保存。
这种预防性治疗法的原理是联合除去在牛奶中发现的，涉及糖尿病和冠心病二者的饮食因素和强化的奶和奶制品，使其无不良饮食因素，并联用B簇维生素和/或三甲基甘氨醛，它们能降低tHcy。本领域技术人员已知生产各种性质的这种奶及其产品的方法，但将这些性质与防止闭塞性血管疾病的意图联合起来则是本发明特有的。
为了应用本发明，可探索许多途径。例如……1.在产生β-酪蛋白A2，基本上不产生β-酪蛋白A1和β-酪蛋白B的奶用动物的品种或品系(例如Bos indicus亚种，和冰岛现存的奶牛、山羊或甚至人，其中采用人奶可避免接触某些种类的牛奶或其产品，特别是在产后生活的早期)的奶品工业中的用途。
2.用本领域已知的一些或所有的选择方法从各品种或品系的奶用动物的杂交种群中选择产生β-酪蛋白A2，而基本上不产生β-酪蛋白A1、A1A2或B的动物。例如，奶牛可进行牧群测试，来测试分泌的酪蛋白变体，并排斥那些产生A2变体以外的奶牛。考虑作为AI公畜的公牛将用基因工程方法直接测试，或如上所述测试其原始子代的女儿(优选来自A2型母畜的)。
3.至少，已知怀疑患有I型糖尿病的个体应饮用只产生β-酪蛋白A2，基本上不产生β-酪蛋白A1或B的奶用动物品种或品系的奶制品。
4.口服含有β-酪蛋白吗啡肽9和不论是否奶用型的食品。可通过重组方法从酪蛋白制备β-酪蛋白吗啡肽9，或可以合成。
5.可以以缓释制剂给药，从而促进或增强β-酪蛋白吗啡肽9的免疫应答。
6.给予“辅助材料”，它可以包含(a)增强从蛋白质上酶切β-酪蛋白吗啡肽的物质，(b)有助于将β-酪蛋白吗啡肽9至少携带入小肠固有层的物质(c)增强体内免疫活性的细胞对β-酪蛋白吗啡肽9的应答反应的物质。
7.可使任何一种上述策略，但也可使用改进的肽等，它们在赋予对I型糖尿病抵抗方面比β-酪蛋白吗啡肽9拥有更强的能力。(虽然β-酪蛋白吗啡肽9是具有理想活性的天然存在的肽，但进一步研究可能得到活性更大，副作用更小的物质)。
商业利益或优点由于心脏和其他血管疾病的发病率，和可靠诊断糖尿病的困难，以及许多人关于叶酸摄取需求的不足状态，很明显本发明能够节约许多与这些广泛传播的疾病、糖尿病和VaD有关的机构(治疗)的花费和个人花费，而几乎没有不便和成本或制造的很大困难。
为了方便，本发明可作为奶的代用类型销售，也许称为“心脏奶”，像普通奶一样使用，并优选作为完全的替代品，从而可确保每日剂量。添加剂对加热足够稳定，能保存下来，用于茶或咖啡中。另外，本发明还包括一些以下特别的益处(1)至少可降低I型糖尿病的人群发病率。这将避免许多人受苦，而且在新西兰(人口3,800,000)能为每个患者一生节约大约1,000,000美元。
(2)对II型糖尿病可得的信息较少，但是对于病人的益处将由于tHcy的降低而积累。
(3)VaD降低表现为心脏病死亡率、中风发病率和死亡率、因周围性血管疾病而截肢、肾脏移植等减少。
(4)该产品提供了足够的每日叶酸量以防止神经管缺陷，如果作为一种奶被所有育龄妇女接受，使用该产品将消除人群中的该问题。
(5)接受酪蛋白变体的作用将通过根据合理的前题选择，建立起改进的国家牧群。
(6)可改善人群的健康，而不需要实际的药物。
最后，应理解在本说明书中所述的和/或说明的本发明的范围不限于本文为了说明目的所述的优选例。本领域技术人员将会理解在不违背本发明权利要求列出的本发明的范围和精神的情况下，可能有许多改变、添加和替换。
在糖尿病、血管性疾病(CHD、CVA、PVD)和一些癌症的危险和发病率很高的许多社区中,奶被普遍而广泛的饮用。死亡是系统性血管壁损伤的常见结果,这是由于糖尿病中的高糖水平和血浆高胱氨酸水平引起的,这影响到大部分人群,并且是血管性疾病的一个主要危险因素。糖尿病也相似的分布广泛。鉴于(1)奶的广泛传播和常规摄取,(2)通过治疗潜在的叶酸(和其他维生素)不足,有可能控制tHcy,(3)有机会简单的控制神经管缺陷和(4)假定糖尿病和A1型和B型酪蛋白摄取之间有因果关系,本发明通过提供给人群一种改良的奶或奶制品而纠正,该奶或奶制品包括(1)用钴胺素、吡哆素、叶酸和三甲基甘氨醛而强化,和(2)基本上仅含A2型酪蛋白组分。另外,利用β－酪蛋白吗啡肽9(一种A2 β－酪蛋白的肽消化片段)的免疫学性质可帮助控制糖尿病。实用的和便利的该强化的饮食包括处理过的筛选过的奶和食品,包括奶的衍生物,和筛选过的奶和处理过的谷物。
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